唐華麗，夏 惠，王 鋒，孫桂菊,*（.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，教育部環(huán)境醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 20009；2.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 404000）

枸杞多糖作用于2型糖尿病大鼠的血清代謝組學(xué)研究

唐華麗1,2，夏 惠1，王 鋒1，孫桂菊1,*
（1.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，教育部環(huán)境醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；2.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 404000）

建立適用于血清代謝物譜研究的氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，并用于對(duì)照組（NC組）、2型糖尿病模型組（type 2 diabetic model group，DM組）及枸杞多糖干預(yù)DM大鼠組（Lycium barbarum polysaccharides，LBP組）大鼠血清代謝物譜的分析。采用主成分分析、正交偏最小二乘判別法等模式識(shí)別方法對(duì)NC組、DM組及LBP組大鼠血清代謝物譜進(jìn)行分類，并從血清中尋找與2型糖尿病相關(guān)結(jié)果部分并未出現(xiàn)顯著性分析的潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果表明，所建立的方法能將3 組大鼠血清代謝物譜分離，DM組大鼠血清中丙氨酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸相對(duì)于NC組大鼠降低；LBP干預(yù)DM大鼠1 個(gè)月后，LBP組大鼠血清中丙氨酸、胸腺嘧啶核苷酸含量有所上升。血清中這丙氨酸、胸腺嘧啶核苷酸可能與氨基酸代謝和核苷酸代謝有關(guān)，LBP組與DM組大鼠血清中丙氨酸和胸腺嘧啶核苷酸水平的變化體現(xiàn)了大鼠體內(nèi)氨基酸和核苷酸代謝的改變。本實(shí)驗(yàn)可為進(jìn)一步研究LBP的降糖作用機(jī)制提供參考。

枸杞多糖；2型糖尿??；代謝組學(xué)；生物標(biāo)志物

代謝組學(xué)（metabonomics）是研究生物體受基因改變或環(huán)境變化等因素干擾后，其內(nèi)源性代謝物質(zhì)種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的一門新興學(xué)科。發(fā)展于20世紀(jì)90年代中期。重點(diǎn)討論的是某組織、器官或生物整體的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的代謝途徑及它們?cè)趦?nèi)外因素的影響下隨時(shí)間變化的規(guī)律[1-2]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)作為代謝組學(xué)研究最常見(jiàn)的分析方法之一，具有靈敏度高、分辨率強(qiáng)、重現(xiàn)性好以及高通量的優(yōu)點(diǎn)[3-4]；適用于對(duì)生物樣本中氨基酸、有機(jī)酸和核苷酸等小分子代謝物質(zhì)的分析。在代謝組學(xué)的分析策略中，不同類型的樣品通過(guò)不同提取方法及衍生化反應(yīng)獲得相應(yīng)的GC-MS總離子流圖，建立數(shù)學(xué)模型，從而獲得生物體內(nèi)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變量，然后利用MS中強(qiáng)大的譜圖解析功能或圖譜庫(kù)檢索系統(tǒng)進(jìn)行識(shí)別分析，最后對(duì)引起這些代謝物變化的生物學(xué)意義進(jìn)行解釋[5-9]。

枸杞子是我國(guó)國(guó)家公布的藥食同源品種之一，作為保健佳品被人類廣泛食用或者飲用已有上千年的歷史[10]。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）作為枸杞發(fā)揮功效作用的重要活性成分而成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)LBP的降糖活性[11-14]。但是與藥效學(xué)相比，LBP進(jìn)入機(jī)體后代謝生成何種成分，如何影響導(dǎo)致機(jī)體血糖波動(dòng)的代謝途徑從而發(fā)揮其降糖作用等問(wèn)題的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本實(shí)驗(yàn)利用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography-time of flight mass spectrography，GC-TOF MS）技術(shù)分析2型糖尿病模型大鼠血清代謝譜的變化，研究LBP的血清代謝組學(xué)及與其密切相關(guān)的小分子生物代謝產(chǎn)物，為L(zhǎng)BP的降血糖作用機(jī)理研究提供一種新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)SD雄性大鼠30 只，體質(zhì)量（180±20） g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0006，購(gòu)自上海思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

