劉 兵，夏秀芳，孔保華*，孫方達，韓 齊，李龍祥（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

豬血制備的纖維蛋白原黏結劑對重組牛肉品質的影響

劉 兵，夏秀芳，孔保華*，孫方達，韓 齊，李龍祥
（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

將纖維蛋白原作為黏結劑應用于重組牛肉中，其中以2.0%血漿蛋白粉、0.3%復合磷酸鹽、0.5% NaCl及4.0%水為基礎，分別添加0.0%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的纖維蛋白原混合。測定重組肉的色差、水分活度及解凍損失，通過質構儀測定纖維蛋白原添加量及凝結時間對黏結力的影響，同時應用低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術研究纖維蛋白黏結過程中水分子的遷移變化規(guī)律，并通過掃描電子顯微鏡對比以谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TG）與纖維蛋白原為黏結劑的重組肉微觀結構。結果表明，隨著纖維蛋白原添加量的不斷增加，重組肉的水分活度稍有降低但不顯著（P＞0.05）、解凍損失率顯著減少（P＜0.05）、產品的紅度值顯著增加（P＜0.05），亮度值有所減弱；重組肉的黏結力隨纖維蛋白原添加量及凝結時間的延長而顯著增大（P＜0.05）。同時，LF-NMR研究結果顯示，纖維蛋白原的添加增加了重組肉黏結過程中水分子的移動性，對重組肉中水分子的束縛能力逐漸增強；電子顯微鏡檢測結果顯示，以纖維蛋白原為黏結劑的重組肉比以TG為黏結劑的重組肉微觀結構更緊密。上述結果表明，纖維蛋白原可以作為黏結劑應用于重組牛肉加工。

纖維蛋白原；血漿蛋白粉；復合磷酸鹽；低場核磁共振

肉及肉制品的重組技術起源于20世紀60年代，而黏結劑在重組制備中起到關鍵的作用。黏結劑可以把肉品生產及加工過程中產生的低價值碎肉進行重組，從而形成消費者可接受的高品質產品肉。比較常見的重組肉制品如重組牛排、羊排及烤肉，近幾年重組肉產品也趨向于魚類產品。黏結劑一般可通過在肉中形成大分子的網(wǎng)狀結構，減少肉及肉制品的營養(yǎng)和風味的損失，并減少水分滲出[1]。纖維蛋白原早期作為一種商品化的醫(yī)用生物材料受到重視，其可使分離的機體組織更容易結合在一起。并且血液中來源的纖維蛋白由于具有生物相容性及可生物降解性，不引起炎癥、異物反應、組織壞死或廣泛的纖維變性，所以纖維蛋白原已被廣泛應用于臨床，起到其他生物或合成黏結材料所無法比擬的效果[2]。

在肉類生產中，有研究表明血液中的蛋白質具有良好的功能性質，特別是具有較好的溶解性、凝膠性和乳化能力，其中纖維蛋白原起主要的黏結作用[3-4]。血漿蛋白粉與纖維蛋白原可以作為黏結劑的原因，是因為它們在加熱過程中可以形成蛋白凝膠，纖維蛋白凝膠可以起到黏合、封閉的作用[5]。Lennon等[6]利用纖維蛋白原制作重組豬肉風干火腿，并確定了不同鹽添加量對其穩(wěn)定性的影響，結果顯示添加纖維蛋白原的產品具有較高的黏結力。目前工業(yè)生產中比較常見黏結劑主要包括微生物來源的轉谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）和海藻酸鹽類（多糖物質，其一般與兩價離子結合使用）兩類，然而它們有一定的不足。由于TG成本高，不能用于重組肉的大規(guī)模生產。有研究表明使用海藻酸鹽制備重組肉會降低產品的感官質量；與TG制備的重組肉相比，海藻酸鹽制備的產品不能形成均勻的肌肉紋理，并且產品風味有所減弱[7]。在重組肉的加工中，一般將纖維蛋白原與血漿蛋白粉混合使用，促進纖維蛋白原形成纖維蛋白凝膠，從而使碎肉達到重組的目的[8]。復合磷酸鹽為保水劑，有研究表明NaCl質量分數(shù)小于或等于1%時，有助于纖維蛋白凝膠形成[9-10]。

