任俊杰,王科科,許慧玉,黃婷娟,呂 怡,武冬梅,張軒萍,鄭曉俊

(山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院1.內科學教研室、2.藥學部，山西 太原 030001；3.山西醫(yī)科大學藥理學教研室，山西 太原 030001)

咪達唑侖對離體豬冠脈環(huán)舒張功能的影響及其機制研究

任俊杰1,3,王科科1,許慧玉3,黃婷娟1,呂 怡1,武冬梅3,張軒萍3,鄭曉俊2

(山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院1.內科學教研室、2.藥學部，山西 太原 030001；3.山西醫(yī)科大學藥理學教研室，山西 太原 030001)

目的 本實驗觀察咪達唑侖(midazolam)對離體豬冠狀動脈環(huán)的作用，并探討其作用機制。方法 采用離體血管張力測定實驗方法，記錄咪達唑侖對KCl(30 mmol·L-1)預收縮豬冠狀動脈環(huán)張力的變化及不同工具藥的影響。結果 各濃度組咪達唑侖(3×10-6～1×10-4mol·L-1)對預收縮豬冠脈環(huán)產生濃度依賴性舒張作用，內皮完整組舒張作用強于去內皮組(P<0.05)；在KCl預收縮基礎上，加入NOS抑制劑L-NAME、L-NAME+L-Arg后，咪達唑侖舒血管作用明顯減弱(P<0.05)，而加入外源性的NO合成底物L-Arg、iNOS抑制劑1400W、環(huán)氧合酶抑制劑Indo均不能抑制咪達唑侖的舒血管作用；Na+/Ca2+交換體特異性阻斷劑KB-R7943亦不能抑制咪達唑侖的舒血管作用；鉀通道阻斷劑KATP阻斷劑Gli可以抑制咪達唑侖的舒張冠脈作用(P<0.05)，BKCa阻斷劑TEA、Kir阻斷劑BaCl2、KV阻斷劑4-AP則不能改變咪達唑侖的舒張冠脈作用。結論 咪達唑侖可濃度和內皮依賴性地舒張KCl預收縮的豬冠脈環(huán)，內皮分泌的NO參與了其舒血管作用，外源性NO、iNOS以及PGI2的合成與其舒血管作用無關，咪達唑侖對豬冠脈的舒張可能與KATP通道有關，與Na+/Ca2+交換體、 KV通道、BKCa通道、Kir通道無關。

咪達唑侖；豬冠狀動脈環(huán)；舒張作用；NO；內皮；鉀通道

1 材料

1.1 實驗動物 豬，♀♂不限，月齡3～4個月，體質量100～150 kg，取自山西省太原市小井峪屠宰場。

1.2 藥品與試劑 咪達唑侖：江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號20080828；緩激肽、左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、吲哚美辛(Indo)、四乙胺(TEA)、格列苯脲(Gli)、氯化鋇(BaCl2)、4-氨基吡啶(4-AP)均購自美國Sigma公司；KB-R7943購自TOCRIS公司；其余均為國產分析純。

1.3 儀器 PowerLab生物信號采集分析系統(tǒng)(埃德儀器國際貿易上海有限公司)；張力換能器(成都泰盟科技有限公司)；精密天平(BS124S，賽多利斯科學儀器北京有限公司)；pH計(PHS-3C，上海理達儀器廠)。

2 方法

2.1 離體豬冠狀動脈環(huán)制備 刺破豬的心臟并待血流結束后，迅速取出心臟，剪取豬冠狀動脈左前降支及其周圍心肌組織，立即置入4℃的PSS液(pH=7.38)中，迅速返回實驗室。本研究分離豬冠狀動脈左前降支中下段，直徑為1～2 mm，細心剔除冠脈周圍的脂肪及結締組織，將冠脈剪成5 mm左右的血管環(huán)。隨后，用2個不銹鋼微型三角掛鉤貫穿冠脈管腔，水平懸掛在恒溫的10 mL玻璃浴管內，浴管內提前加入37 ℃的PSS液10 mL，并通入100% O2，下方掛鉤固定在浴管底部，上方掛鉤以一不銹鋼絲連接于張力環(huán)能器。每個冠脈環(huán)在浴管內的基礎張力調整至3 g，平衡1.5～2 h，其間隨時調整張力，使之恒定地維持在3 g，每20 min換1次PSS液。所有冠脈環(huán)用KCl(30 mmol·L-1)PSS液刺激3次并洗脫，收縮穩(wěn)定后，記錄在加入不同血管活性物質后，冠脈環(huán)的張力變化。

