吳碧娟,姜志輝，孫婧雯，譚翠雯，范俁琳，丁曉艷，上官信一，吳新榮

(1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科-廣州市老年慢病患者合理用藥重點實驗室，廣東 廣州 510010;2.南方醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東 廣州 510515)

魚藤素對SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡的誘導(dǎo)作用

吳碧娟1,2,姜志輝2，孫婧雯1，譚翠雯1，范俁琳1，丁曉艷1，上官信一1，吳新榮1

(1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科-廣州市老年慢病患者合理用藥重點實驗室，廣東 廣州 510010;2.南方醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東 廣州 510515)

目的 研究魚藤素對SH-SY5Y細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。方法 魚藤素(0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1)處理SH-SY5Y細胞24、48、72 h后，CCK-8法測定細胞存活率。魚藤素(0、8、20、50 μmol·L-1)處理SH-SY5Y細胞24 h，光鏡下及AO/EB雙染分別觀察細胞形態(tài)和凋亡形態(tài)，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，DCFH-DA熒光探針法檢測細胞活性氧水平，分光光度法檢測caspase-3活化程度。結(jié)果 魚藤素對SH-SY5Y細胞存活率呈時間和濃度依賴性抑制作用，作用24、48、72 h的IC50值分別為(26.07±2.18)、(18.33±0.94)、(12.5±1.49) μmol·L-1。魚藤素處理24 h后，細胞凋亡率、細胞活性氧水平明顯上升(P<0.05)，caspase-3活化程度升高，且三者均有濃度-效應(yīng)特征。結(jié)論 魚藤素可抑制SH-SY5Y細胞存活，誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與升高活性氧水平和活化caspase-3相關(guān)。

魚藤素；SH-SY5Y細胞；凋亡；活性氧；caspase-3；神經(jīng)毒性

魚藤素是一種具有強抗腫瘤活性的黃酮類天然化合物，多項體內(nèi)外研究表明魚藤素的抗瘤譜較廣，可抑制口腔癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、頭頸癌、食管癌等多種實體瘤增殖[1-8]。魚藤素的抗腫瘤靶點極為廣泛，作為一種極具潛力的抗腫瘤藥物，有望提供新化療方法，改善當(dāng)前腫瘤化療耐藥的情況[9]。目前，魚藤素的應(yīng)用主要受限于其帕金森樣神經(jīng)毒性，研究發(fā)現(xiàn)，6 mg·kg-1的魚藤素持續(xù)給藥可引起小鼠腦部帕金森樣綜合征[10]。當(dāng)前針對魚藤素神經(jīng)毒性的研究報道較少,為進一步研究魚藤素的神經(jīng)毒性，本研究采用SH-SY5Y神經(jīng)瘤細胞為模型，研究魚藤素對神經(jīng)細胞凋亡的誘導(dǎo)作用，進一步了解魚藤素的神經(jīng)毒性。

1 材料

1.1 細胞株 人神經(jīng)瘤細胞株SH-SY5Y(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科提供)。

1.2 藥物 魚藤素(deguelin，批號：045M4736V)、二甲基亞砜(DMSO，批號：RNBD6895)、Accutase solution(批號：SLBN5790V),均為Sigma公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：20151225；RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco公司，批號：8116053；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑，日本同仁公司，批號：JU739；吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染試劑盒，索萊寶公司，批號：20160111；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，批號：C1065-2；活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒(批號：S0033-1)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0006-1)，均為碧云天公司；caspase-3分光光度法檢測試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：20160406。

1.3 儀器 Multiscan-GO全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；IX7型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

2 方法

2.1 藥物配制 將魚藤素溶于少量DMSO，配制成10 mmol·L-1母液，分裝并于-20℃冰箱避光保存。使用時，用培養(yǎng)基將母液稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 細胞培養(yǎng) SH-SY5Y細胞用含10%胎牛血清和100 kU·L-1青霉素、100 kU·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.3 CCK-8法檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)節(jié)細胞密度至5×107·L-1，將細胞接種于96孔板，每孔100 μL，24 h后加入100 μL不同濃度的魚藤素(終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1)，以溶劑DMSO為對照組，另設(shè)空白組，每組3個復(fù)孔，分別作用24、48、72 h后，吸去舊培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基與CCK-8試劑按10 ∶1比例混勻，每孔加入110 μL混合后試劑，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm處測定吸光度。計算細胞存活率/%=[(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。

