腐植酸紫外—熒光特性及生物農藥制備的研究

方冬冬 王 杰 周霞萍*

(華東理工大學資源與環(huán)境工程學院 上海 200237)

泥炭和褐煤是腐植酸的主要來源。通過紫外-熒光光譜分析等可差異性地表征泥炭、褐煤中的黑腐酸、棕腐酸和黃腐酸。腐植酸具有多種生物活性組分，利用工程化的分枝桿菌可定向降解得到某些甾類化合物，利用特異性酵母菌的異源合成可得到萜類和腐植酸萜類組分，通過濃縮、分離、純化等處理工藝，可以制備具有抗菌，改善植物營養(yǎng)條件的生物農藥。

腐植酸 紫外-熒光分析 生物農藥

定向降解是一種在催化劑(酶)反應的條件下，利用鍵能的強弱，將原物質中存在的結構單元或明確的化合物質選擇性的反應解析或解離出來。運用分枝桿菌等代謝工程微生物的轉化技術，將泥炭、褐煤中的黑腐酸降解轉化為棕腐酸組分，同時探索各種甾類化合物轉化為結構單一的甾類藥物或藥物中間體，可便于甾類物質的高效提取，同時實現(xiàn)甾類物質的高值化利用，是很有意義的。

異源合成通過構建目的產物的重組微生物工程菌，利用微生物發(fā)酵來生產珍稀萜類等，而且效果呈幾何級倍增。腐植酸原產植物的珍稀萜產量極低，直接提取效率低、成本也高。而通過微生物的代謝工程技術，以及微生物對萜類物質的高效特異性富集和轉化，實現(xiàn)腐植酸中珍稀萜類化合物的高效提取和高值化利用，是一個極富挑戰(zhàn)性的研究領域。萜類化合物作為生物農藥的組成部分，具有抑制有害菌群生長、改善自然界碳循環(huán)等作用。

裂解-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術被應用于研究腐植酸大分子的結構組成特征。但是，直接用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術研究腐植酸的組成特征還是比較少的[1]。本文通過氣相色譜-質譜聯(lián)用技術、紅外、紫外-可見、分子熒光光譜等表征腐植酸降解產物中某些甾類成分和性質，以及表征酵母菌異源合成的某些腐植酸萜類。并在此基礎上[2]，進行腐植酸生物農藥的制備研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

泥炭：取自云南中電新能源有限公司；

褐煤：取自云南德坤生物科技有限公司(泥炭、褐煤工業(yè)分析和元素分析如表1所示)；

金銀花秸稈：取自上海崇明前進農場，作風干處理；

果皮、果渣：為市售巨峰葡萄的殘余物；

乙醇、乙酸乙酯、葡萄糖等試劑，均采用華東理工大學采購的分析純藥品；

分枝桿菌(Mycobacterium)：華東理工大學魯華生物技術研究所提供的工程菌株；

酵母菌(Saccharomyces)：上海立波啤酒廠提供菌種后，由華東理工大學魯華生物技術研究所改性。

表1 原料分析Tab.1 Analysis of raw materials

1.2 腐植酸的化學表征

根據(jù)在不同溶劑中的溶解度，將腐植酸分為黃腐酸、棕腐酸和黑腐酸。實驗采用不同溶劑對泥炭、褐煤進行溶解，超聲波振蕩，過濾，精制。所得樣品通過Varian Cary 60型紫外-可見分光光度計，確定激發(fā)波長，再用分子熒光光譜儀測定熒光強度，掃描速度為1000 nm/min，掃描光譜儀器自動進行校正。

1.3 由腐植酸得到的甾類、萜類的分析

1.3.1 甾類的分析

實驗選用工程化分枝桿菌(Mycobacterium)，菌株培養(yǎng)至OD600為2～3，甘油濃度50%，于-40 ℃凍存。通過種子培養(yǎng)基活化，接種活化后的分枝桿菌于30 mL培養(yǎng)基中，加入滅菌后的黑腐酸，30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)7天。降解完全后，取500 μL降解產物于潔凈離心管中，加入250 μL乙酸乙酯，充分振蕩，離心9000 rpm，3 min，萃取液通過Agilent 6890-5973N，HP-5MS色譜柱( 30 m×250 μm×0.25 μm)，氣化溫度280 ℃，載氣流速 0.7 mL/min，進樣量1 μL，質譜電子能量70 eV，掃描質量范圍(m/z)33～500。

1.3.2 萜類的分析

酵母菌(Saccharomyces)作為真菌，具有成熟的真核表達系統(tǒng)，其甲羥戊酸途徑為異源萜類化合物的合成提供了前體。通過甲羥戊酸途徑，酵母菌可以高效合成萜類化合物[3，4]。利用秸稈和果皮作為泥炭、褐煤的輔助發(fā)酵原料，通過育菌和馴化等改性生物工程，在特定條件下實現(xiàn)酵母菌異源合成萜類，確定腐植酸萜類的主要成分，并比較其對膠孢炭疽菌的抑制作用。