LBP樣品（色譜級(jí)，純度＞90%，Mw＜6 000 D）上海善力鍵生物有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，分子式C8H15N3O7） 美國(guó)Sigma公司；L-2-氯苯丙氨酸 上海恒柏生物科技有限公司；N,O-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA）、三甲基氯硅烷（chlorotrimethysilane，TMCS） 美國(guó)Regis科技有限公司；甲氧胺鹽酸鹽瑞士Fluka公司；甲醇、吡啶、氯仿、檸檬酸、檸檬酸鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖氧化酶試劑盒、大鼠胰島素（insulin，INS）檢測(cè)試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Chroma TOF PEGASUS HT質(zhì)譜儀 美國(guó)LECO公司；色譜柱 美國(guó)Restek公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；BSA124S分析天平德國(guó)賽多利斯公司；5424R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、加樣器 德國(guó)Eppendorf公司；Synergy超純水系統(tǒng)上海百維生物科技有限公司；SHA-B恒溫振蕩器 金壇市恒豐儀器廠；大鼠代謝籠 蘇州新區(qū)楓橋?qū)嶒?yàn)動(dòng)物籠具廠。

1.3 方法

1.3.1 2型糖尿病大鼠模型的建立

健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（180±20） g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。將30 只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）10 只和糖尿病模型組（DM組）20只。所有大鼠12 h光照，每籠5 只。NC組以普通飼料喂養(yǎng)，DM組喂以高脂飼料（豬油10%、蔗糖10%、蛋黃粉5%、膽固醇0.5%、基礎(chǔ)飼料74.5%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），由上海思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供），持續(xù)喂養(yǎng)28 d。于第28天晚禁食過(guò)夜（禁食12 h），在第29天上午取尾血測(cè)定空腹血糖（葡萄糖氧化酶法）。取樣后給予DM組大鼠一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg（用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液新鮮配制成1%的STZ無(wú)菌溶液），NC組僅注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。1 d后再次一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，NC組注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。一周后，全部大鼠禁食不禁水，12 h后尾部采血測(cè)定空腹血糖（葡萄糖氧化酶法）；再過(guò)2 d復(fù)測(cè)其空腹血糖值，以葡萄糖（2 g/kg）負(fù)荷2 h時(shí)的血清葡萄糖濃度大于11.1 mmol/L為成模指標(biāo)判斷其成模率。

1.3.2 LBP對(duì)2型糖尿病模型大鼠的干預(yù)

將DM組造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組（DM組）和LBP干預(yù)組（LBP組），每組6 只。第6周起開始干預(yù)實(shí)驗(yàn)，每天上午9：00開始灌胃，LBP組按照200 mg/kg劑量[15]灌胃LBP（以體質(zhì)量計(jì)），灌胃體積2 mL，NC和DM組同時(shí)灌胃等量蒸餾水，每天1 次，連續(xù)給藥1 個(gè)月。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食，飲水，保持動(dòng)物房溫度（22±1） ℃，每天對(duì)大鼠行為活動(dòng)、飲水量、尿量和大便等進(jìn)行觀察。

1.3.3 樣本采集與預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)第31天分別對(duì)各組大鼠麻醉后股動(dòng)脈取血，靜置30 min血液凝固分層，然后于4 000 r/min離心10 min，取上清液分裝至凍存管中，每管0.5 mL，存放于－80 ℃超低溫冰箱凍存待測(cè)。

1.3.4 大鼠血清樣本的GC-TOF MS代謝組學(xué)檢測(cè)

1.3.4.1 代謝物萃取

取血清樣品100 μL，先后加入0.35 mL甲醇和20 μL L-2-氯苯丙氨酸，漩渦混勻后于4 ℃，12 000 r/min冷凍離心15 min，小心取0.4 mL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶中，同時(shí)，取相同體積約20 μL樣本于新的2 mL進(jìn)樣瓶中，混勻，混合樣品作為質(zhì)控樣本。

