王夢琦，倪煒，張慧敏，楊章平，王西樸，蔣彥森，毛永江,

（1揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇揚州 225009；2江蘇君樂寶乳業(yè)有限公司，江蘇徐州 221721）

中國荷斯坦牛CXCR1基因編碼區(qū)SNP多態(tài)與臨床乳房炎和生產(chǎn)壽命的關(guān)聯(lián)分析

王夢琦1，倪煒1，張慧敏1，楊章平1，王西樸2，蔣彥森2，毛永江1,2

（1揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇揚州 225009；2江蘇君樂寶乳業(yè)有限公司，江蘇徐州 221721）

【目的】探討中國荷斯坦牛CXCR1基因編碼區(qū)SNP突變與臨床乳房炎和生產(chǎn)壽命的相關(guān)性?！痉椒ā扛鶕?jù)CXCR1基因編碼區(qū)序列，利用PCR-直接測序法對低SCS和高SCS樣本各20個樣本進行SNP篩查，最后對所選擇的4個SNP位點利用飛行質(zhì)譜法對866頭中國荷斯坦牛進行檢測，同時收集所檢測牛只臨床乳房炎和生產(chǎn)壽命等信息，利用多因素方差分析法、Logistic回歸、Cox生存回歸等方法分析以上SNP位點突變與臨床乳房炎發(fā)生次數(shù)和生產(chǎn)壽命的相關(guān)性。【結(jié)果】CXCR1基因編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)13個SNP位點（291 C＞T、333 C＞G、337 A＞G、365 C＞T、570 A＞G、642 A＞G、735 C＞G、816 A＞C、819 A＞G、980 A＞G、995 A＞G、1008 C＞T和1068 A＞G），分為4個連鎖群，隨后從每個連鎖群中各選擇1個SNP位點（642 A＞G, 816 A＞C, 980 A＞G和1068 A＞G），利用飛行質(zhì)譜法對大樣本中國荷斯坦牛進行檢測。4個SNP位點共有9種單倍型，其中單倍型GAGG頻率最高（0.3141），而單倍型ACAA頻率最低（0.0017）。CXCR1-642與2胎牛患臨床乳房炎次數(shù)有顯著相關(guān)（P＜0.05），AG基因型個體2胎奶牛患臨床乳房炎次數(shù)顯著高于AA基因型（P＜0.05），CXCR1-816 AA 基因型個體3胎奶牛患臨床乳房炎次數(shù)顯著低于AC和CC基因型（P＜0.05），其它SNP位點與各胎次臨床乳房炎發(fā)生次數(shù)均無顯著相關(guān)（P＞0.05）。CXCR1-816與奶牛離群月齡有極顯著相關(guān)（P＜0.01），與奶牛生產(chǎn)月齡和離群胎次有顯著相關(guān)（P＜0.05），CXCR1-816 AA基因型個體生產(chǎn)月齡、離群月齡和離群胎次均顯著高于CC基因型個體（P＜0.05），而其它SNP位點對生產(chǎn)月齡、離群月齡和離群胎次均無顯著相關(guān)（P＞0.05）。Cox生存分析表明：只有CXCR1-816位點與奶牛生存時間有顯著相關(guān)(P＜0.05)，CXCR1-816 CC基因型個體在各時間段的生存概率均低于AA和AC基因型個體?！窘Y(jié)論】CXCR1-816 A＞C突變與中國荷斯坦牛患臨床乳房炎次數(shù)和生產(chǎn)壽命有顯著相關(guān)，在進一步驗證其功能后，可用于中國荷斯坦牛生產(chǎn)壽命的分子標(biāo)記輔助選擇。