2 結果與討論

2.1 腐植酸的熒光性質表征

腐植酸分子中含有大量的苯環(huán)、稠苯環(huán)和雜環(huán)，環(huán)之間以橋鍵連接，環(huán)及支鏈上有羧基、酚羥基、醌基、甲氧基等各種官能團，具有較特殊的熒光性質。

圖1是先根據(jù)紫外-可見吸收光譜確定了泥炭黑腐酸的最大激發(fā)波長是273 nm，褐煤黑腐酸的最大激發(fā)波長是274 nm，而后進行熒光光譜分析。從圖1可以看出，泥炭黑腐酸熒光光譜峰有較好的對稱性。隨著濃度的增加，黑腐酸的熒光強度增加，溶液中的熒光基團含量也增多，濃度達到一定程度時，黑腐酸分子聚集，導致熒光自猝滅[5]。激發(fā)波長也會隨濃度的增大而增大，出現(xiàn)輕微的紅移[6]。

圖1 不同濃度泥炭黑腐酸的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of different concentrations of humic acids from peat

實驗選用0.01%泥炭或褐煤與溶劑混合。除了濃度的影響外，溫度和pH值對黑腐酸的熒光強度也有一定的影響。當溫度升高時，分子運動速度加快，分子間碰撞概率增加，使無輻射躍遷增加，黑腐酸的熒光強度降低[7]。而在不同pH顯示的酸性溶液中，因分子和離子間的平衡改變，使熒光強度也有差異。

圖2中黑腐酸的熒光發(fā)射光譜峰值出現(xiàn)在450～480 nm之間，這是由于黑腐酸具有多種熒光發(fā)色基團[8]。圖中545 nm處為瑞利散射的倍頻峰。

從圖2可以看出，泥炭和褐煤棕腐酸在360 nm左右有熒光峰，而黃腐酸沒有。棕腐酸其余的熒光峰與黃腐酸相似，可能是因為黃腐酸也一部分溶于醇，致使棕腐酸精制樣品中含有一部分黃腐酸。從圖2還可以看出，泥炭和褐煤的黃腐酸熒光光譜也有極高的相似性。黃腐酸的發(fā)光譜峰相對棕腐酸稍有紅移，這是由于極性分子電子云對熒光分子的影響，π→π*躍遷需要的能量差ΔE減小，躍遷概率增加，使熒光光譜發(fā)生紅移，甚至猝滅。

圖2 泥炭、褐煤棕腐酸和黃腐酸的熒光圖Fig.2 Fluorescence spectra of humic acids, hymatomelanic acids and fulvic acids

2.2 腐植酸甾類農藥的分析及制備

泥炭腐植酸具有多種生物活性成分，通過工程化分枝桿菌的定向降解，得到的結果如圖3所示。

圖3 分枝桿菌降解前后的泥炭腐植酸GC/MS分析Fig.3 GC/MS analysis of samples before and after the microbial degradation

圖3顯示的是泥炭腐植酸降解前后的色譜總離子流圖。在降解產物中共檢測出20多種物質，包括烷烴、有機酸、酮、醇、酯、萜類和甾類化合物。根據(jù)峰面積歸一化法測定各成分的相對百分含量。相比腐植酸降解前，定向降解后的萃取液中檢出多種新物質，其出峰時間在25 min左右，分子量在239～446，這些小分子物質是腐植酸的大分子物質經分枝桿菌降解生成的。

烷基取代苯酚是腐植酸中常見的化合物，一般認為苯酚類物質可能來源于蛋白質、聚羧酸、碳水化合物或木質素等。降解前，出峰時間為15.62 min的物質為2，4-二叔丁基苯酚，相對含量為1.15%，降解后，其相對含量為2.46%，可解釋為腐植酸在分枝桿菌定向降解過程中，部分黑腐酸組分降解為棕腐酸級分，包括2，4-二叔丁基苯酚成分。張新慧等考察2，4-二叔丁基苯酚對植物根際微生物生長的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度的2，4-二叔丁基苯酚能促進土壤微生物數(shù)量的顯著增加[9]。

降解產物中檢出一些含氮物質，可表明氨基酸、蛋白質和多糖等物質參與了泥炭腐植酸的形成。這些含氮物質可以為植物提供營養(yǎng)，促進植物生長。在出峰時間21.66 min處，檢出有淚杉醇，相對含量為2.27%，這是一種雙環(huán)二萜類化合物，可干擾細菌代謝，達到抗菌效果。同時檢出類似豆甾醇結構的物質，出峰時間為24.49 min，在農業(yè)生產中，豆甾醇可以作為農業(yè)除草劑和殺蟲劑的原料，抑制黃瓜炭疽病、小麥赤霉病、玉米大斑病孢子萌發(fā)，同時還能較好地抑制番茄灰霉病菌絲的生長[10]。

