紀鋒,徐黎明,趙景壯,劉淼,盧彤巖,賀文斌,尹家勝

(1.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,哈爾濱150070;2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院,上海201306)

鯉春病毒血癥病毒Shlj1株糖蛋白空間結(jié)構(gòu)及其B細胞抗原表位的預測

紀鋒1、2,徐黎明1,趙景壯1,劉淼1,盧彤巖1,賀文斌2,尹家勝1

(1.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,哈爾濱150070;2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院,上海201306)

為預測鯉春病毒血癥病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)Shlj1株糖蛋白(Glycoprotein,G)的空間結(jié)構(gòu)及B細胞抗原表位,采用RT-PCR法從接種SVCV的鯉上皮細胞懸液提取的病毒總RNA中擴增糖蛋白基因,并通過序列測定獲得Shlj1株糖蛋白基因的核苷酸序列及氨基酸序列,利用Phyre2對Shlj1分離株的糖蛋白空間結(jié)構(gòu)進行預測,使用DNAStar軟件綜合分析糖蛋白的柔性區(qū)域、親水性、表面可能性和抗原指數(shù)參數(shù)。結(jié)果表明：獲得的SVCV Shlj1株糖蛋白核苷酸序列長1527 bp,推導出其氨基酸序列為509 aa;空間結(jié)構(gòu)預測顯示,SVCV Shlj1株糖蛋白存在一定數(shù)量的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及大量無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),空間構(gòu)象較規(guī)則;抗原指數(shù)及抗原表位指數(shù)分析顯示,糖蛋白中存在許多抗原指數(shù)較高的區(qū)域,該區(qū)域平均抗原指數(shù)為1.025,最大值達1.250,其中5個區(qū)域(4～26、145～157、293～302、315～327、407～491氨基酸區(qū)段)可能是B細胞抗原表位的主要分布區(qū)域。本研究結(jié)果為SVCV糖蛋白表位疫苗的設(shè)計及單克隆抗體的制備奠定了理論基礎(chǔ)。

鯉春病毒血癥病毒;糖蛋白;空間結(jié)構(gòu);B細胞抗原表位

鯉春病毒血癥(Spring siremia of carp,SVC)是由鯉春病毒血癥病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)引起的流行于鯉科魚類間的一種急性高度傳染性疾病,一旦感染可以引起鯉Cyprinus carpio大規(guī)模暴發(fā)疫情,具有高度的傳染性,感染SVCV的仔魚死亡率最高可達90%[1],該病曾廣泛傳播于歐洲和亞洲的養(yǎng)殖鯉中,并給當?shù)仵庰B(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失。中國自2001年在全國范圍開展SVCV監(jiān)測工作以來,陸續(xù)出現(xiàn)了一些關(guān)于SVCV分離鑒定的研究報道[2-3]。本課題組在2015年對黑龍江省40個養(yǎng)殖場送檢的鯉進行病原監(jiān)測過程中,分離獲得一株SVCV,命名為Shlj1(No. KX911973)。SVCV首先由Fijan[4]于20世紀70年代分離出來,該病毒屬于水泡性病毒屬,是一種彈狀病毒,病毒粒子一端為圓弧形,另一端較平整,病毒粒子長為(135±45)nm,寬為(75±15) nm[5-6],基因組由11 019個核苷酸殘基組成[7],與核蛋白(N)螺旋對稱結(jié)合,形成直徑約為50 nm的核衣殼,少量的聚合酶(L)和磷蛋白(P)結(jié)合在核衣殼上;由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的囊膜外表面有突起的糖蛋白(G),內(nèi)表面為基質(zhì)蛋白(M)[5]。

糖蛋白是一種包含509個氨基酸殘基的典型跨膜蛋白,是SVCV病毒分子非常重要的免疫原性蛋白,參與鯉春病毒血癥病毒的入侵和免疫應答,決定SVC病毒的血清學特征,是診斷試劑開發(fā)的主要靶標[8-9]。目前,SVCV糖蛋白在實驗室條件下還不能做到大批量表達[2,10],而小分子蛋白相比于大分子蛋白更易于做到大量表達[11]。為此,本研究中克隆了SVCV Shlj1分離株的糖蛋白基因,獲得了糖蛋白的編碼基因序列及氨基酸序列,并應用生物信息學軟件對糖蛋白序列進行了三維結(jié)構(gòu)及B細胞抗原表位預測,旨在為SVCV Shlj1株糖蛋白單克隆抗體的制備、基因工程疫苗的設(shè)計和免疫診斷技術(shù)研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鯉上皮瘤細胞(Epithelioma papulosum cyprini, EPC)由中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所魚類病害教研室曾令兵教授惠贈。SVCV Shlj1為本課題組對黑龍江地區(qū)養(yǎng)殖鯉進行流行病學調(diào)查過程中利用EPC從送檢的鯉體內(nèi)分離獲得,經(jīng)測定病毒滴度為106.28TCID50/mL。