中國荷斯坦牛；CXCR1；SNP；臨床乳房炎；生產(chǎn)壽命

0 引言

【研究意義】乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，也是造成奶牛業(yè)損失最嚴(yán)重的疾病[1-2]。奶?；既榉垦缀髮?dǎo)致奶品質(zhì)降低、產(chǎn)奶量下降，甚至危害到消費者的健康。奶牛生產(chǎn)壽命是指奶牛從第1次產(chǎn)犢到死亡或者淘汰之間的時間，它能夠反映奶牛避免被淘汰的能力。奶牛的生產(chǎn)壽命是一個重要的經(jīng)濟指標(biāo)，它在增加牧場主的收入和育種方面有重要的作用。有研究表明：荷斯坦牛的生產(chǎn)壽命與終生產(chǎn)奶量呈顯著正相關(guān)[3]，奶牛的產(chǎn)奶胎次從第3胎提高到第4胎，其效益將增加11%—13%[4]。奶牛生產(chǎn)壽命與生產(chǎn)性能、繁殖性能及健康狀況等緊密相關(guān)，其中臨床乳房炎是造成奶牛淘汰的主要原因之一。臨床乳房炎的遺傳力為0.03—0.2[5]，奶牛生產(chǎn)壽命的遺傳力為0.029—0.072[6]。由于臨床乳房炎和生產(chǎn)壽命的遺傳力均較低，直接選擇很難獲得理想的遺傳進展。因此，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對乳房炎和生產(chǎn)壽命的研究越來越受到關(guān)注?！厩叭搜芯窟M展】 趨化因子受體1（chemokine receptor 1, CXCR1）屬于G蛋白偶聯(lián)受體的家族成員，目前至少有兩種不同的類型（CXCR1和CXCR2）[7]。I型受體（CXCR1）特異性地與白細(xì)胞介素-8（Interleukin-8，IL8）結(jié)合，主要分布于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和G細(xì)胞；II型受體（CXCR2）除了與IL8結(jié)合外，還可以和生長調(diào)節(jié)癌基因（Growth-regulated oncogene, GRO）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白22（Macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）和中性粒細(xì)胞激活蛋白-2（Neutrophil activating protein-2，NAP-2）等結(jié)合，CXCR2主要分布于中性粒細(xì)胞和髓樣前體細(xì)胞系。CXCR1和CXCR2均具有介導(dǎo)活化中性粒細(xì)胞的作用，可促進中性粒細(xì)胞脫顆粒、釋放貯存酶，增強中性粒細(xì)胞的吞噬功能，啟動超氧離子釋放,導(dǎo)致機體局部炎癥反應(yīng)，達到殺滅病原菌的目的[8-9]。大量研究表明：IL8和CXCR1基因及其突變與奶牛乳房均存在一定的關(guān)系[10-16]。周雷等[17]通過對中國荷斯坦奶牛CXCR1基因外顯子2進行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)4個突變位點291 C＞T、333 C＞T、337 A＞G 和365 C＞T，并且發(fā)現(xiàn)CCCTGGCC基因型組合個體具有低SCS和高產(chǎn)奶量的優(yōu)勢。奶牛的生產(chǎn)壽命與牛場的生產(chǎn)性能、飼養(yǎng)管理、日糧配合、環(huán)境、季節(jié)、其它疾病等非遺傳因素有一定關(guān)系[18]，同時與遺傳也有一定關(guān)系[19-20]。近年來，國內(nèi)外圍繞影響奶牛生產(chǎn)壽命的分子標(biāo)記進行了部分研究，發(fā)現(xiàn)了部分有價值的結(jié)果。ASHWELL等[21-22]分別在奶牛第2、12、16、21、23號染色體上發(fā)現(xiàn)了與其生產(chǎn)壽命相關(guān)的微衛(wèi)星；HEYEN等[23]在BTA21上發(fā)現(xiàn)了長度為85 cM的微衛(wèi)星ILSTS054；KHATIB[19-20]、KOMISAREK等[24]、JOHN等[25]又發(fā)現(xiàn)了ATP結(jié)合盒子亞家族G成員（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）、過氧化物酶體增殖物增殖受體γ輔激活因子（Peroxisomeproliferators-activeted receptor-γcoactovator 1 A，PPARGC1A）、氧化低密度脂蛋白受體1（Oxidized low-density lipoprotein receptor 1，OLR1）和硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1, SCD1）與生產(chǎn)壽命有一定程度的相關(guān)性。CHEBEL 等[26]發(fā)現(xiàn)Leptin 基因R4C位點與奶牛生產(chǎn)壽命相關(guān)疾病的發(fā)生顯著相關(guān)，TT基因型個體真胃變位的發(fā)生率較高，而CT型各種疾病的發(fā)病率最低?！颈狙芯壳腥朦c】國內(nèi)周雷等[17]、徐敏等[27]和官永強等[28]檢測了中國荷斯坦牛CXCR1基因部分編碼區(qū)（coding sequence，CDS）序列SNP多態(tài)性，并與泌乳性狀進行了關(guān)聯(lián)分析，但尚未見對CXCR1基因整個CDS區(qū)SNP檢測的報告，也未見CXCR1基因CDS區(qū)SNP多態(tài)與臨床乳房炎和生產(chǎn)壽命相關(guān)分析的報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究的目的是在檢測中國荷斯坦牛CXCR1基因CDS區(qū)所有SNP突變基礎(chǔ)上，同時分析SNP多態(tài)與臨床乳房炎和生存壽命的相關(guān)性，以期為中國荷斯坦牛臨床乳房炎及生產(chǎn)壽命的分子標(biāo)記輔助選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2011年7—8月于江蘇省某大型奶牛場隨機采集中國荷斯坦牛血樣共866頭。采用尾靜脈采血（10 mL/頭），ACD抗凝，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。牧場基本情況如下：全場共有奶牛10 000余頭，其中成年泌乳奶牛近6 000頭，散欄飼養(yǎng)，魚骨式擠奶大廳進行擠奶，日擠奶三次，采用全混合日糧（Total Mixed Ration, TMR）飼喂。