1.3.4.2 代謝物衍生化

將盛裝樣品的進(jìn)樣瓶置于37 ℃真空濃縮器中干燥提取2 h，向干燥后的進(jìn)樣瓶中加入60 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽、吡啶混合物），輕輕混勻后，置于80 ℃烘箱中孵育20 min，然后向各進(jìn)樣瓶中快速加入80 μL BSTFA試劑（含體積分?jǐn)?shù)1%的TMCS），混合物70 ℃孵育1 h，冷卻至室溫后向混樣中加入飽和脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)混合液（FAMEs，溶于氯仿，C8～C16：1 mg/mL；C18～C24：0.5 mg/mL）試劑10 μL，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5 GC-TOF MS數(shù)據(jù)采集與分析

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：Rxi-5Sil MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；前進(jìn)樣口吹掃流量3 mL/min，進(jìn)樣室溫度280 ℃，程序升溫：初溫50 ℃保留1 min，以10 ℃/min升至330 ℃，保留5 min。載氣為高純氦氣，流量1 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量體積1.0 μL。

1.3.5.2 質(zhì)譜條件

EI源，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，溶劑延遲時(shí)間366 s，掃描范圍30～600 u，掃描速率20 spectra/s，全掃描方式。

1.3.5.3 數(shù)據(jù)處理及標(biāo)記物確定

利用Chroma TOF4.3X軟件和LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理。其處理過(guò)程包括基線矯正、峰判別和匹配、消除噪音等。然后獲得由樣本、保留時(shí)間-質(zhì)荷比和歸一化的峰面積組成的三維矩陣圖。最后將數(shù)學(xué)矩陣導(dǎo)入到SIMCA-P＋軟件包（V14.0，Umetrics AB，Ume?，Sweden）對(duì)歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元變量模式識(shí)別分析。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)中心化和Pareto均一化處理后獲得具有顯著性差異的OPLS-DA圖。通過(guò)分析找到差異變量，然后利用GC-MS的譜庫(kù)檢索（Fiehn database）和譜圖解析以及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)合京都基因與基因組百科全書KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）確定變化的代謝途徑，從而理解與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物學(xué)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立

由表1可知，STZ注射前，經(jīng)高脂高糖喂養(yǎng)4 周以后DM組大鼠的體質(zhì)量、甘油三酯含量以及總膽固醇含量與NC組大鼠相比均有顯著升高（P＜0.05），表明高脂高糖飲食能導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量增加以及血脂升高；高脂高糖與普通飼料喂養(yǎng)的大鼠空腹血糖含量沒(méi)有明顯變化，而DM組大鼠血清胰島素水平有所增加，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明高脂高糖飲食可在大鼠體內(nèi)引起胰島素抵抗。STZ給予大鼠以后，DM組大鼠的空腹血糖水平極顯著高于普通飼料組（P＜0.01），說(shuō)明高脂高糖飲食不僅可引起脂肪的堆積，還會(huì)導(dǎo)致胰島素敏感性下降，通過(guò)STZ的作用，最終可使血糖和胰島素水平升高，符合2型糖尿病的特征，但是造模過(guò)程中，有2 只大鼠死亡，造模成功率為90%。

表1 STZ給予前后NC組和DM組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的變化（s）Table 1 Changes in body weight and blood parameters of rats in the control and model groups before and after STZ injection ()

表1 STZ給予前后NC組和DM組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的變化（s）Table 1 Changes in body weight and blood parameters of rats in the control and model groups before and after STZ injection ()

注：*.與NC組比較差異顯著（P＜0.05）；**.與NC組比較差異極顯著（P＜0.01）。

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2.2 大鼠血清GC-TOF MS分析結(jié)果

圖1 各組血清的GC-TOF MS總離子流圖Fig. 1 GC-TOF MS total ion chromatograms of serum samples in each group