2.2 去內皮冠脈環(huán)制備 取剔除周圍脂肪及結蹄組織的豬冠狀動脈5 mm，兩端用針頭固定，取纏少許棉花(與冠脈內徑相適)的針頭從管腔擦過，連續(xù)2次。冠脈環(huán)懸掛穩(wěn)定2 h后，用KCl(30 mmol·L-1)PSS液刺激，收縮達坪值后，加入緩激肽(1×10-5mol·L-1)，以KCl預收縮幅度為1，舒張幅度0.05時，認為冠脈內皮完全去除，可進行后續(xù)實驗。

2.3 咪達唑侖對KCl預收縮內皮完整和去內皮豬冠脈環(huán)的影響 冠脈環(huán)穩(wěn)定后，向KCl(30 mmol·L-1)預收縮內皮完整豬冠脈環(huán)、KCl(30 mmol·L-1)預收縮去內皮豬冠脈環(huán)，累積加入3×10-6、1×10-5、3×10-5、1×10-4mol·L-1的咪達唑侖，對照組累積加入相應體積的溶劑。描記豬冠脈環(huán)張力的變化曲線。以KCl誘發(fā)的冠脈環(huán)的最大收縮幅度為1，計算給予不同濃度咪達唑侖后，冠脈舒張幅度占最大收縮幅度的百分比。建立濃度效應曲線，觀察咪達唑侖對豬冠狀動脈環(huán)的作用。

2.4 內皮在咪達唑侖舒張KCl預收縮豬冠狀動脈中的作用機制 冠脈環(huán)穩(wěn)定后，給予30 mmol·L-1KCl收縮達坪值后，加入非特異性一氧化氮合酶(NOS)抑制劑L-NAME(1×10-4mol·L-1)、外源性的NO合成底物L-Arg(1×10-5mol·L-1)、L-NAME+L-Arg、iNOS 抑制劑1400W(1×10-5mol·L-1)、環(huán)氧合酶抑制劑Indo(1×10-5mol·L-1)，對照組加入溶劑后，血管張力進一步發(fā)生改變，再次達到坪值后，累積加入3×10-6、1×10-5、3×10-5、1×10-4mol·L-1的咪達唑侖，記錄相應血管張力并計算變化值。

2.5 Na+/Ca2+交換體在咪達唑侖舒張KCl預收縮豬冠狀動脈中的作用 冠脈環(huán)穩(wěn)定后，給予30 mmol·L-1KCl收縮達坪值后，加入Na+/Ca2+交換體阻斷劑KB-R7943(1×10-6mol·L-1)，對照組加入溶劑，血管張力進一步發(fā)生改變，再次達到坪值后，累積加入3×10-6、1×10-5、3×10-5、1×10-4mol·L-1的咪達唑侖，記錄相應血管張力并計算變化值。

2.6 K+通道在咪達唑侖舒張KCl預收縮豬冠狀動脈中的作用 冠脈環(huán)穩(wěn)定后，給予30 mmol·L-1KCl收縮達坪值后，加入延遲整流鉀通道(KV)阻斷劑4-AP(1×10-3mol·L-1)、內向整流鉀通道(Kir)阻斷劑BaCl2(1×10-3mol·L-1)、鈣激活鉀通道(BKCa)阻斷劑TEA(1×10-2mol·L-1)和ATP敏感鉀通道(KATP)阻斷劑Gli(1×10-5mol·L-1)，對照組加入溶劑，血管張力進一步發(fā)生改變，再次達到坪值后，累積加入3×10-6、1×10-5、3×10-5、1×10-4mol·L-1的咪達唑侖，記錄相應血管張力并計算變化值。