麥角甾類也從降解產物中檢出，作為農藥，其抑制劑活性高、不易產生抗藥性。烯唑醇和咪鮮胺等麥角甾醇脫甲基抑制劑對葡萄膠孢炭疽菌具有敏感性，供試菌株對咪鮮胺的EC50值在0.01～1.58 mg/L之間，高于其對烯唑醇(EC50 0.05～25.45 mg/L)的敏感性。田間試驗表明科學合理地應用麥角甾醇脫甲基抑制劑防治葡萄炭疽病，可延緩或避免菌株抗藥性的產生，減小對潛在抗性菌株的選擇性壓力[11]。

分枝桿菌定向降解泥炭腐植酸得到的甾類，經濃縮、分離、純化等過程可以得到甾類原藥。向甾類原藥中加入惰性填料和一定量的分散劑，按比例經充分混合粉碎后，達到一定粉粒細度。這些粉狀農藥可以直接施于植物根部，被根系吸收，也可加水濕潤、分散，噴灑施用。粉狀甾類農藥具有儲運方便、安全的特點，包裝材料容易處理，對植物也較安全。

2.3 腐植酸萜類農藥的分析及制備

利用改性后的酵母菌對褐煤的異源合成，在添加秸稈、果皮等輔料的條件下進行。試驗得到的萜類化合物(結構式見圖4)可通過核磁共振波譜法(NMR)、高級液相色譜-質譜(HPLC-MS)和紅外光譜(IR)確認(圖5)。

圖4 腐植酸萜類化合物結構式Fig.4 Structure diagrams of terpenoids in humic acids

圖5 利用IR標譜檢索到的腐植酸中的萜類及C-27甾類物Fig.5 Terpenoids and C-27 steroid of humic acid retrieved using IR

萜類、腐植酸萜類組分對膠孢炭疽菌的初步抑制試驗，是在溫度30 ℃，抑制時間8 h，以活菌對照106cfu/mL的條件下得到的。不同濃度萜類對膠孢炭疽菌的抑制率見表2?？梢钥闯?，隨著萜類濃度的升高，其對膠孢炭疽菌的抑制率先升高后下降，其中以0.005 μg/mL的萜類對膠孢炭疽菌的抑制效果最好，抑制率為95.7%。

表2 不同濃度萜類對膠孢炭疽菌的抑制率Tab.2 Inhibition rates of different concentrations of terpenoids in humic acids upon colletotrichum gloeosporioides

萜類、腐植酸萜類組分的親脂性強，可透過細胞膜，進入到細胞內，影響細胞膜的結構和功能，干擾病原微生物的正常生理代謝，對病原微生物起到防御作用。研究表明，腐植酸含氧單萜類物質對稗草有抑制作用。不同萜類物質處在不同濃度時，“抑草”的效果存在差異性。幾種萜類物質組合后對稗草的最高抑制率為93.96%[12]。

酵母菌異源合成得到的萜類、腐植酸萜類組分，經濃縮、分離、純化等可得到萜類原藥[13]。向原藥中加入非離子表面活性劑，如吐溫、脂肪胺、甘油脂肪酸酯類，以水為介質，超微粉碎制成粘稠狀可流動的懸浮液，噴灑于作物表面，可吸附于微粒表面形成不同的分散體系，改善植物葉片上生物農藥的分布和滲透，提高利用率。

3 結論

(1) 紫外-熒光光譜分析等可差異性地表征泥炭、褐煤中的黑腐酸、棕腐酸和黃腐酸。

(2) 分枝桿菌(Mycobacterium)定向降解泥炭腐植酸得到了20多種組分，其中的甾類化合物包括豆甾醇衍生物以及麥角甾醇等。

(3) 通過改性酵母菌(Saccharomyces)的異源合成實驗，得到的萜類和褐煤腐植酸萜類組分，對膠孢炭疽菌的抑制率可達95.70%。

(4) 初步研究了分支桿菌和改性酵母菌降解腐植酸生成甾類原藥和萜類原藥，為腐植酸制備生物農藥和腐植酸在農藥上的應用提供了實驗數(shù)據(jù)理論基礎。

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UV-f l uorescence Characteristics and Biological Pesticide Research on Humic Acid

Fang Dongdong, Wang Jie, Zhou Xiaping*
(College of Resource and Environmental Engineering, East China University of Science andTechnology, Shanghai,200237)

Humic acids are mainly derived from peat and lignite. The difference of surface characteristics of black humic acid, brown humic acid and fulvic acid in peat and lignite was analysed by the UV-f l uorescence spectrum. Humic acids have many biological active ingredients. Steroid compounds could be obtained by engineered mycobacteria directional degradation, and humic acid terpenoids could be obtained through heterologous biosynthesis by specif i c saccharomycetes. The fermented products were antimicrobial, and can improve the conditions of plant nutrition. Through the enrichment, separation and purif i cation processes, they could be used as biological pesticide.

humic acids; UV-f l uorescence analysis; biological pesticide

TQ314.1，F(xiàn)767.2

1671-9212(2017)03-0044-06

A

10.19451/j.cnki.issn1671-9212.2017.03.005

2015-10-23

方冬冬，女，1992年生，碩士研究生，主要研究方向為腐植酸物理化學性質及生物農藥的制備。*通訊作者：周霞萍，女，教授，E-mail：ecust_zxp@163.com。