研究中為獲得大鼠血清中小分子代謝物的信息，采用GC-TOF MS對(duì)血清樣本進(jìn)行分析，各組代表樣本的分析結(jié)果如圖1所示，首先，將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，獲得各個(gè)大鼠血清樣本在空間上的分布情況（圖2），NC組各樣本與DM組和LBP組各樣本明顯分離，表明NC組與DM組和LBP組的代謝狀態(tài)明顯不同，說(shuō)明大鼠經(jīng)高脂高糖膳食與腹腔注射STZ造模后，其血液中正常生理代謝受到嚴(yán)重干擾，認(rèn)為糖尿病模型成功建立。LBP組各樣本點(diǎn)顯示出不同程度地向NC組靠近的趨勢(shì)，說(shuō)明LBP對(duì)2型糖尿病大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)生了有效的干預(yù)作用。而DM組與LBP組各樣本分離不顯著，而且還存在少量離群樣本點(diǎn)，這主要是因?yàn)镻CA是無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別分析技術(shù)，分類判別能力較弱，但3大組血清樣本都分布在置信區(qū)間（95%）內(nèi)。離群樣本點(diǎn)的存在會(huì)嚴(yán)重影響聚類結(jié)果和生物標(biāo)志物的尋找結(jié)果，然而在代謝組學(xué)獲得的數(shù)據(jù)中，由于實(shí)驗(yàn)的操作因素或樣本本身的原因，經(jīng)常會(huì)有離群樣本點(diǎn)存在的現(xiàn)象。為了進(jìn)一步驗(yàn)證NC、DM和LBP組大鼠血清樣本的分離情況，最大化組間分離，并從中識(shí)別有效的標(biāo)志物，對(duì)各數(shù)據(jù)組進(jìn)行OPLS-DA分析，對(duì)樣本的代謝全譜進(jìn)行區(qū)分，其得分見(jiàn)圖3B。圖4中R2代表Y變量的可解釋性，Q2代表模型的可預(yù)測(cè)性，二者越接近1說(shuō)明OPLS-DA模型越能很好地解釋兩組樣本之間的差異，圖4的截距R2=0.944，Q2=－0.058 8，可以很好地體現(xiàn)模型的穩(wěn)健性。OPLS-DA分析明顯提高了數(shù)據(jù)分類聚合能力，各組樣本沿著第1主分分離效果提高，表明與LBP影響有關(guān)的分類能力得到提高。載荷圖5中距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)說(shuō)明此因子對(duì)分類的貢獻(xiàn)系數(shù)越大，為潛在的差異標(biāo)志物。

圖2 總體血清樣本的PCA得分圖Fig. 2 PCA score plots of total serum samples

圖3 基于糖尿病和正常大鼠血清的PCA和OPLS-DA得分圖Fig. 3 PCA and OPLS-DA score plots of rat serum between DM and NC groups

圖4 LBP組和DM組血清樣本的置換檢驗(yàn)圖Fig. 4 Permutation test charts for OPLS-DA model of serum samples between LBP and DM groups

圖5 LBP組-DM組血清樣本的OPLS-DA載荷圖Fig. 5 OPLS-DA loading plots of serum samples between LBP and DM groups

2.3 差異代謝物的篩選及鑒定

通過(guò)OPLS-DA分析過(guò)濾掉不相關(guān)的正交信號(hào)，因而獲得的差異性代謝物更加可靠。采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP（variable importance in the projection）值（閾值＞1），并結(jié)合學(xué)生氏t檢驗(yàn)的P值（閾值0.05）來(lái)尋找差異性表達(dá)代謝物。

表2 DM組與NC組差異化合物篩選Table 2 Screening of differentially expressed metabolites between DM and NC groups

表3 LBP組與DM組差異化合物篩選Table 3 Screening of differentially expressed metabolites between LBP and DM groups

從OPLS-DA結(jié)果中篩選出VIP值大于1的變量，并根據(jù)載荷分布確定變化方向，對(duì)DM組與NC組、LBP組與DM模型組血清樣本分別進(jìn)行比較，差異變量及其變化方向見(jiàn)表2、3。表中相似度為定性出的物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)中物質(zhì)的匹配程度，滿分為1 000，越接近1 000說(shuō)明定性出的物質(zhì)越準(zhǔn)確。