3 結果

3.1 咪達唑侖對KCl預收縮內皮完整和去內皮豬冠脈環(huán)的影響 在內皮完整的冠脈環(huán)中，用KCl(30 mmol·L-1)預收縮后，各濃度(3×10-6、1×10-5、3×10-5、1×10-4mol·L-1)的咪達唑侖能產生明顯的舒張作用，其Emax為(0.92±0.04)，各濃度咪達唑侖的舒張作用與溶劑對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在去內皮的冠脈環(huán)中，用KCl(30 mmol·L-1)預收縮后，3×10-6、1×10-5、3×10-5、1×10-4mol·L-1的咪達唑侖能產生明顯的濃度依賴性的舒張作用，其Emax為(0.74±0.04)。與內皮完整組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見Fig 1。

3.2 內皮在咪達唑侖舒張KCl預收縮豬冠狀動脈中的作用機制 在KCl(30 mmol·L-1)預收縮的豬冠脈環(huán)上，預孵L-NAME后，咪達唑侖舒血管作用明顯減弱，其Emax為(0.78±0.03)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；預孵L-NAME+L-Arg后，咪達唑侖舒血管作用明顯減弱，其Emax為(0.83±0.02)，與無阻斷藥組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與單加L-NAME組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；分別預孵L-Arg、1400W、Indo后，對咪達唑侖舒血管作用無明顯影響，其Emax分別為(0.94±0.03)、(0.94±0.03)、(0.91±0.03)，見Fig 2。

Fig 1 Midazolam-induced relaxation in endothelium-intact(Endothelium+) or-denuded(Endothelium-) porcine isolated coronary artery rings with precontraction induced by KCl

**P<0.01vsvehicle group or midazolam(Endothelium+) group

Fig 2 Effects of L-NAME,L-Arg,1400W,Indo on relaxation induced by midazolam in porcine isolated coronary artery rings with precontraction induced by KCl

*P<0.05,**P<0.01vsmidazolam alone group

3.3 Na+/Ca2+交換體阻斷劑在咪達唑侖舒張KCl預收縮豬冠狀動脈中的作用 在KCl(30 mmol·L-1)預收縮的豬冠脈環(huán)上，Na+/Ca2+交換體阻斷劑KB-R7943預孵后，其Emax為(0.95±0.04)，對咪達唑侖的舒血管作用無影響(P>0.05)，見Fig 3。

3.4 K+通道阻斷劑在咪達唑侖舒張KCl預收縮豬冠狀動脈中的作用 在KCl(30 mmol·L-1)預收縮的豬冠脈環(huán)上，分別預孵K+通道阻斷劑4-AP、BaCl2、TEA后，對咪達唑侖的舒血管作用無影響(P>0.05)，其Emax分別為(1.02±0.06)、(1.05±0.03)、(1.10±0.06)；預孵Gli后，咪達唑侖舒血管作用明顯減弱，其Emax為(0.59±0.04)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見Fig 4。

Fig 3 Effects of KB-R7943 on relaxation induced by midazolam in porcine isolated coronary artery rings with precontraction induced by KCl(30 mmol·L-1)(±s,n=5)

Fig 4 Effects of 4-AP,BaCl2,TEA,Gli on relaxation induced by midazolam in porcine isolated coronary artery rings with precontraction induced by KCl(30 mmol·L-1)(±s,n=5)

**P<0.01vsmidazolam alone group

4 討論

豬冠狀動脈的口徑、分布、走向、結構與人的冠狀動脈有很大的相似性[4]，因此，本實驗研究了咪達唑侖對豬冠狀動脈的舒張作用及其機制。實驗結果表明，咪達唑侖對內皮完整的豬冠狀動脈環(huán)有濃度依賴性的舒張作用，去除內皮后，其舒張作用明顯減弱。由此可見，咪達唑侖對冠狀動脈的舒張作用主要兩方面的機制，部分依賴于血管內皮的舒張機制，部分作用于血管平滑肌的舒張機制。

