洪華，袁琪，張愛平，王紅衛(wèi)，申曉萍，張瑞萍

(1.南通出入境檢驗檢疫局，江蘇南通 226004； 2.吳江出入境檢驗檢疫局，江蘇吳江 215200； 3.南通大學，江蘇南通 226007)

基于核酸酶的新型阻抗傳感器檢測紡織品中的鉛＊

洪華1，袁琪2，張愛平1，王紅衛(wèi)1，申曉萍1，張瑞萍3

(1.南通出入境檢驗檢疫局，江蘇南通 226004； 2.吳江出入境檢驗檢疫局，江蘇吳江 215200； 3.南通大學，江蘇南通 226007)

建立一種基于核酸酶的電化學阻抗傳感器檢測紡織品中鉛含量的方法。采用金納米粒子修飾的金電極作為基底電極，以一種新型的核酸酶17E DNAzyme體系作為鉛離子的生物識別元件，構建了一種新型的電化學阻抗傳感器用于高靈敏選擇性檢測鉛離子。在最佳實驗條件下，傳感器對溶液中鉛離子的線性檢測范圍為1.0 μg/L～10 mg/L，檢出限為0.6 μg/L。測定結果的相對標準偏差小于5.4%(n=6)，加標回收率在93.5%～106.0%之間。采用該法對實際紡織品樣品進行測試，并與國標方法測定值進行對比，實驗結果表明兩種方法的測定值無顯著性差異。該方法操作簡便，對鉛離子的檢測具有良好的選擇性，可用于現場樣品的在線、快速測定。

鉛離子檢測；紡織品；核酸酶；電化學阻抗傳感器

AbstractA novel electrochemical impedance sensor based on DNAzyme was developed for highly sensitive detection of lead in textiles. Gold electrode modi fied by gold nanoparticles was used as substrate electrode and a novel DNAzyme was used as biological recognition element of lead ions，a new electrochemical impedance sensor for selective detection of lead ions with high sensitivity was built. Under the optimized conditions，the sensor could detect lead ions in solution with good linearty in the range of 1.0 μg/L-10 mg/L with a low detection limit of 0.6 μg/L. The recovery was 93.5%-106.0%，and relative standard deviation was not more than 5.4%(n=6). No signi ficant difference was obtained between the results of the proposed method and the national standard method. The method was suitable for rapid determination of lead content in textiles on site with good selection.

Keywordslead ions detection; textiles; DNAzyme; electrochemical impedance sensor

隨著近年來綠色消費觀念的普及，重金屬限量控制已成為生態(tài)化生產工藝安全性能評價要素之一，對紡織品進行重金屬殘留分析也越來越受到重視。其中，紡織品中的鉛由于對人類健康危害巨大而廣受關注。紡織品中含鉛的主要原因是采用含鉛染化料、助劑和附件飾品。我國個別企業(yè)的油墨印花中采用的鉛系顏料和含鉛干燥劑，PVC涂層采用鉛作穩(wěn)定劑，服裝加工時采用含鉛金屬附件或飾品等，容易導致紡織品含鉛超標，形成鉛暴露和危害，導致部分出口紡織品被召回，因此含鉛紡織品問題日益得到人們的關注。很多國家和地區(qū)，例如美國、歐盟均對服裝中鉛離子的限值作了明確規(guī)定。如2009版的OEKO-TEX Standard 100新增了對總鉛和總鎘含量的限定［1］，2008年美國《消費品安全改進法案》對兒童產品中總鉛含量作出嚴格規(guī)定［2］。我國國家強制性標準GB 20814-2014 《染料產品中重金屬元素的限量及測定》對各類染料產品中鉛含量的限值也作了明確規(guī)定［3］。

目前，紡織品中鉛離子殘留量檢測主要采用原子吸收法和等離子發(fā)射光譜法［4-6］。其中，火焰原子吸收法對于高含量的鉛離子殘留有很好的檢測效果；石墨爐原子吸收法原子化效率高，檢測限低，但重現性和準確性不足，容易受到雜質的干擾；電感耦合等離子發(fā)射光譜法是目前用于檢測紡織品中重金屬最有效的方法之一，但在儀器操作要求等方面也存在不足。近年來，通過基因文庫篩選，研究人員發(fā)現了大量具有金屬離子結合特異性的DNA分子片段［7-9］，其中一種對鉛離子具有特異性識別功能的核酸酶17E DNAzyme受到研究者們的廣泛關注，并被作為新型的生物識別元件被用于高選擇性鉛離子生物傳感器的研發(fā)［10-12］。