目前關于纖維蛋白原在重組肉中的應用研究相對較少，本實驗主要通過將纖維蛋白原與血漿蛋白粉復配為黏結劑，通過在重組牛肉中添加不同質量分數(shù)的纖維蛋白原，測定重組肉顏色、黏結力及水分子遷移等指標，探討纖維蛋白原的添加量對重組肉品質的影響。本實驗可為纖維蛋白原在重組肉中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

碎牛肉、食用鹽 哈爾濱市好又多超市；血漿蛋白粉、豬血漿 天津寶迪農業(yè)科技（集團）股份有限公司；復合磷酸鹽（三聚磷酸鹽、焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉） 黑龍江省豐達食品配料有限公司；TG 泰興市一鳴生物制品有限公司。

1.2 儀器與設備

FE20K pH計 上海梅特勒-托利多儀器設備有限公司；Aqua Lab水分活度測定儀、JD500-2電子天平沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；ZE-6000 電子色差儀日本電色工業(yè)株式會社；TA-XT Plus質構分析儀適配探頭A/SPR、Mq-20低場核磁共振分析儀 德國布魯克公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 纖維蛋白原的制備

參照李敏康等[11]的方法，利用纖維蛋白原在低溫條件下可形成絮狀沉淀的性質，采用凍融法從血漿中提取纖維蛋白原。提取方法為：將抗凝血漿在－20 ℃條件下冷凍12 h，經(jīng)4 ℃解凍后4 ℃、3 000 r/min離心15 min，獲得濃縮纖維蛋白原沉淀。使用時需提前在室溫條件下緩化、切碎均質成糜狀后加入重組肉中。

1.3.2 重組肉的制作

將去除筋膜、筋腱的100g碎牛肉，切成1.0～2.0 cm3的肉塊，按照肉塊質量添加質量分數(shù)2%血漿蛋白粉、0.3%復合磷酸鹽及0.5% NaCl為配料，添加不同質量分數(shù)（0.0%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）的纖維蛋白原，混合均勻。4 ℃腌制1.5 h，經(jīng)模具施加壓力后成型，放入－23 ℃冰箱里儲藏后，于4 ℃冰箱中緩化，成品待檢測。

以TG為黏結劑的重組肉制作方法，將去除筋膜、筋腱的100 g碎牛肉，切成1.0～2.0 cm3的肉塊，按照肉塊質量添加質量分數(shù)0.2% TG、質量分數(shù)0.3%酪蛋白酸鈉、質量分數(shù)0.3%復合磷酸鹽及質量分數(shù)0.5% NaCl為配料，混合均勻。4 ℃腌制1.5 h，經(jīng)模具施加壓力后成型，放入－23 ℃冰箱里貯藏后，于4 ℃冰箱中緩化，成品待檢測。

1.3.3 顏色的測定

色差計可測定物體本身的顏色和光澤及各檢測樣品之間的色度差值。L*值表示樣品的亮度值，該值越大，表示產品的光澤越好；a*值表示樣品的紅度，該值越大，說明產品顏色越紅。將重組牛肉切成2 cm×2 cm×2 cm的肉塊，在生鮮狀態(tài)下使用ZE-6000色差計測定。使用O/D測試頭，白板色度值L*值=96.22，a*值=6.03，b*值=15.06。每個樣品取3 個平行樣，經(jīng)色差儀檢測后，取平均值。

1.3.4 水分活度的測定

水分活度在智能型水分活度儀中進行測定，每個樣品測定3 次。

1.3.5 解凍損失率的測定

根據(jù)Serrano等[12]略有改動，將重組牛肉切成3 cm×3 cm×2 cm 的肉塊，稱肉質量（m0/g），室溫條件下解凍后，用濾紙吸去表面的水分，稱量肉質量（m1/g），解凍損失率（thawing loss，TL）用公式（1）計算。