依賴于內皮的舒血管機制主要源于內皮釋放的一系列調節(jié)血管平滑肌張力的血管活性物質，主要有一氧化氮(NO)、前列腺環(huán)素(PGI2)等[5-6]。其中，NO是維持血管基礎張力的最重要的舒血管因子，它的合成和釋放受到抑制后，內皮相關的舒血管作用則會減弱[7]。文獻表明[8]，NO可通過NO-鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)-環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)途徑、作用于K+通道等機制而舒張血管。我們用非特異性NOS抑制劑L-NAME預孵KCl預收縮的豬冠脈后，咪達唑侖的舒張血管作用部分被阻斷，提示咪達唑侖的舒張血管作用可能與NO有關。L-Arg在NO的調節(jié)中發(fā)揮著關鍵的作用，它是體內NO合成的唯一底物。豬冠脈環(huán)預孵外源性NO合成底物L-Arg后，咪達唑侖舒血管作用并沒有變化。同時應用L-NAME后，即使預孵L-Arg，咪達唑侖的舒血管作用仍然部分抑制，說明NO參與咪達唑侖舒張血管作用與外源性NO合成底物無關，L-NAME阻斷咪達唑侖的舒血管作用也不受外源性NO合成底物的影響。

NOS是NO合成最關鍵的限速酶，目前常見的有3種同工酶，分別為神經(jīng)元型(nNOS，Ⅰ型)、巨噬細胞誘導型(iNOS，Ⅱ型)和內皮細胞型(eNOS，Ⅲ型)[9]，在一些病理狀態(tài)下，iNOS大量持續(xù)表達，NO持續(xù)大量產生。同時，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，NO是一種復雜的生物活性介質，可以參與多種體內代謝的病理和生理過程，大量NO可能造成組織和細胞的損害，甚至死亡。所以，iNOS的誘導合成就成為眾多疾病發(fā)病的關鍵。此外，在NO合成底物缺乏的情況下，iNOS可促使O2-大量形成，與NO形成氮氯化合物，通過細胞毒作用損傷機體[10]。1400W是迄今為止選擇性最強的iNOS抑制劑，抑制iNOS的作用比抑制eNOS強200～5 000倍，是評價iNOS抑制劑必需的最新工具。實驗中應用1400W后，發(fā)現(xiàn)對咪達唑侖的血管舒張作用無影響，說明咪達唑侖不是通過誘導合成iNOS來發(fā)揮舒血管作用。

與內皮相關的主要舒血管因子還有PGI2，由環(huán)氧合酶(COX)催化花生四烯酸生成，COX是其合成的主要限速酶，其抑制劑Indo對咪達唑侖的舒張冠脈作用無影響，提示PGI2途徑?jīng)]有參與咪達唑侖的舒血管作用。

Ca2+在血管平滑肌的收縮與舒張中起著關鍵作用，細胞外鈣內流和細胞內鈣釋放促使血管平滑肌收縮。電壓依賴鈣通道(VDC)、受體操縱鈣通道(ROC)、鈣釋放激活的鈣通道(CRAC)以及其他離子載體(Na+/Ca2+交換體、漏通道等)的激活是鈣內流的主要途徑。高濃度KCl使冠脈血管平滑肌細胞膜去極化，VDC開放，從而促使細胞外的Ca2+內流，引起血管平滑肌收縮[11]。前期研究表明，咪達唑侖可以阻斷VOC，其舒血管作用還涉及ROC和細胞內儲存鈣釋放的抑制。在本實驗中，咪達唑侖可濃度依賴性地抑制KCl預收縮的豬冠狀動脈環(huán)，提示咪達唑侖引起的血管環(huán)舒張可能是通過抑制VDC介導的細胞外鈣內流而舒張血管。本實驗中，冠脈環(huán)預孵Na+/Ca2+交換體特異性阻斷劑KB-R7943(1×10-6mol·L-1)后，咪達唑侖的舒血管作用無變化，提示咪達唑侖不通過Na+/Ca2+交換體發(fā)揮舒血管作用。

K+通道在維持血管平滑肌張力中發(fā)揮著重要作用，激活血管平滑肌上的K+通道，K+外流，細胞膜超級化，從而抑制細胞外Ca2+內流，引起血管舒張。為了探討咪達唑侖的舒張冠脈作用與K+通道之間的關系，我們分別觀察了不同K+通道阻斷劑對咪達唑侖舒張冠脈作用的影響。結果顯示，KATP阻斷劑Gli可以抑制咪達唑侖的舒張冠脈作用，BKCa阻斷劑TEA、Kir阻斷劑BaCl2、KV阻斷劑4-AP對咪達唑侖的舒張冠脈作用無影響。結果表明，KATP通道在咪達唑侖的舒張冠脈中發(fā)揮了作用，BKCa、Kir和KV通道未參與其舒張冠脈作用。