筆者采用17E DNAzyme體系作為鉛離子的生物識別元件，通過特定的功能性修飾，與電化學電極結合，構建了一種阻抗型鉛離子電化學生物傳感器，實現了紡織品中鉛含量的高靈敏電化學檢測。這種電化學適配體傳感器制作簡單，檢測過程靈敏快速，無需使用復雜昂貴的儀器，因而有望替代傳統檢測方法用于紡織品中鉛含量的快速分析，并且該方法具有普適性，通過改變功能核酸識別分子，可衍生用于紡織品中其它重金屬離子檢測的適配體傳感器。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

電化學阻抗(EIS)測定儀：Autolab PGSTAT30型，荷蘭Eco Chemie公司；

氯金酸：1 g，Au含量不小于47.5%，上海化學試劑公司；

檸檬酸鈉、氯化鈉、乙酸鉛、乙酸鋅、氯化鈷、氯化鎂、氯化錳、氯化鈣和硫酸銅：分析純，北京化學試劑公司；

實驗所用其它試劑均為分析純；

實驗所用緩沖溶液為含0.1 mol/L NaCl濃度為 50 mmol/L 的 Tris-HCl (pH 7.4)和Tris-HAc (pH 7.4)緩沖溶液；

寡聚核苷酸片段：大連TaKaRa生物工程有限公司；

巰 基 功 能化的 17E DNAzyme序列：5，-HS-(CH2)6-TTT CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG AGT 3’，記作 17E ；

底物鏈序列：5’ACT CAC TAT rA GGA AGA GAT G 3’，記作 17DS ；

寡聚核苷酸片段的濃度利用紫外吸收法標定，即測定樣品在260 nm處的吸收值，由相應的摩爾消光系數計算其濃度，寡聚核苷酸片段的摩爾消光系數為所含各堿基摩爾消光系數之和，這里 ε(dA)=15 400 L/(mol·cm)，ε(dG)=11 500 L/(mol·cm)，ε(dC)=7 400 L/(mol·cm)，ε(dT)=8 700 L/(mol·cm)；

實驗用水為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

電化學阻抗(EIS)測定均在室溫下進行，采用傳統的三電極體系：工作電極為修飾的Au電極，螺旋鉑絲為對電極，Ag/AgCl(飽和KCl溶液)為參比電極。

EIS測量條件：擾動電壓振幅為5 mV，頻率范圍在1 Hz～10 kHz之間，EIS測定所用的電解質溶液為1 mmol/L K4［Fe(CN)6］/K3［Fe(CN)6］(0.1 mol/L PBS 緩沖液，pH 7.0)。

1.3 實驗方法

1.3.1 金電極清洗和預處理

實驗中所用的金電極(AuE，d=3 mm)在進行化學修飾前分別用尺度為1.0，0.3，0.05 μm的α-Al2O3粉拋光，并相繼在二次水中超聲洗滌，最后在0.1 mol/L H2SO4溶液中進行電化學清洗，在-0.2～1.6 V電勢范圍內循環(huán)掃描，顯現出3個金氧化的特征峰和穩(wěn)定的電流，取出電極，然后用二次水將電極表面沖洗干凈，氮氣吹干。

1.3.2 金納米粒子的制備

實驗中所用的13 nm尺度的金納米粒子(AuNPs)制備過程參照文獻［13］：將1.94 mL 0.1 mol/L的檸檬酸鈉溶液加入到沸騰的氯金酸溶液(50 mL水和0.167 mL 10%氯金酸的混合液)，煮沸10 min，得到酒紅色膠體溶液，攪拌冷卻至室溫，即制備出13 nm的AuNPs膠體。將此AuNPs膠體溶液于4oC存放備用。

1.3.3 電極傳感界面的制備

AuNPs修飾的金電極(AuE/AuNPs)制備過程參照文獻［14］：將清潔好的干凈金電極置于1 mmol/L的1，6-己二硫醇的乙醇溶液中常溫組裝2 h，取出后用大量乙醇清洗電極表面，用氮氣吹干后浸入到以上制備的AuNPs膠體溶液中常溫組裝1 h，然后取出，用大量二次水清洗電極表面，即制備出AuE/AuNPs電極。