1.2 DNA提取及CXCR1基因CDS區(qū)SNP突變檢測

奶牛血液基因組DNA采用常規(guī)酚氯仿提取法，TE溶解，取部分DNA樣品稀釋至100 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)GenBank公布的牛CXCR1基因CDS區(qū)序列（登錄號：NM_001105038.1），用Primer 5.0軟件設(shè)計引物1對如下：F:ATGACAATCATCCTGAA AGA，R：TCAGAGGGTAGTAGACGTGT。擴增產(chǎn)物長度為1 082 bp，PCR擴增體系如下：總體積20 μL，其中包括10×buffer 2.0 μL，25 mmol·L-1Mg2+1.5 μL、dNTP（10 mmol·L-1）0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.3 μL，上下游引物各（10 pmol·μL-1）1.0 μL,模板DNA（100 ng·μL-1）1.0 μL、ddH2O 12.7 μL。擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，56℃復(fù)性40 s，72℃延伸10 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠（0.05% EB）電泳0.5 h后，紫外燈下觀察結(jié)果，并拍照。

從所采樣本中選擇20個高SCS樣本（5.85±1.22）和20個低SCS樣本（1.02±0.05），進行常規(guī)PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增效果，后送至上海生物公司正反測序。用DNAMAN軟件對測序所得結(jié)果進行比對，尋找突變位點，并初步計算各基因各位點連鎖程度。經(jīng)對40個樣本的初步分析，CXCR1基因CDS區(qū)共發(fā)現(xiàn)13個SNP位點，分為4個連鎖群，故從4個連鎖群中各選擇1個SNP位點進行后續(xù)分析，分別是：642 A＞G、816 A＞C、980 A＞G和1068 A＞G 4個SNP位點。對大樣本CXCR1 SNP突變檢測采用飛行時間質(zhì)譜法（MassARRAY? MALDI-TOF System，Sequenom，Inc.，USA）。同時，為保證SNP分析結(jié)果可靠性，其中40個樣本重復(fù)測定2次（測試員并不知道這個40個是重復(fù)樣本）。結(jié)果表明該方法SNP分型結(jié)果準(zhǔn)確性為100%。

1.3 臨床乳房炎發(fā)生次數(shù)和生產(chǎn)壽命相關(guān)數(shù)據(jù)的收集

奶牛臨床乳房炎以可以看到明顯的乳房紅腫、觸摸有疼痛感和硬塊或乳樣呈豆腐樣等癥狀為判斷條件，以獸醫(yī)治療記錄為準(zhǔn)。如果某奶牛在治愈后10d內(nèi)又發(fā)病，則算一次病例；治愈后10d以上又發(fā)病的，則算為新發(fā)病例。根據(jù)該原則記錄每頭奶牛從2010年1月到2014年12月共5年內(nèi)各胎次發(fā)生臨床乳房炎的次數(shù)。

根據(jù)采樣牛只的出生時間、第一胎產(chǎn)犢時間、淘汰時間和胎次等信息，計算出初產(chǎn)月齡、生產(chǎn)月齡（或在群月齡）、離群月齡、離群胎次等信息，作為生產(chǎn)壽命相關(guān)指標(biāo)，進行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計分析

1.4.1 遺傳學(xué)分析 用遺傳學(xué)軟件SHEsis進行常規(guī)群體遺傳學(xué)統(tǒng)計分析（包括基因頻率、基因型頻率、Hardy-Weinberg平衡檢測等），同時進行連鎖不平衡分析[29]。