由表2可知，經(jīng)STZ造模后，DM組與NC組共發(fā)現(xiàn)和鑒定出了20 種特征差異代謝物，DM組大鼠血清中木糖醇、膽固醇、蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等11 種潛在生物標(biāo)記物的代謝水平上升；丙氨酸、花生四烯酸、甘氨酸、賴氨酸等9 種潛在生物標(biāo)記物的代謝水平下調(diào)。由表3可知，DM組大鼠灌胃LBP 一個(gè)月后，出現(xiàn)了丙氨酸、谷氨酸水平回調(diào)升高，這些氨基酸都是糖異生的前體氨基酸，其水平升高表明大鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)分解水平增加，糖異生途徑水平增高。

糖異生主要是由非糖前體物質(zhì)生成糖的過(guò)程，主要意義在于保證某些依賴葡萄糖供能的組織的功能發(fā)揮，比如肌肉組織、大腦等。給DM組大鼠灌胃LBP一個(gè)月后導(dǎo)致糖異生的生糖氨基酸水平增加，表明為了滿足機(jī)體正常需求，大鼠機(jī)體糖異生水平增加，這與課題組前期研究中LBP能導(dǎo)致機(jī)體血糖水平降低的觀點(diǎn)一致[16]。因?yàn)長(zhǎng)BP能使大鼠機(jī)體胰島素敏感性增加，從而導(dǎo)致其血糖水平降低，可是，欲使大鼠大腦與肌肉組織仍然保持正常的血糖水平，那么，其機(jī)體的糖異生水平就會(huì)增加。

此外，在LBP組有些代謝產(chǎn)物消失，包括一些氨基酸和磷酸葡萄糖酸等，表明LBP組能提高機(jī)體的抗氧化能力。其中葡萄糖水平的降低能很好地說(shuō)明LBP有一定的降血糖效果，而草酰乙酸為三羧酸循環(huán)以及檸檬酸-丙酮酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，其濃度降低表明體內(nèi)糖脂代謝發(fā)生紊亂。胸腺嘧啶核苷酸是核苷酸代謝產(chǎn)物，參與嘌呤嘧啶代謝循環(huán)，此代謝循環(huán)與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理十分相關(guān)，胸腺嘧啶核苷酸濃度升高可能會(huì)引起腎內(nèi)血管的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成腎血流動(dòng)力學(xué)異常，從而有引起糖尿病和糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，胸腺嘧啶核苷酸為DNA的合成前體物，其水平升高表明其受體內(nèi)自由基氧化損傷程度降低[17]，說(shuō)明LBP能有效清除2型糖尿病大鼠體內(nèi)氧自由基，從而降低胰島β細(xì)胞氧化損傷的風(fēng)險(xiǎn)。

3 討 論

LBP是提取自我國(guó)傳統(tǒng)中草藥枸杞子中的一種水溶性蛋白復(fù)合多糖[18-19]。已有研究表明LBP具有很好的降低血糖和血脂、促進(jìn)胰島素分泌、改善胰島素抵抗、增加胰島素敏感性；改善超氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮等氧化應(yīng)激指標(biāo)的作用[16,20-22]，其作用機(jī)制可能與上調(diào)胰島素受體底物-1、調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)基因等糖尿病靶器官胰島功能有關(guān)。與其藥效學(xué)研究相比，LBP被吸收后以何種方式存在、機(jī)體受LBP刺激后體內(nèi)各小分子代謝產(chǎn)物如何變化進(jìn)而間接影響胰島素受體底物、調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)基因等問(wèn)題尚不清楚。