1.3.6 黏結力及黏結時間的測定

利用質構儀測定重組肉的黏結力，將冷凍后的重組肉制品取出，在4 ℃冰箱中解凍，在中心溫度達到0 ℃時將肉樣切片（9 cm×2.5 cm×0.5 cm），并用拉斷力表示黏結力。質構儀參數(shù)設定：取探頭A/SPR在質構儀（力臂25 kg）進行拉伸實驗，測試速率為1.0 mm/s，測試前后速率為2.0 mm/s，測試模式為Noodle tension，感應力為5 g，斷裂感應力20 g。因為拉斷樣品所需的最大黏結力與樣品的橫截面積有很大關系，如果樣品的截面積越大，則所需的拉力就越大。

并利用計時器測定不同黏結時間。重組肉黏結操作開始到形成穩(wěn)定的黏結狀態(tài)所需要的時間定義為黏結時間。因此，取肉片被拉斷瞬間所達到的最大黏結力Fmax/（N/cm2），即肉片的拉斷應力表示肉片的黏結強度，測定達到最大黏結力所用的黏結時間t/h。重組肉的黏結速率K用公式（2）計算。

1.3.7 應用低場核磁共振技術測定重組肉不同試樣水分子的運動狀態(tài)

參照Aursand等[13]的方法并略作修改，采用低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術，將解凍的重組生肉切碎放在專用的測定試管中（試管直徑1.8 cm、高度18 cm），LF-NMR分析儀的磁場強度為0.47 T，質子共振頻率為20 MHz。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）程序測定纖維蛋白的橫向弛豫時間T2，對于每一個樣品，測定時自動掃描8 次，每次掃描重復的間隔時間為2 s。測定后的每個樣品的T2，通過Contin軟件進行反演，反映出相應的弛豫時間（T21、T22和T23），分析水分子在重組肉中的運動情況。

1.3.8 重組肉黏結部位的微觀結構測定

通過掃描電子顯微鏡分析，對比采用TG和采用纖維蛋白原作為黏結劑加工的重組肉黏結部位的微觀結構。將凝膠樣品切成盡可能薄的薄片（厚度約1～2 mm）后進行實驗。首先將樣品浸泡在2.5% pH 6.8的戊二醛溶液內過夜進行固定，然后使用0.1 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液洗滌樣品，共洗滌樣品3 次，每次10 min。之后將樣品分別用體積分數(shù)為50%、70%、80%、90%的乙醇浸泡脫水處理，接著進行樣品的二次脫水，二次脫水則使用100%乙醇，二次脫水共需要3 次，每次10 min，然后再將樣品浸泡在氯仿中脫脂1 h后用按乙醇與叔丁醇1∶1的比例置換一次，最后放入冷凍干燥儀中[14-15]。然后挑選截面平緩的樣品黏貼在掃描電子顯微鏡專用的臺面上，黏貼好后對樣品表面噴金待檢。樣品形成的網(wǎng)狀結構的放大倍數(shù)分別選擇：100、500 倍及1 000 倍。掃描電子顯微鏡加速電壓為5 kV。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 重組牛肉顏色、水分活度及解凍損失率的變化

表1 不同質量分數(shù)纖維蛋白原對重組牛肉的顏色、水分活度（aw）及解凍損失率的影響Table 1 Effect of fibrinogen concentration on color, water activity and thawing loss of restructured beef

由表1可以看出，隨著纖維蛋白原的添加量逐漸增多，重組肉的L*值明顯降低，且差異顯著（P＜0.05），其中纖維蛋白原添加量為2.0%和2.5%時差異不顯著（P＞0.05），重組肉的a*值明顯增高，其中纖維蛋白原添加量0.0%、1.0%、1.5%差異不顯著（P＞0.05），0.0%與2.0%相比差異性顯著（P＜0.05），0.0%與2.5%相比差異顯著（P＜0.05），重組肉的b*值稍有降低但差異不顯著（P＞0.05），分析由于從血漿中提取纖維蛋原，纖維蛋白原離心沉淀中可能存有少量的血紅素蛋白，從而導致以纖維蛋白原形成的重組肉的L*值和a*值的改變。另一種方面是添加的纖維蛋白原進入重組肉后形成的纖維蛋白凝膠可以有效地阻止重組肉中的汁液（包括血紅蛋白）的流失，從而與不能形成的凝膠的對照樣相比，重組肉顏色更好。

aw是指食品中水分存在的狀態(tài)，即水分與食品結合程度（游離程度）。aw值越高，結合程度越低，aw值越低，結合程度越高。隨著纖維蛋白原添加量的增加，重組肉的aw值稍有降低但差異不顯著（P＞0.05）。說明纖維蛋白原的添加促使水分與肌肉纖維結合程度越高。