RNA提取試劑盒SV Total RNA Isolation system為Promega生物公司產(chǎn)品;一步法基因擴增試劑盒、DNA聚合酶rTaq premix、DNA Marker和PCR純化試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 用于SVCV糖蛋白基因序列克隆的引物為Gf：5′GAAAAAAACTAACAGACATCATGTCTAT 3′,Gr：5′CTCAAACGAAGGACCGCATTTCGTG 3′,由哈爾濱博仕生物公司合成。

1.2.2 SVCV糖蛋白基因的擴增及序列測定 取保存于冰箱(-80℃)中的SVCV病毒懸液200 μL,利用SV Total RNA Isolation system試劑盒提取病毒總RNA。以提取的SVCV總RNA為模板,Gf/ Gr為引物,進行目的蛋白基因的一步法RT-PCR擴增[12],以未經(jīng)SVCV感染的EPC細胞提取的RNA為陰性對照組。PCR反應程序為：50℃下反應30 min;94℃下預變性5 min;94℃下變性30 s;55℃下退火30 s,72℃下延伸30 s,共進行30個循環(huán);最后在72℃下再延伸10 min。擴增產(chǎn)物在110 V電壓下用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳35 min,并對目的條帶進行膠回收,將膠回收產(chǎn)物送至上海生工生物公司進行測序。分析測序結(jié)果,利用DNAStar軟件中的EditSeq程序推導糖蛋白的氨基酸序列。

1.2.3 SVCV Shlj1株糖蛋白三維結(jié)構(gòu)的預測 應用在線工具Phyre2(http：//www.sbg.bio.ic.ac. uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對SVCV Shlj1株糖蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行預測,并用Chimera蛋白分析軟件進行模擬分析。

1.2.4 SVCV Shlj1株糖蛋白的二級結(jié)構(gòu)以及抗原表位分析 應用DNAStar軟件中的Protean模塊對SVCV Shlj1株糖蛋白的B細胞抗原表位進行分析：首先用模塊預測其二級結(jié)構(gòu)(Chou-Fasman法和Gamier-Robson法)、柔性區(qū)段(Karplus-Schulz法)、表面可能性(Emini法);再用Jameson-Wolf法和Kolaskar-Tongaonkar法(http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)分別預測其抗原指數(shù)和抗原表位指數(shù),用Kyte-Doolittle法分析其親水性;最后,結(jié)合糖蛋白的三維結(jié)構(gòu)預測其B細胞抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒糖蛋白基因片段的擴增

擴增試驗中以SVCV病毒懸液提取的RNA為模板,Gf/Gr為引物,進行一步法RT-PCR基因擴增,將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果出現(xiàn)與目的條帶大小一致的特異性條帶(圖1)。

圖1 SVCV Shlj1株糖蛋白基因PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析Fig.1 Gel electrophoresis of PCR product of glycoprotein gene in SVCV Shlj1 strain

2.2 糖蛋白空間三維結(jié)構(gòu)預測

利用在線工具Phyre2對糖蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行預測,結(jié)果顯示：其結(jié)構(gòu)中存在一定數(shù)量的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和大量無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),其中,分布于蛋白內(nèi)部的α-螺旋區(qū)域包含大量疏水氨基酸;β-折疊形成的桶狀結(jié)構(gòu)處于蛋白的中心,其內(nèi)部氨基酸含有大量的疏水性殘基,與α-螺旋共同構(gòu)成一個疏水核心區(qū)域;連接著α-螺旋與β-折疊的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲一并位于蛋白的外部(圖2)。