代謝組學(xué)是研究生物體受外界因素干擾后，所產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物的質(zhì)和量及其變化規(guī)律，對(duì)生物體代謝過(guò)程中的樣本進(jìn)行篩選，檢測(cè)和分析分子質(zhì)量在1 000 D以下的小分子化合物組成的方法，較常見(jiàn)的生物樣本包括血樣、尿樣和組織液等。血清常被作為代謝組學(xué)分析的一種生物樣本，小分子物質(zhì)含量豐富，其中不僅含有代謝產(chǎn)物，也包括很多代謝中間產(chǎn)物[23-24]。所以本研究選取血清作為實(shí)驗(yàn)樣本，開展LBP作用于糖尿病大鼠的代謝組學(xué)分析研究。Bao Yuqian等[25]利用基于GC-MS聯(lián)用分析的代謝組學(xué)方法分析了82 例新診斷的臨床2型糖尿病患者的血清代謝物組的異常，以及在服用二甲雙胍、羅格列酮和瑞格列奈3 種臨床一線用藥隨訪24 周和48 周的結(jié)果，通過(guò)與常用的臨床指標(biāo)（FPG、2hPG、HbAlc）對(duì)比，發(fā)現(xiàn)雖然這3 種藥物對(duì)血糖以及臨床指標(biāo)的改善相似，但其對(duì)血清小分子代謝物的改善作用卻各不相同，總體來(lái)說(shuō)以羅格列酮的影響最為顯著，從而說(shuō)明代謝組學(xué)的方法不僅可用于臨床疾病的診斷和分型，也可以為監(jiān)測(cè)臨床藥物的效果提供一個(gè)全新的視角。由此可見(jiàn)，代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)于了解2型糖尿病發(fā)病機(jī)制、2型糖尿病的早期診斷以及降糖藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)方面具有舉足輕重的地位。

氨基酸是蛋白質(zhì)的最終代謝產(chǎn)物，研究表明，糖尿病患者氨基酸譜發(fā)生了特征性改變[26-29]。也有研究指出，血液中異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸5 種氨基酸水平在2型糖尿病早期就會(huì)出現(xiàn)異常升高的現(xiàn)象[30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組大鼠血清異亮氨酸和纈氨酸水平上升，說(shuō)明糖尿病大鼠血糖利用不足，蛋白質(zhì)分解代謝增強(qiáng)而合成代謝減弱，生糖氨基酸被大量消耗，含量降低。

本研究表明，高脂高糖飲食聯(lián)合兩次小劑量STZ腹腔注射可成功建立2型糖尿病動(dòng)物模型。多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)DM組大鼠血清中眾多代謝物濃度與NC組相比均發(fā)生了較大變化。其中DM組大鼠血清丙氨酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸水平降低，說(shuō)明DM組大鼠體內(nèi)可能存在氨基酸、核苷酸和三羧酸循環(huán)代謝的異常。LBP干預(yù)DM組大鼠一個(gè)月后，在大鼠血清中既有相同標(biāo)記物，也有不同標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)，LBP可以使得DM大鼠血清中相同的生物標(biāo)記物向正常水平變化，表明LBP有利于DM組大鼠氨基酸、核苷酸以及三羧酸循環(huán)代謝的恢復(fù)。

[1] 賈偉, 蔣健, 劉平, 等. 代謝組學(xué)在中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系研究中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2006, 31(8): 621-624. DOI:10.3321/ j.issn:1001-5302.2006.08.001.

[2] 賈偉. 醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2011: 1-16.

[3] JIYE A, TRYGG J, GULLBERG J, et al. Extraction and GC/MS analysis of the human blood plasma metabolome[J]. Analytical Chemistry, 2005, 77(24): 8086-8094. DOI:10.1021/ac051211v.

[4] XIAO Y P, WU T X, HONG Q H, et al. Response to weaning and dietary l-glutamine supplementation: metabolomic analysis in piglets by gas chromatography/mass spectrometry[J]. Journal of Zhejiang University: Science B, 2012, 13(7): 567-578. DOI:10.1631/jzus. B1100343.

[5] BIRKEMEYER C, KOLASA A, KOPKA J. Comprehensive chemical derivatization for gas chromatography-mass spectrometry-based multi-targeted profiling of the major phytohormones[J]. Journal of Chromatography A, 2003, 993(1/2): 89-102. DOI:10.1016/S0021-9673(03)00356-X.