由表1還可以看出，隨著纖維蛋白原添加量的逐漸增加，重組肉的解凍損失率逐漸降低且差異顯著（P＜0.05），這可能是由于纖維蛋白凝膠可以形成大的三維網(wǎng)狀結構，這些網(wǎng)狀結構可以有效地抑制重組肉在解凍過程中營養(yǎng)成分的流失。以上研究結果與Chen[16]、Aguilera[17]等報道纖維蛋白作為黏結劑可以形成大分子網(wǎng)狀結構的纖維蛋白凝膠，這種凝膠可以有效地阻止肉制品中的水分、風味以及營養(yǎng)物質的流失相似。

2.2 重組牛肉黏結力的變化

圖1 不同質量分數(shù)纖維蛋白原及不同黏結時間對重組肉黏結力的變化Fig. 1 Effect of fibrinogen concentration and binding time on binding strength of restructured beef

圖1 表示在黏結時間超過7.0 h后重組肉黏結力的變化趨勢圖，可以看出隨纖維蛋白原添加量逐漸增加，重組肉的黏結力逐漸增大，且在同一黏結時間內纖維蛋白原添加量2.0%、2.5%與1.0%、1.5%黏結力變化不明顯。不添加纖維蛋白原的重組肉沒有黏結力。

從黏結時間（0～7 h）進行分析得到，在同一纖維蛋白原添加量時，隨著黏結時間的延長黏結力明顯增大，并且1.0%和1.5%纖維蛋白原添加量時，5.5 h后黏結力達到穩(wěn)定，而2.0%和2.5%纖維蛋白原添加量時，6.0 h后黏結力達到穩(wěn)定。這與Herrero等[18]研究結果類似。沒有添加纖維蛋白原的對照樣由于不能形成纖維蛋白凝膠，因此沒有黏結性。并且隨著纖維蛋白原添加量的增加，纖維蛋白形成凝膠的交聯(lián)反應不斷增強，凝膠形成的速度加快，纖維蛋白凝膠增多，從而黏結力增大。纖維蛋白聚合形成凝膠或凝塊，由于其形成的三維網(wǎng)狀結構，這種結構承受一定的機械外力[18]。并且Ryan[7]、Weisel[19]等也發(fā)現(xiàn)纖維蛋白凝膠具有一定剛性及硬度，隨黏結時間延長纖維蛋白凝膠強度越大。

表2 不同質量分數(shù)纖維蛋白原重組肉的最大黏結力及黏結速率的變化Table 2 Effect of fibrinogen concentration on maximum binding strength and binding rate restructured beef

表2顯示在黏結時間充分的情況下，添加不同質量分數(shù)的纖維蛋白原重組肉所達到的最大黏結力及黏結速率變化。隨著纖維蛋白原添加量的增加，重組肉的最大黏結力逐漸增大，且差異顯著（P＜0.05），與對照樣相比添加纖維蛋白原組重組肉黏結力差異顯著（P＜0.05）。且當纖維蛋白原添加量達到2.5%時黏結力達到最大0.46 N/cm2，黏結速率表示纖維蛋白黏合劑在重組肉中纖維蛋白凝膠形成的速率，由表2可以看出，當纖維蛋白原添加量達到2.5%時，凝膠形成速率最大可以達到0.10 N/（cm2·h）。