2.3 SVCV Shlj1株糖蛋白的二級結(jié)構(gòu)

糖蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析預測結(jié)果發(fā)現(xiàn),應用Garnier-Robson法和Chou-Fasman法兩種方法預測的α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角存在較多的重疊區(qū)域。Gamier-Robson法預測的α-螺旋呈彌散狀分布,數(shù)量較少,其中192～203區(qū)段出現(xiàn)跨區(qū)最大的α-螺旋(12 aa),另外2個α-螺旋包含的氨基酸數(shù)目相對較少,分別只有7個氨基酸;β-折疊數(shù)目較多,大部分由多個氨基酸組成且分布均勻,其中跨區(qū)最大的β-折疊出現(xiàn)在213～230和465～ 482區(qū)段,分別由18個氨基酸組成;β-轉(zhuǎn)角區(qū)域集中在氨基酸序列的中前段,其中81～91區(qū)段最大,由11個氨基酸組成,也偶見有單個氨基酸出現(xiàn)。Chou-Fasman法預測的α-螺旋數(shù)量相對較多,分布相對均勻,其中186～203區(qū)段出現(xiàn)最大的α-螺旋(18 aa),而且沒有單個氨基酸構(gòu)成α-螺旋的情況出現(xiàn),其中與Garnier-Robson法預測的有部分區(qū)域重疊;β-折疊分布相對比較均勻,與Gamier-Robson法預測的結(jié)果有比較多的重疊區(qū)域,但組成β-折疊的氨基酸數(shù)量比Gamier-Robson法預測的少(圖3、表1和表2)。Karplus-Schulz法預測的SVCV Shlj1株糖蛋白柔性區(qū)域位置為：14～17、24～29、47～51、56～66、68～73、83～85、104～111、118～125、127～131、138～144、156～158、167～174、179～181、188～190、201～202、209～214、233～235、243～261、272～283、303～317、325～330、337～347、353～371、380～383、392～398、408～409、413、430～438、442～451、460～465、469～471、493～503,可見SVCV Shlj1株糖蛋白有較多個柔性區(qū)域,因此,有較多個潛在的抗原表位存在(圖4)。

圖2 SVCV Shlj1株糖蛋白的結(jié)構(gòu)預測Fig.2 Protein structure prediction of glycoprotein in SVCV Shlj1 strain

圖3 不同方法預測SVCV Shlj1株糖蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of glycoprotein in SVCV Shlj1 strain predicted by various methods

圖4 Karplus-Schulz法預測SVCV Shlj1株糖蛋白的柔性區(qū)段Fig.4 Flexible regions of glycoprotein in SVCV Shlj1 strain predicted by Karplus-Schulz method

2.4 SVCV Shlj1株糖蛋白的親水性和表面可能性

氨基酸親水性預測(Kyke-Doolittle法)結(jié)果顯示,糖蛋白親水性較強,親水性區(qū)段占有較大比例且整體分布比較均勻,其中靠近羧基端的結(jié)構(gòu)蛋白所跨區(qū)段最大、具有最高的親水性指數(shù)(圖5),指示該區(qū)段很有可能位于蛋白表面,極有可能作為病毒的抗原表位。SVCV Shlj1株糖蛋白的表面可能性(Emini法)分析結(jié)果顯示,140～146、301～314、336～347、361～370、392～397、413～415、 426～437、443～449、491～505區(qū)域的表面可能性較大,因此,這些極有可能位于蛋白表面區(qū)域,可作為B細胞的優(yōu)勢區(qū)域(圖6)。

2.5 SVCV Shlj1株糖蛋白的抗原指數(shù)

抗原指數(shù)(Jameson-Wolf法)預測結(jié)果顯示, SVCV Shlj1株糖蛋白中存在大量抗原指數(shù)較高的區(qū)域,如68～73、82～89、106～111、119～126、166～181、209～214、270～284、303～310、337～346、362～370、377～383、392～398、426～453、491～507形成抗原表位的可能性也較大,抗原指數(shù)最高的區(qū)段特別分布在近羧基端區(qū)域,其中231～259區(qū)段所跨區(qū)域最大,因此,該區(qū)段極有可能存在優(yōu)勢抗原表位(圖7)。

2.6 SVCV Shlj1株糖蛋白的抗原表位指數(shù)

糖蛋白抗原表位(Kolaskar-Tongaonkar法[13])預測結(jié)果顯示,SVCV Shlj1株糖蛋白的平均抗原指數(shù)為1.025,最大值為1.250,最小值為0.834 (圖8)。