傳感界面制備：以制備好的AuE/AuNPs電極作為基底電極。首先將巰基功能化的17E DNAzyme用 50 mmol/L 的 Tris-HCl緩沖溶液 (pH 7.4)配制成1 μmol/L的組裝溶液，溶液中同時包含 6 μmol/L 的三 (2-羧乙基)膦鹽酸 (TCEP)。將AuE/AuNPs電極浸入到以上配制好的組裝溶液中反應12 h，取出電極，用大量二次水清洗，然后浸入到1 mmol/L的巰基己醇溶液中1 h，封閉AuNPs表面未結合的空白位點，所制備的修飾電極記為 AuE/AuNPs/17E電極。將 AuE/AuNPs/17E電極清洗干凈后儲存到10 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液中保存。底物鏈17DS溶解于50 mmol/L的pH 7.4 Tris-HAc緩沖溶液中(含0.1 mol/L NaCl)配制成17DS濃度為2 μmol/L的溶液，將此溶液于95℃水浴加熱2 min，在10 min內快速冷卻到室溫。然后將AuE/AuNPs/17E電極浸入到17DS溶液中于65℃水浴加熱10 min，逐漸冷卻到室溫，室溫下繼續(xù)反應12 h以形成穩(wěn)定的17E/17DS雜化結構，得到的電極即為最終的鉛離子傳感電極，記為AuE/AuNPs/17E/17DS電極。

1.3.4 鉛離子的電化學檢測

將新制的AuE/AuNPs/17E/17DS傳感電極浸泡在一系列不同濃度的鉛離子標準溶液(含50 mmol/L Tris-HAc，0.1 mol/L NaCl，pH 7.4) 中，37℃水浴中反應30 min達到最大的酶切反應程度，然后將電極轉移到50 mmol/L Tris-HAc緩沖液中(含 0.1 mol/L NaCl，pH 7.4)，冷卻至室溫，以除去電極表面殘留的底物鏈分子，將電極轉移到1 mmol/L K4［Fe(CN)6］/K3［Fe(CN)6］(0.1 mol/L PBS 緩沖液，pH 7.0)電解質溶液中，進行EIS測定。

2 結果與討論

2.1 傳感電極檢測鉛離子的機理

圖1為傳感電極對鉛離子檢測的機理示意圖。如圖1所示，傳感電極表面由于存在密集的17E DNAzyme與底物鏈雜交形成的雙鏈結構，使得修飾電極在鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀電化學探針溶液中具有較大的電荷轉移電阻，當電極與待測溶液中的鉛離子作用時，17E DNAzyme能夠選擇性識別鉛離子并與其結合，產生酶效應，快速切斷其底物鏈17DS，破壞預雜交的雙鏈結構，斷裂的底物鏈從電極表面脫落，降低了電極表面DNA的覆蓋密度，從而對溶液中負電性的鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀電化學探針靜電排斥力減弱，減小了其在修飾電極界面的電荷轉移電阻，EIS信號減小的程度與溶液中鉛離子濃度相關。這樣，通過測定修飾電極的EIS信號變化，可以方便快捷地實現溶液中鉛離子濃度的檢測。

圖1 傳感電極對鉛離子檢測機理示意圖

2.2 電極傳感界面的EIS表征

首先利用EIS技術表征了所制備的傳感電極對溶液中鉛離子的響應情況。圖2顯示了AuE/AuNPs電極在1 mmol/L K4［Fe(CN)6］/K3［Fe(CN)6］(0.1 mol/L PBS緩沖液，pH 7.0)電解質溶液中的電化學阻抗譜圖，其Niquist曲線僅可見一很小的半圓形區(qū)域(代表著電子轉移電阻Ret)，說明AuE/AuNPs電極在電化學探針溶液中具有較小的Ret。

圖2 AuE/AuNPs電極的電化學阻抗譜圖

圖3為AuE/AuNPs/17E/17DS電極在探針溶液中的電化學阻抗圖。電解質溶液為1 mmol K4［Fe(CN)6］/K3［Fe(CN)6］(0.1 mol PBS 緩沖液，pH 7.0)。