2.3 重組肉不同試樣水分子的運動狀態(tài)之間的比較

LF-NMR是磁場強度在0.5 T以下進行的核磁共振，主要通過對縱向弛豫時間T1（自旋-晶格），橫向弛豫時間T2（自旋-自旋）和自擴散系數(shù)的測量，反映出質子（1H）的運動性質，因此可用于分析纖維蛋白原在凝膠過程中水分子的運動情況[20]。由于本實驗的研究對象是重組肉中纖維蛋白凝膠體系中，弛豫時間T21對樣品的多孔性特別敏感，弛豫時間T21越大樣品的孔細越大[21]。因此，通過橫向弛豫時間T21分析纖維蛋白凝膠在黏結過程中水分子的運動情況[22-23]。

圖2 不同質量分數(shù)纖維蛋白原重組肉橫向弛豫時間的變化Fig. 2 Effect of fibrinogen concentration on transverse relaxation time spectrum of water in restructured beef

圖2 為添加不同質量分數(shù)纖維蛋白原的重組肉弛豫時間變化圖?？梢钥闯鰞蓚€峰范圍，T21（10～100 ms）不易流動水和T22（100～1 000 ms）自由水。重組肉中隨著纖維蛋白原添加量的增加，T21橫向弛豫時間逐漸縮短，隨著纖維蛋白原添加量的增大向左偏移，表明纖維蛋白原形成的纖維蛋白凝膠與重組肉交聯(lián)越來越致密，T22弛豫時間逐漸延長，且隨著纖維蛋白原添加量的增大向右偏移，表明形成的纖維蛋白凝膠可以有效地阻隔外界自由水的進入。

表3 添加纖維蛋白原對重組肉橫向弛豫時間值及峰面積的影響Table 3 Effect of fibrinogen concentration on transverse relaxation time and peak area of water in restructured beef

由表3中T21可以看出，重組肉中隨著纖維蛋白原添加量的逐漸增多，弛豫時間逐漸縮短，0.0%及1.0%相比差異顯著（P＜0.05），纖維蛋白原添加量1.5%、2.0%及2.5%弛豫時間逐漸減小，但差異不顯著（P＞0.05）。A21峰面積逐漸減小且差異顯著（P＜0.05），T22弛豫時間逐漸延長，但差異不顯著（P＞0.05）。這與Herrero等[24]通過拉曼光譜及成像低場核磁結果類似，從橫向弛豫時間縮短分析，可能是由于添加纖維蛋白原后，肌纖維間形成致密的纖維蛋白凝膠結構，使分子間的作用力變強，對水的束縛作用增高，水分子的運動性減弱，從而導致弛豫時間減小。有研究表明[25]重組肉中纖維蛋白凝膠形成，改變了肌肉的結構，減少了α-螺旋及疏水作用，增加無序結構，蛋白結構的改變導致蛋白與蛋白之間和蛋白與水之間相互作用力的改變，從而間接使纖維蛋白凝膠對水的束縛作用增強。

2.4 重組肉微觀結構的對比

經(jīng)對比后選擇2%纖維蛋白原作為最優(yōu)添加量制作重組牛肉。TG黏結劑在重組肉中的應用原理是其可催化蛋白中谷氨酰胺和賴氨酸殘基發(fā)生?；D移反應，從而使蛋白質之間發(fā)生交聯(lián)[26]，且肌肉中的肌球蛋白和肌動蛋白都是較適合TG作用的底物，經(jīng)TG的催化肌肉蛋白分子間可以形成致密的三維網(wǎng)狀結構[28-29]。而纖維蛋白原黏合結劑是血漿來源的復合制劑，它是通過模擬血凝的最后反應階段，形成半剛性纖維蛋白凝塊從而使碎肉重組[25]。

圖3 TG與纖維蛋白原形成重組肉的三維網(wǎng)狀掃描電子顯微鏡圖Fig. 3 Three-dimensional network microstructure of restructured beef formed by TG and fibrinogen observed under SEM