[6] SCHMELZ E A, ENGELBERTH J, ALBORN H T, et al. Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100(18): 10552-10557. DOI:10.1073/ pnas.1633615100.

[7] CHI A P, ZHANG Y, KANG Y J, et al. Metabolic mechanism of a polysaccharide from Schisandra chinensis to relieve chronic fatigue syndrome[J]. Journal of Biological Macromolecules, 2016, 93: 322-332. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2016.08.042.

[8] NI Y, SU M M, QU Y P, et al. ADAP-GC 3.0: improved peak detection and deconvolution of co-eluting metabolites from GC/TOF-MS data for metabolomics studies[J]. Analytical Chemistry, 2016, 88(17): 8802-8811. DOI:10.1021/acs.analchem.6b02222.

[9] WANG G M, SHI D D, PENG Z X, et al. Study on mechanism of costunolide-induced apoptosis in breast cancer MCF-7 cells[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2015, 43(5): 682-688.

[10] 郭琦. 枸杞多糖的提取、分離純化、溶液性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)的初步研究[D]. 西安: 陜西師范大學(xué), 2012: 1-10.

[11] 孫桂菊, 張勇, 黃杰, 等. 枸杞多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2006, 28(1): 47-50. DOI:10.3321/ j.issn:0512-7955.2006.01.013.

[12] ZOU S, ZHANG X, YAO W B, et al. Structure characterization and hypoglycemic activity of a polysaccharide isolated from the fruit of Lycium barbarum L.[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 80: 1161-1167. DOI:10.1016/j.carbpol.2010.01.038.

[13] 孫桂菊, 王少康, 張勇, 等. 枸杞多糖、茶葉多糖混合物對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠降血糖作用及對(duì)糖尿病并發(fā)癥相關(guān)指標(biāo)的影[J]．食品研究與開發(fā), 2003, 24(2): 75-78. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2003.02.033.

[14] LUO Q, CAI Y, YAN J, et al. Hypoglycemic and hypolipidemic effects and antioxidant activity of fruit extracts from Lycium barbarum[J]. Life Science, 2004, 76(2): 137-149. DOI:10.1016/j.lfs.2004.04.056.

[15] LI X M. Protective effect of Lycium barbarum polysaccharides on streptozotocin-induced oxidative stress in rats[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2007, 40: 461-465. DOI:10.1016/ j.ijbiomac.2006.11.002.

[16] 蔡慧珍, 劉?？? 盧慧霞, 等. 枸杞多糖對(duì)2型糖尿病病人的短期干預(yù)[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(13): 259-262.

[17] 田曉華, 叢建波, 孫存普, 等. 氧化苦參堿清除·OH自由基作用及對(duì)胸腺嘧啶核苷酸輻射防護(hù)作用的ESR研究[J]. 解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 1996, 14(6): 412-415.

[18] 陳忱, 蔡慧珍, 唐華麗, 等. 枸杞多糖的組成分析及其熒光標(biāo)記研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2014, 25(10): 2312-2315. DOI:10.3969/ j.issn.1008-0805.

[19] 劉源才, 孫細(xì)珍, 許銀, 等. 枸杞多糖組成及含量測(cè)定方法的改進(jìn)[J].食品科學(xué), 2013, 34(12): 292-295. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201312060.

[20] 蔡慧珍. 枸杞多糖對(duì)人胰島素抵抗及血脂的干預(yù)作用及其機(jī)制[D].南京: 東南大學(xué), 2012: 38-42.

[21] 宗燦華, 田麗梅. 枸杞多糖對(duì)2型糖尿病大鼠胰島素抵抗及脂聯(lián)素基因表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2008, 14(6): 531-532. DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2008.06.014.

[22] TANG H L, CHEN C, WANG S K, et al. Biochemical analysis and hypoglycemic activity of a polysaccharide isolated from the fruit of Lycium barbarum L.[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 77: 235-242. DOI:10.1016/ j.ijbiomac.2015.03.026.