2.4 光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài) 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)節(jié)細胞密度至5×107·L-1，將細胞接種于6孔板，每孔2 mL，24 h后加入2 mL不同濃度的魚藤素(終濃度分別為0、8、20、50 μmol·L-1)，作用24 h后，于光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

2.5 AO/EB雙染觀察細胞凋亡形態(tài) 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)節(jié)細胞密度至5×107·L-1，將細胞接種于6孔板，每孔2 mL，24 h后加入2 mL不同濃度的魚藤素(終濃度分別為0、8、20、50 μmol·L-1)，24 h后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入1 mL新的PBS，將AO溶液和EB溶液按1 ∶1混合成工作液，每孔加入20 μL工作液，室溫放置5 min后，于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)。

2.6 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)節(jié)細胞密度至5×107·L-1，將細胞接種于6孔板，每孔2 mL，24 h后加入2 mL不同濃度的魚藤素(終濃度分別為0、8、20、50 μmol·L-1)處理，24 h后收集細胞，PBS洗2次，將細胞重懸于195 μL結(jié)合液中，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后加入10 μL PI，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.7 流式細胞儀檢測ROS 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)節(jié)細胞密度至5×107·L-1，將細胞接種于6孔板，每孔2 mL，24 h后加入2 mL不同濃度的魚藤素(終濃度分別為0、8、20、50 μmol·L-1)處理，24 h后收集細胞，以終濃度為10 μmol·L-1的DCFH-DA重懸各組細胞，37℃避光孵育20 min，期間每隔5 min震蕩1次。離心棄上清，PBS洗2次，上流式細胞儀檢測熒光強度以反映細胞ROS水平。

2.8 分光光度法檢測caspase-3活化程度 取對數(shù)生長期細胞，分別加入不同濃度魚藤素(終濃度分別為0、8、20、50 μmol·L-1)處理；24 h后收集細胞，加入50 μL冰冷Lysis Buffer(每50 μL Lysis Buffer加入0.5 μL DTT)；冰上裂解30 min，每隔10 min渦旋振蕩10 s；4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；將離心上清液移至新離心管，置冰上；測定蛋白濃度；吸取50 μL含100 μg蛋白的細胞裂解上清，如體積不足50 μL，加入Lysis Buffer補齊至50 μL；加入50 μL的2×Reaction Buffer(每50 μL 2×Reaction Buffer加入0.5 μL DTT)；加入5 μL caspase-3底物；37 ℃避光孵育4 h；用酶標(biāo)儀在λ=405 nm處測定其吸光值。通過計算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對照的倍數(shù)，確定凋亡誘導(dǎo)劑組caspase-3活化程度。

3 結(jié)果

3.1 CCK-8法檢測細胞存活率 如Fig 1所示，隨著魚藤素給藥濃度升高，SH-SY5Y細胞存活率降低，呈劑量依賴性，各組與對照組相比，差異有顯著性(P<0.01)，且同濃度的不同處理時間組間，細胞存活率差異也有顯著性，表現(xiàn)為隨著魚藤素處理時間延長，SH-SY5Y細胞存活率降低，呈時間依賴性。采用Calcusyn軟件計算魚藤素處理SH-SY5Y細胞24、48、72 h的IC50值分別為(26.07±2.18)、(18.33±0.94)、(12.5±1.49) μmol·L-1。

Fig 1 Effect of different concentrations of deguelin on cell viability of SH-SY5Y cells with different incubation time

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vs24 h group treated with equal concentration of deguelin;△P<0.05vs48 h group treated with equal concentration of deguelin

3.2 光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài) 光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細胞貼壁能力強，細胞形態(tài)較好，不同濃度魚藤素處理SH-SY5Y細胞24 h后，細胞數(shù)量較對照組明顯減少，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，隨著魚藤素濃度升高，細胞皺縮變圓，貼壁能力減弱。50 μmol·L-1魚藤素處理24 h后，部分細胞漂浮死亡(Fig 2)。