由圖3可以看出，100 倍電子顯微鏡圖顯示出肌肉纖維間纖維蛋白凝膠的黏結區(qū)域，從500 倍電子顯微鏡圖觀察到同種肌纖維間TG黏結連接區(qū)域相對比較大，1 000 倍組電子顯微鏡圖中觀察到傳統(tǒng)的TG黏結劑在重組肉中形成的網(wǎng)狀結構，肌肉纖維之間的蛋白交聯(lián)網(wǎng)中網(wǎng)絲比較粗糙，網(wǎng)狀結構之間空隙明顯，并且內部有鏤空縫隙。圖3b3顯示，纖維蛋白原在重組肉中肌肉纖維之間可以形成均勻地有規(guī)律的區(qū)域，在區(qū)域之間纖維蛋白形成類網(wǎng)狀的結構與肌肉纖維交織在一起，網(wǎng)絲之間空隙及鏤空縫隙相對較少，并且隨著掃描倍數(shù)的加大，可以看到在交織在肌肉纖維之間的三維網(wǎng)狀結構擁有更高的密集度。Herrero等[24]也通過核磁成像設備觀察，證實纖維蛋白凝膠在可以形成致密的三維網(wǎng)狀結構。

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3 結 論

在重組肉中，纖維蛋白原形成的纖維蛋白凝膠的三維網(wǎng)狀結構優(yōu)于TG，且纖維蛋白凝膠具有有效地防止重組肉中營養(yǎng)及水分的流失等優(yōu)點，因此纖維蛋白原可以作為黏結劑應用于重組肉加工。纖維蛋白凝膠形成的穩(wěn)定時間為6.0 h，且根據(jù)重組肉的顏色、水分活度、解凍損失率、黏結力及水分遷移變化，并結合纖維蛋白原提取工藝，當纖維蛋白原添加量達到2.0%時，重組牛肉具有較高的品質，此時，可得到重組肉的最大黏結力為0.45 N/cm2，黏結速率為0.09 N/（cm2·h）。

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Effect of Porcine Fibrinogen as Binder on the Quality of Restructured Beef

LIU Bing, XIA Xiufang, KONG Baohua*, SUN Fangda, HAN Qi, LI Longxiang
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

This study investigated the application of combinations of different amounts (0.0%, 1.0%, 1.5%, 2.0% and 2.5%) of porcine fibrinogen with 2.0% plasma protein, 0.3% compound phosphate, 0.5% NaCl, and 4.0% water as a binder in restructured beef. The effects of fibrinogen concentration on the color parameters (L*, a* and b*), water activity and thawing loss of restructured beef were studied, and the binding strength was measured with a texture analyzer as a function of fibrinogen concentration and binding time. Besides, the mobility of water molecules during the binding process was examined by low-field nuclear magnetic resonance (LF-NMR). The microscopic structure of restructured beef made with tansglutaminase (TG) and fibrinogen as a binder was investigated by scanning electron microscopy (SEM). The results showed that increasing the fibrinogen concentration could slightly reduce water activity without statistical significance (P ＞ 0.05), significantly decrease thawing loss (P ＜ 0.05), significantly increase color a* value (P ＜ 0.05), and lower color L* value. The binding strength significantly increased with increasing binding time in the tested range (P ＜ 0.05). At the same time, the results of LF-NMR showed that fibrinogen could increase the mobility and binding of water molecules in restructured beef. SEM examination showed that fibrinogen provided more compact microstructure of restructured beef than TG. Therefore, fibrinogen can be used as a binder in restructured beef.

fibrinogen; plasma protein; compound phosphate; low-field nuclear magnetic resonance (LF-NMR)

10.7506/spkx1002-6630-201713021

TS251.93

A

1002-6630（2017）13-0125-06

劉兵, 夏秀芳, 孔保華, 等. 豬血制備的纖維蛋白原黏結劑對重組牛肉品質的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(13): 125-130. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713021. http://www.spkx.net.cn

2016-05-27

黑龍江省應用技術研究與開發(fā)重點計劃項目（GA15B302）

劉兵（1990—），男，碩士研究生，研究方向為畜產品加工。E-mail：897983806@qq.com

*通信作者：孔保華（1963—），女，教授，博士，研究方向為畜產品加工。E-mail：kongbh@163.com

LIU Bing, XIA Xiufang, KONG Baohua, et al. Effect of porcine fibrinogen as binder on the quality of restructured beef[J].

Food Science, 2017, 38(13): 125-130. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201713021. http://www.spkx.net.cn