綜上所述，咪達唑侖可舒張KCl(30 mmol·L-1)預收縮的豬冠脈環(huán)，其舒血管作用具有濃度依賴性和內皮依賴性，內皮分泌的NO參與了其舒血管作用，外源性NO、iNOS以及PGI2的合成與其舒血管作用無關，咪達唑侖對豬冠脈的舒張可能與KATP通道有關，與 KV通道、BKCa通道、Kir通道以及Na+/Ca2+交換體無關。本實驗是咪達唑侖舒血管機制的初步研究，本課題組將在后續(xù)的研究中從分子生物學、NO濃度測定、離子通道電生理等方面深入探討咪達唑侖舒血管機制。通過對咪達唑侖舒血管機制的研究，有助于闡明咪達唑侖在麻醉誘導或者鎮(zhèn)靜時，減少心肌氧耗、增加冠脈血流量、維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定的作用機制。

(致謝:本實驗在山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室完成。感謝各老師和同學在實驗過程中的幫助。)

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Vasodilatory effect of midazolam on pre-contractions ofin-vitroporcine coronary artery and its mechanisms

REN Jun-jie1,3，WANG Ke-ke1，XU Hui-yu3，HUANG Ting-juan1,LYU Yi1, WU Dong-mei3，ZHANG Xuan-ping3，ZHENG Xiao-jun2
(1.DeptofInternalMedicine，2.DeptofPharmacy,theFirstHospitalofShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China;3.DeptofPharmacology，ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China)

Aim To investigate the effects of midazolam on porcine isolated coronary artery rings pre-contracted by potassium chloride(KCl) and the possible mechanism.Methods The vessel tension recorder system was used. Isotonic tension of porcine isolated coronary artery rings precontracted by KCl(30 mmol·L-1) was recorded. The vasorelaxing action of midazolam and effects of various drugs were observed in the rings.Results Midazolam(3×10-6～1×10-4mol·L-1) respectively concentration-dependently reduced the contraction induced by KCl, and there was significant difference between the rings with intact and denude endothelium(P<0.05). On KCl-induced precontraction,midazolam′s relaxation was depressed byL-NAME and the blend ofL-NAME and L-Arg(P<0.05), but was not affected by Indo,L-Arg and 1400W.The contraction was not prevented by pretreatment with the inhibitor of Na+/Ca2+exchanger(KB-R7943).The inhibitor of KATP(Gli) restrained the diastolic function of midazolam(P<0.05),while the inhibitor of BKCa(TEA), Kir(BaCl2), KV(4-AP) had no obvious effect.Conclusions Midazolam produces remarkable vasodilatation on KCl pre-contracted porcine isolated coronary artery rings. Its relaxtion effect is via concentration-dependent and endothelium-dependent mechanisms and relevant to the production of NO. Na+/Ca2+exchanger is not involved midazolam′s vasodilatation on KCl pre-contracted porcine coronary artery rings.The relaxant mechanism of midazolam may be concerned with KATP.The Kir,BKCaand KVmay be not involved.

midazolam;porcine coronary artery rings;vasodilator effect;NO;endothelium;potassium channel

2017-03-17,

2017-04-22

山西省研究生教育創(chuàng)新項目(No 2016BY077)；山西醫(yī)科大學青年基金(No 02201514)

任俊杰(1983-)，男，博士生，主治醫(yī)師，研究方向：心血管藥理學與細胞生理學，E-mail：renjunjie1120@163.com; 鄭曉俊(1972-)，女，碩士，副主任藥師，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學與細胞生理學，通訊作者，E-mail：sydyyzhengxiaojun@163.com; 武冬梅(1952-)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學與細胞生理學，通訊作者，E-mail：sydwudongmei@163.com

時間：2017-7-7 11:05 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.036.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.018

A

1001-1978(2017)08-1131-05

R-332；R322.12；R331.32；R971.2