圖3 AuE/AuNPs/17E/17DS電極與鉛離子作用前(a)和作用后(b)的電化學阻抗譜圖

由圖3可知，其Niquist曲線出現了一個較大的Ret[圖3(a)]。這主要歸因于電極表面修飾有密集的帶負電的17E/17DS雜交雙鏈結構，對溶液中帶負電荷的［Fe(CN)6］3-/4-探針產生排斥作用，從而在動力學上阻礙了電化學探針在電極界面上的電荷轉移，因而顯示出較大的電荷轉移電阻。當AuE/AuNPs/17E/17DS電極與0.1 mg/mL的鉛離子溶液作用后，電極的Ret明顯減小[圖3(b)]。證明傳感電極上的17E DNAzyme對溶液中鉛離子的有效識別并與其結合，產生酶效應，快速切斷其底物鏈17DS，破壞雜交的雙鏈結構，斷裂的底物鏈17DS從電極表面脫落，導致電極表面負電性的DNA密度減小，從而減弱了電極對探針的屏蔽作用，因而Ret減小。

2.3 傳感電極對鉛離子的檢測

為了考察傳感電極對鉛離子濃度的檢測情況，首先考察了AuE/AuNPs/17E/17DS傳感電極在鉛離子溶液中的孵育時間對電極信號的影響。結果發(fā)現，傳感電極與鉛離子溶液作用25 min后的EIS信號基本達到穩(wěn)定，為了使其作用更完全，實驗采用作用時間為30 min。將傳感電極浸泡在一系列不同濃度的鉛離子溶液中30 min后，檢測其EIS信號，結果見圖4。從圖4中可以看出，隨著鉛離子濃度增大，電極的Ret逐漸降低。EIS信號的減小，證明了傳感界面對鉛離子的識別以及發(fā)生的酶切反應，從而證實傳感電極對鉛離子的有效識別。

圖4 傳感電極對不同濃度鉛離子的EIS響應

以EIS信號電子轉移電阻變化率(Ret0-Ret)/Ret0為縱坐標y，對應鉛離子濃度c的對數lgc為橫坐標進行線性回歸，得線性方程為y=0.179lgc+0.086，在1.0 μg/L～10 mg/L 的濃度范圍內，(Ret0-Ret)/Ret0與鉛離子濃度的對數之間存在著良好的線性關系(r2=0.995 3)，檢出限為 0.6 μg/L (S/N=3)。

2.4 傳感電極對鉛離子檢測的選擇性

為了進一步考察傳感電極對鉛離子檢測的特異性，用最有可能對鉛離子產生干擾的8種金屬離子 (Zn2+，Co2+，Mg2+，Ca2+，Mn2+，Cd2+，Ni2+和 Cu2+)作對比試驗。圖5為傳感電極對1.0 mg/mL各種金屬離子的信號響應值。

圖5 傳感電極對濃度均為1 mg/mL的各種金屬離子的信號響應值

圖5試驗結果顯示，其它8種金屬離子不會引起明顯的信號變化，說明該傳感器對鉛離子具有良好的選擇性。

2.5 精密度試驗

分別對棉、麻、毛、滌綸等紡織纖維的代表性樣品進行測試。實際樣品的前處理方法嚴格參照現有的紡織品中鉛離子測試標準(GB/T 30157-2013紡織品-總鉛和總鎘含量的測定)中樣品前處理方法制備［15］。對樣品中鉛含量進行6次平行測定，結果見表1。由表1可知，4種樣品中鉛含量測定結果的相對標準偏差小于5.4%，表明該方法具有較好的精密度。

表1 精密度試驗結果

2.6 回收試驗

對上述棉、麻、毛、滌綸4種實際樣品進行加標回收試驗，考察傳感電極對實際紡織樣品中的鉛含量檢測的準確度。每種樣品進行3次平行測定，計算平均加標回收率，試驗結果見表2。由表2結果可知，4種樣品的加標回收率在93.5%～106.0%之間，說明該方法具有較高的準確度。

表2 加標回收試驗結果

2.7 比對試驗

用本實驗方法與國標法(GB/T 30157-2013)進行了比對試驗，對4個不同鉛離子含量的紡織品樣品進行測定，兩種方法的檢測相關性見表3。

表3 本法與國標法對鉛離子的檢測結果

由表3可知，本法測定結果和國標法測定結果相符。

3 結語

基于新型的鉛離子生物識別元件17E DNAzyme體系結合高靈敏的電化學阻抗技術，構建了一種阻抗型電化學生物傳感器，實現了對溶液中鉛離子的高靈敏選擇性檢測。該傳感電極的響應值對鉛離子的質量濃度在1.0 μg/L～10 mg/L范圍內表現出良好的線性關系，檢出限為0.6 μg/L。將該傳感器用于實際紡織樣品中的鉛含量檢測，具有良好的精密度與準確度。