2.7 SVCV Shlj1株糖蛋白的B細胞表位預測結(jié)果綜合分析

以SVCV Shlj1株糖蛋白序列的抗原指數(shù)、親水性指數(shù)、柔性區(qū)域、蛋白質(zhì)表面可能性指數(shù)等抗原表位參數(shù)以及抗原表位指數(shù)預測結(jié)果,如果抗原指數(shù)≥1.025,表面可能性指數(shù)≥1,親水性指數(shù)為非負數(shù)值,同時其內(nèi)部結(jié)構(gòu)或附近又包含有柔性區(qū)域,包含有不少于7個氨基酸殘基,則這一區(qū)段極有可能作為表位區(qū)域。從符合這些條件的區(qū)域中共篩選出5個優(yōu)勢抗原表位區(qū)段,其氨基酸序列如表3所示。

表1 Gamier-Robson法預測的SVCV Shlj1株糖蛋白的二級結(jié)構(gòu)Tab.1 Secondary structure of glycoprotein in SVCV Shlj1 strain predicted by Gamier-Robson method

表2 Chou-Fasman法預測的SVCV Shlj1株糖蛋白的二級結(jié)構(gòu)Tab.2 Secondary structure of glycoprotein in SVCV Shlj1 strain predicted by Chou-Fasman method

3 討論

3.1 抗原表位的作用

整個蛋白質(zhì)抗原分子很難被免疫細胞表面受體所識別,而僅能夠被位于抗原分子表面的決定抗原特異性的數(shù)個氨基酸殘基組成的特殊序列所識別,這段特殊序列即為抗原表位(Epitope),也被稱為抗原決定簇(Antigenic determinant),是抗原肽分子上具有一定空間結(jié)構(gòu)的某一特定區(qū)段。嚴格說,抗體的特異性是針對大分子表面的抗原表位,而不是整個抗原分子[14]。表位一般由5～7個氨基酸和單糖殘基組成,氨基酸殘基的個數(shù)最多不會超過30個,且多位于蛋白表面的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等比較松散、易扭曲的區(qū)段。想要了解抗原的結(jié)構(gòu)與功能、抗原抗體反應等有關(guān)免疫反應的相關(guān)信息,以及研發(fā)診斷試劑、合成藥物和開發(fā)疫苗等,就必須要做到正確分析和確定抗原表位[15]。有研究證實,蛋白質(zhì)的序列或結(jié)構(gòu)特征在一定程度上影響著抗原表位生物學特性[8,16]。本研究中獲得了SVCV Shlj1株糖蛋白的核苷酸序列(1527 bp)并推導出其氨基酸序列(509 aa);空間結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示,SVCV Shlj1株糖蛋白存在一定數(shù)量的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及大量無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),空間構(gòu)象較規(guī)則。鑒于糖蛋白在該病毒中起到主要免疫原作用,所以對SVCV Shlj1株糖蛋白的研究為后期工作的開展具有更好地指導作用。

圖5 SVCV Shlj1株糖蛋白的親水性分析Fig.5 Hydrophilicity of glycoprotein in SVCV Shlj1 strain

圖6 SVCV Shlj1株糖蛋白的表面可能性分析Fig.6 Surface probability of glycoprotein in SVCV Shlj1 strain

圖7 SVCV Shlj1株糖蛋白的抗原指數(shù)分析Fig.7 Antigenic index of glycoprotein in SVCV Shlj1 strain

圖8 SVCV Shlj1株糖蛋白的抗原表位指數(shù)分析Fig.8 Antigenic epitope index of glycoprotein in SVCV Shlj1 strain

3.2 準確預測SVCV糖蛋白抗原表位的重要性

SVCV粒子呈子彈狀,編碼5種主要的蛋白,其中跨膜糖蛋白G具有主要的免疫原性,決定了病毒的血清學特征,對病毒的入侵和參與免疫應答等特性起到關(guān)鍵性作用,是診斷試劑開發(fā)的重要目標蛋白[8]。目前,SVCV糖蛋白在實驗室條件下還不能做到大批量表達,真核表達效率也非常低,但有原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)抗原且獲得成功的相關(guān)報道[17-19]。在原核表達系統(tǒng)中,翻譯后加工修飾體系與真核表達系統(tǒng)相比并不是很完善,可能不存在翻譯后的修飾,但表達產(chǎn)物卻不失免疫原性[11,20],可能是抗原表位起到了決定作用。作為疫苗,小分子蛋白相比于大分子蛋白易于做到大量表達,相比于減毒活疫苗又能做到安全可靠。所以,準確地預測抗原表位,通過原核表達抗原表位基因的方法來大量獲取具有免疫原性的目的蛋白,也同樣促進了多肽疫苗的合成、診斷試劑的制備和單克隆抗體的篩選。用多種方法和非單一參數(shù)的綜合預測抗原表位具有更高的可信度,提高了預測結(jié)果的準確性。本研究中,抗原指數(shù)以及抗原表位指數(shù)等參數(shù)分析結(jié)果顯示,糖蛋白中存在許多抗原指數(shù)較高的區(qū)域,這些區(qū)域平均抗原指數(shù)為1.025,最大值達1.250,其中4～26、145～157、293～302、315～327、407～491氨基酸區(qū)段可能是B細胞抗原表位的主要分布區(qū)域。