[23] JIA W P. Diabetes: a challenge for China in the 21st Century[J]. Lancet Diabetes Endocrinol, 2014, 2(4): 6-7. DOI:10.1016/S2213-8587(14)70027-0.

[24] ZIMMET P Z, MAGLIANO D J, HERMAN W H, et al. Diabetes: a 21st Century challenge[J]. Lancet Diabetes Endocrinol, 2014, 2(1): 56-64. DOI:10.1016/S2213-8587(13)70112-8.

[25] BAO Yuqian, ZHAO Tie, WANG Xiaoyan, et al. Metabonomic variations in the drug-treated type 2 diabetes mellitus patients and healthy volunteers[J]. Journal of Proteome Research, 2009, 8(4): 1623-1630. DOI:10.1021/pr800643w.

[26] 郭準(zhǔn)霄, 張俊清, 董愛(ài)梅. 2型糖尿病患者血漿氨基酸濃度的變化及其與血糖和胰島素的關(guān)系[C]//北京醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病暨內(nèi)分泌學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì). 北京: 北京大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科, 2012: 292-293.

[27] 皮子鳳, 門麗慧, 張靜, 等. 五味子治療大鼠糖尿病腎病作用機(jī)制的血清代謝組學(xué)研究[J]. 分析化學(xué), 2015, 43(2): 169-175. DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.140564.

[28] 張啟云, 湯喜蘭, 李冰濤, 等. 黃連總生物堿對(duì)糖尿病大鼠的血漿代謝組學(xué)研究[J]. 中藥藥理與臨床, 2013, 29(6): 42-44.

[29] 寧萌, 李田樂(lè), 段大為, 等. 2型糖尿病早期大鼠血清代謝組學(xué)分析[J].生物醫(yī)學(xué)工程與臨床, 2016, 20(2): 131-135.

[30] NEWGARD C B, AN J, BAIN J R, et al. A branched-chain amino acid-related metabolic signature that differentiates obese and lean humans and contributes to insulin resistance[J]. Cell Metabolism, 2009, 9(4): 311-326. DOI:10.1016/j.cmet.2009.02.002.

Serum Metabonomics Study of Type 2 Diabetic Rats Administrated with Lycium barbarum Polysaccharides

TANG Huali1,2, XIA Hui1, WANG Feng1, SUN Guiju1,*
(1. Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China; 2. School of Life Science and Engineering, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404000, China)

Gas chromatography-time of flight-mass spectrometry (GC-TOF-MS) was employed for serum metabolite profiling of rats in the control group (NC), type 2 diabetic model group (DM) and Lycium barbarum polysaccharides (LBP group) treatment groups. Principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) were used for clustering serum metabolite profiles and finding potential biomarkers. The results demonstrated that the three groups were successfully separated and serum alanine and thymidine were decreased in the DM group as compared to the NC group. One-month intervention with LBP could increase the levels of alanine and thymidine in serum of type 2 diabetic rats, which may be associated with their amino acid and nucleotide metabolism. These results can provide a reference for further study of the hypoglycemic mechanism of LBP.

Lycium barbarum polysaccharides; type 2 diabetes mellitus; metabonomics; biomarker

10.7506/spkx1002-6630-201713027

TS201.4

A

1002-6630（2017）13-0160-07

唐華麗, 夏惠, 王鋒, 等. 枸杞多糖作用于2型糖尿病大鼠的血清代謝組學(xué)研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(13): 160-166.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713027. http://www.spkx.net.cn

TANG Huali, XIA Hui, WANG Feng, et al. Serum metabonomics study of type 2 diabetic rats administrated with Lycium barbarum polysaccharides[J]. Food Science, 2017, 38(13): 160-166. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201713027. http://www.spkx.net.cn

2016-05-31

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273069）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目（KYLX_0205）；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2016jcyjA0522）；重慶市教委項(xiàng)目（KJ1601008）

唐華麗（1982—），男，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)物與食品功效。E-mail：tanghuali58@163.com

*通信作者：孫桂菊（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)物與食品功效。E-mail：gjsun@seu.edu.cn