3.3 AO/EB雙染觀察細胞凋亡形態(tài) 對照組SH-SY5Y細胞呈多邊形，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，少見凋亡細胞。不同濃度魚藤素處理24 h后，早期凋亡細胞增多，細胞體積減小，細胞核固縮，致密濃染，部分細胞核染色呈新月狀。50 μmol·L-1魚藤素處理24 h后，晚期凋亡細胞增多，胞膜受損，細胞核被EB染成橘紅色，呈固縮狀致密濃染，且可見部分染橘紅色的細胞碎片(Fig 3)。

Fig 2 Morphological changes of SH-SY5Y cells after deguelin treatment for 24 h observed under optical microscope(×200)

A:Control; B,C and D: Deguelin 8, 20 and 50 μmol·L-1,respectively

Fig 3 Apoptotic morphology of SH-SY5Y cells after deguelin treatment for 24 h with AO/EB double staining(×200)

A:Control; B,C and D: Deguelin 8, 20 and 50 μmol·L-1，respectively

3.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率 Tab 1和Fig 4結(jié)果顯示，與對照組比較，經(jīng)8、20、50 μmol·L-1魚藤素處理24 h后，SH-SY5Y細胞總凋亡率明顯升高(P<0.05)，呈濃度依賴性升高(r=0.993，P<0.05)。其中，早期凋亡率也隨魚藤素的給藥濃度升高明顯升高(r=0.989，P<0.05)。

3.5 流式細胞儀檢測ROS Tab 2和Fig 5的結(jié)果表明，經(jīng)8、20、50 μmol·L-1魚藤素處理24 h后，與對照組相比，SH-SY5Y細胞ROS水平明顯升高(P<0.05)，且SH-SY5Y細胞ROS水平呈濃度依賴性升高(r=0.993，P<0.05)。

Tab 1 Apoptosis inducing effect of deguelin treatment for 24 h on SH-SY5Y cells(±s，n=3)

*P<0.05vscontrol group

Tab 2 Effect of deguelin treatment for 24 h on ROS of SH-SY5Y cells(±s，n=3)

*P<0.05vscontrol group

3.6 分光光度法測定caspase-3活化程度 如Tab 3所示，8 μmol·L-1魚藤素處理SH-SY5Y細胞24 h，caspase-3活性略有升高，但與對照組相比差異無顯著性，魚藤素濃度上升至20、50 μmol·L-1，caspase-3活性升高，且與對照組相比差異有顯著性，結(jié)果表明caspase-3活性隨魚藤素給藥濃度升高而升高。

Tab 3 Effect of deguelin treatment for 24 h on activation extent of caspase-3 in SH-SY5Y cells(±s，n=3)

*P<0.05vscontrol group

4 討論

SH-SY5Y源自人成神經(jīng)瘤細胞系SK-N-SH ,由于具有神經(jīng)元生化功能特征且易于培養(yǎng)，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制和藥物作用機制相關(guān)研究。本研究采用SH-SY5Y細胞為模型，使用CCK-8法檢測不同濃度魚藤素分別作用24、48、72 h，對SH-SY5Y細胞存活率的影響。結(jié)果顯示，魚藤素呈時間和濃度依賴性抑制SH-SY5Y細胞存活，隨著作用時間的延長和給藥濃度升高，細胞存活率降低。通過細胞形態(tài)觀察和AO/EB雙染觀察發(fā)現(xiàn)，魚藤素處理后，細胞皺縮變圓，呈現(xiàn)凋亡甚至壞死特征，說明魚藤素具有神經(jīng)毒性，與此前報道的魚藤素體內(nèi)帕金森樣神經(jīng)毒性相符合[10]。

Fig 4 Apoptosis inducing effect of deguelin treatment for 24 h on SH-SY5Y cells by flow cytometry

A:Control; B,C and D: Deguelin 8, 20 and 50 μmol·L-1, respectively. The fourth quadrant: early stage apoptotic cells; the first quadrant: late stage apoptotic cells

Fig 5 Effect of deguelin treatment for 24 h on ROS of SH-SY5Y cells measured by flow cytometry

為確定魚藤素對SH-SY5Y細胞凋亡的影響，采用流式細胞儀檢測魚藤素處理后細胞凋亡率。發(fā)現(xiàn)魚藤素處理后，SH-SY5Y細胞早期凋亡率和總凋亡率均明顯升高，呈濃度-效應(yīng)關(guān)系，表明魚藤素可通過誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制SH-SY5Y細胞增殖。