3.3 抗原表位與多種因素之間的關(guān)系

早在20世紀末,Hopp等[21]就已經(jīng)提出了通過氨基酸殘基親水性來預測抗原表位,至此,運用單一參數(shù)和多參數(shù)預測模型均有成功做到預測某種類型蛋白抗原表位的案例[22-24]。雖然親水性和表面可能性都是形成表位很重要的條件之一,但是為了逃避宿主免疫檢測機制導致抗原表位往往是高變的特質(zhì),所以僅僅滿足其中任何一種條件并不能表示一定具有抗原性,因此,單參數(shù)預測有其局限性。多種因素相互影響決定表位抗原性,多種因素綜合作用是表位形成的重要條件,很大程度上抗原表位生物學特性會受到蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。正確剖析和確定表位不僅能夠?qū)乖慕Y(jié)構(gòu)與功能、抗原抗體反應等信息有更進一步地了解,而且對診斷試劑的研發(fā)制備、藥物的篩選合成和多肽疫苗設(shè)計生產(chǎn)等也具有重要的理論指導意義。

本研究中成功地對鯉春病毒血癥病毒Shlj1株糖蛋白基因進行了克隆及序列測定,并分析了糖蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水性、表面可能性、柔性區(qū)段與抗原性指數(shù)等多種參數(shù);并以多個單因素為基礎(chǔ),對糖蛋白的B細胞抗原表位進行了綜合性分析,再利用二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果篩選抗原表位,最后確定了SVCV Shlj1株糖蛋白優(yōu)勢表位。本研究結(jié)果可為SVCV Shlj1株糖蛋白單克隆抗體的制備、表位疫苗的設(shè)計和研究SVCV機制奠定了理論基礎(chǔ)。

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Predication of spatial structure and B cell antigenic epitope of glycoprotein in Shlj1 strain of Spring Viremia of Carp Virus

JI Feng1,2,XU Li-ming1,ZHAO Jing-zhuang1,LIU Miao1,LU Tong-yan1,HE Wen-bin2,YIN Jia-sheng1
(1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Glycoprotein gene was cloned from the total RNA extracted from the suspension of Shlj1 strain with Spring Viremia of Carp Virus(SVCV)using RT-PCR,nucleotide sequence of the glycoprotein was sequenced, and amino acid was deduced to predict the spatial structure and B cell antigenic epitope of SVCV glycoprotein.A three dimensional model of the glycoprotein was established based on the amino acid sequence,and by Phyre2,and flexible region,hydrophilicity,surface probability and antigenic index of the glycoprotein was analyzed by the Protean module in DNAStar software.It was found that the glycoprotein of the SVCV Shlj1 strain had nucleotide sequences of 1527 bp coding 509 amino acids.Space structure prediction revealed that there were a certain number of glycoprotein α-helix,β-pleated sheet,β-turn and a large number of random coil structure,with relatively regular spatial confirmation,in the SVCV Shlj1 strain.The analysis of parameters such as antigen index and antigen epitope index indicated that there were many fragments with high antigen index located in the glycoprotein,with average antigen index of 1.025,and the maximum value of 1.250.The potential B cell antigenic epitope regions were more likely located in 4-26,145-157,293-302,315-327,and 407-491 amino acid sites,indicating that the SVCV Shlj1 strain appeared to have five antigen epitope regions located in the glycoprotein.The findings provide a theoretical basis for preparation of monoclonal antibody and design of epitope vaccine against SVCV.

Spring Viremia of Carp Virus(SVCV);glycoprotein structural protein;spatial structure;B cell antigenic epitope

S941.41

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.04.011

2095-1388(2017)04-0440-07

2016-10-10

黑龍江省應用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目(GA13B401)

紀鋒(1990—),男,碩士研究生。E-mail：fengjii@foxmail.com

尹家勝(1960—),男,研究員。E-mail：yinjiasheng@hrfri.ac.cn