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食藥監(jiān)總局規(guī)范食品快檢方法使用快檢不能替代常規(guī)食品檢驗

為了規(guī)范食品快速檢測(以下簡稱“食品快檢”)方法的使用和管理，合理發(fā)揮食品快檢在食品安全監(jiān)管中的作用，不久前食品藥品監(jiān)管總局發(fā)布《總局關于規(guī)范食品快速檢測方法使用管理的意見(食藥監(jiān)科〔2017〕49號)》，其中對食品快檢的含義、檢測對象、適用范圍等給出了相關意見。

意見中明確指出，食品快檢不能替代食品檢驗機構利用常規(guī)實驗室儀器設備開展的食品檢驗活動，不能用于食品安全監(jiān)管工作中部署的食品抽樣檢驗。復檢不得采用快檢方法。具體如下：

(1)食品快檢是指利用快速檢測設施設備(包括快檢車、室、儀、箱等)，按照食品藥品監(jiān)管總局或國務院其它有關部門規(guī)定的快檢方法，對食品(含食用農產品)進行某種特定物質或指標的快速定性檢測的行為。

(2)食品快檢主要適用于需要短時間內顯示結果的禁限用農獸藥、在飼料及動物飲用水中的禁用藥物、非法添加物質、生物毒素等的定性檢測，檢測主要針對食用農產品、散裝食品、餐飲食品、現場制售食品，對于預包裝食品原則上以常規(guī)實驗室檢驗為主。

(3)食品藥品監(jiān)管部門在日常監(jiān)管、專項整治、活動保障等的現場檢查工作中，可以根據實際情況使用快檢方法進行抽查檢測。監(jiān)管人員應當嚴格按照快檢方法使用要求規(guī)范操作，詳細記錄檢測食品品種和名稱、數量、檢測項目、檢測日期、檢測方法、檢測人員姓名、檢測結果以及所使用的快檢產品生產企業(yè)、產品型號批號等信息。食品藥品監(jiān)管部門和監(jiān)管人員對所檢食品的快檢項目結果負責。

(4)現場快檢結果呈陽性的，被抽查食用農產品經營者應暫停銷售相關產品，食品藥品監(jiān)管部門應當及時跟進監(jiān)督檢查和抽樣檢驗，防控風險。被抽查食用農產品經營者對快檢結果無異議的，食品藥品監(jiān)管部門應當依法處置；對快檢結果有異議的，可以自收到或應當收到檢測結果時起4 h內申請復檢。復檢不得采用快檢方法。

(5)各省(區(qū)、市)、計劃單列市、副省級省會城市食品藥品監(jiān)管部門要按照食品藥品監(jiān)管總局制定發(fā)布的《食品快速檢測方法評價技術規(guī)范》和相應快檢方法等要求，通過盲樣測試、平行送實驗室檢驗等方式對正在使用和擬采購的快檢產品進行評價。評價結果顯示不符合國家相應要求的，要立即停止使用或者不得采購。

(6)食品快檢不能替代食品檢驗機構利用常規(guī)實驗室儀器設備開展的食品檢驗活動，不能用于食品安全監(jiān)管工作中部署的食品抽樣檢驗。

(7)省(區(qū)、市)食品藥品監(jiān)管部門可以根據食品安全監(jiān)管需要，組織專業(yè)技術機構對不屬于國家規(guī)定的食品快檢方法開展評價，評價結果符合有關要求的，可用于所在省(區(qū)、市)各級食品藥品監(jiān)管部門在食品安全監(jiān)管中的初步篩查。

(食藥監(jiān)總局)

DNAzyme Based Electrochemical Impedance Sensor for Lead Detection in Textiles

Hong Hua1， Yuan Qi2， Zhang Aiping1， Wang Hongwei1， Shen Xiaoping1， Zhang Ruiping3
(1. Nantong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Nantong 226004， China； 2. Wujiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Wujiang 215200， China； 3. Nantong University， Nantong 226007， China)

O657.1

A

1008-6145(2017)04-0031-05

10.3969/j.issn.1008-6145.2017.04.008

*南通市科技局科技計劃項目（BK2014004）；江蘇出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（2017KJ28）

聯系人：洪華；E-mail: hongh@jsciq.gov.cn

2017-05-17