適當(dāng)水平的ROS對機體是有益的，但過量的ROS會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，可能作為第二信使影響凋亡，從而誘導(dǎo)細胞凋亡或壞死[11]。氧化應(yīng)激是帕金森病的主要病因之一[12]，研究發(fā)現(xiàn)[13]，魚藤素的同類化合物魚藤酮可通過抑制線粒體復(fù)合物I誘導(dǎo)帕金森病，線粒體復(fù)合物I受抑制后，增加ROS生成，ROS可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而形成惡性循環(huán)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)魚藤素作用下，細胞ROS水平明顯提高，且與細胞存活率具有良好負相關(guān)線性關(guān)系(r=0.993)。以上結(jié)果表明魚藤素可能通過提高ROS水平，誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡。

Caspase是一類與細胞凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，caspase級聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，其中caspase-3是caspase級聯(lián)反應(yīng)中下游的效應(yīng)蛋白酶[15]。本研究結(jié)果顯示，20 μmol·L-1魚藤素可明顯活化caspase-3，且活化程度隨魚藤素的給藥濃度升高而升高。

本研究證實魚藤素主要通過誘導(dǎo)細胞凋亡導(dǎo)致神經(jīng)毒性，其誘導(dǎo)凋亡機制與氧化應(yīng)激和活化caspase-3有關(guān)，進一步研究魚藤素神經(jīng)毒性及降低神經(jīng)毒性的方法對于魚藤素作為新型化療藥物的應(yīng)用極為關(guān)鍵。

(致謝:本實驗在廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科及實驗科完成，感謝各位同學(xué)的幫助，使實驗得以順利完成。)

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The apoptotic inducing effect of deguelin on SH-SY5Y cells

WU Bi-juan1,2,JIANG Zhi-hui2,SUN Jing-wen1,TAN Cui-wen1,FAN Yu-lin1,DING Xiao-yan1,SHANGGUAN Xin-yi1,WU Xin-rong1
(1.DeptofPharmacy,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand-GuangzhouKeyLaboratoryofRationalDrugUsefortheElderlywithChronicDisease,Guangzhou510010,China;2.GraduateSchoolofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Aim To study the apoptotic inducing effects of deguelin on SH-SY5Y cells.Methods SH-SY5Y cells were treated with 0,0.625,1.25,2.5,5,10 and 20 μmol·L-1deguelin for different time(24,48,72 h); cell viability was detected by CCK-8 assay. SH-SY5Y cells were treated with 0,8,20,50 μmol·L-1deguelin for 24 h; light microscope and AO/EB double stained method were employed for observing the morphology and apoptotic morphology of treated cells.Apoptotic rate of treated cells was determined by flow cytometry. Cells were stained by DCFH-DA, and the whole reactive oxygen species(ROS) was determined by flow cytometry. Spectrophotometry was employed to determine the activation degree of caspase-3.Results Deguelin inhibited cell growth in a time- and dose-dependent manner, and the IC50value of deguelin was (26.07±2.18),(18.33±0.94),(12.5±1.49) μmol·L-1when treated with 24,48,72 h respectively. After treated with 8,20,50 μmol·L-1deguelin for 24 h,cell apoptotic rate, ROS and activation rate of caspase-3 increased markedly(P<0.05), all of which performed a dose related effect. Conclusion Deguelin can inhibit SH-SY5Y cell proliferation and induce cell apoptosis, and the mechanism may be concerned with the elevated ROS and activated caspase-3.

deguelin; SH-SY5Y cell; apoptosis; ROS; caspase-3; neurotoxicity

2017-04-17,

2017-05-12

廣東省科技計劃項目(No 2011A080300004)；廣州市科技計劃項目(No 201509010012)

吳碧娟(1991-)，女，碩士，研究方向：抗腫瘤藥物藥理學(xué),E-mail：summerwbj@126.com； 吳新榮(1959-)，女，碩士，主任藥師，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥篩選及藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：gzwxrong@ yahoo．com

時間：2017-7-7 11:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.038.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.019

A

1001-1978(2017)08-1136-05

R329.25；R730.264；R979.9