1.4.2 關(guān)聯(lián)分析 用多因素方差分析模型分析CXCR1基因CDS區(qū)各SNP位點不同基因型與奶牛各胎次臨床乳房炎次數(shù)和生產(chǎn)壽命相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性，模型如下：

式中：Y為各胎次臨床乳房炎次數(shù)和生產(chǎn)壽命相關(guān)指標(biāo)的觀察值，μ為群體均值，S 為初產(chǎn)季節(jié)的效應(yīng)值，M 為初產(chǎn)月齡的效應(yīng)值，G的基因型或單倍型的效應(yīng)值，e為隨機誤差。根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂蛱攸c，初產(chǎn)季節(jié)劃分如下：3—5月為春季，6—8月為夏季，9—11月為秋季，12月至次年2月為冬季。

由于部分牛只記錄不完整，只選擇同時具有1—3胎臨床乳房炎記錄的牛只進入方差分析。經(jīng)篩選，最終有721頭奶牛用于分析。對于生產(chǎn)壽命相關(guān)指標(biāo)，只選擇已淘汰，且同時具有出生、產(chǎn)犢等相關(guān)信息的牛只進行分析。經(jīng)篩選，最終有647頭奶牛用于分析。

1.4.3 生產(chǎn)壽命的生存分析 用Cox回歸模型計算CXCR1基因CDS區(qū)各SNP位點不同基因型對生產(chǎn)壽命相關(guān)指標(biāo)的影響，并制作生存曲線，由統(tǒng)計軟件SPSS（Ver 16.0）完成，模型如下：

式中：

h0(t)：基準(zhǔn)風(fēng)險函數(shù)，即所有變量取零時的t時刻的風(fēng)險函數(shù)

X1、X2、X2和 X4：各SNP位點變量

β1、β2、β3和β4：各SNP位點變量的回歸系數(shù)

2 結(jié)果

2.1 CXCR1基因CDS區(qū)SNP篩查

通過對20頭高SCS和低SCS奶牛用所設(shè)計的引物PCR擴增并測序，發(fā)現(xiàn)CXCR1基因CDS區(qū)共發(fā)現(xiàn)13個SNP位點，詳細(xì)見表1。經(jīng)連鎖分析，13個SNP位點分為4個連鎖群（圖1），故從4個連鎖群中各選擇1個SNP位點進行后續(xù)分析，分別是：642 A＞G、816 A＞C、980 A＞G和1068 A＞G 4個SNP位點。

另外，由于CXCR1基因SNP的變化均發(fā)生在CDS區(qū)，因此SNP的變化可能導(dǎo)致所編碼氨基酸的變化。根據(jù)CXCR1基因CDS區(qū)SNP導(dǎo)致氨基酸變化情況，制作各位點氨基酸變化情況如圖2 所示。CXCR1基因CDS區(qū)共有5個非同義突變，I113V、K327R和H332R 3個非同義突變是完全連鎖的，屬于如前所述第2個連鎖群，V122A和H245Q屬于第1連鎖群。第3、4兩個連鎖群均是同義突變，不導(dǎo)致氨基酸的變化。2個非同義突變連鎖群可以組成4種氨基酸單倍型。

2.2 基因（型）頻率分布及連鎖不平衡分析

利用飛行質(zhì)譜法對866頭奶牛群體CXCR1基因CDS區(qū)4個SNP位點進行分型，所得基因頻率、基因型頻率分布及Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果見表2。CXCR1-642、CXCR1-816、CXCR1-980和CXCR1-1068 4個SNP位點優(yōu)勢基因型分別為GG、CC、GG和GG型，頻率分別為0.580、0.466、0.607和0.658，優(yōu)勢基因分別為G、C、G和G，頻率分別為0.758、0.688、0.784和0.811。經(jīng)分析，CXCR1基因4個SNP位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。另外，CXCR1基因4個SNP位點共有9種單倍型（表3），其中單倍型GAGG頻率最高（0.3141），而單倍型ACAA頻率最低（0.0017）。

表1 CXCR1基因CDS區(qū)SNPsTable 1 The SNPs in the CDS of CXCR1 gene

2.3 CXCR1基因不同SNP位點臨床乳房炎發(fā)病次數(shù)

CXCR1基因不同SNP位點各胎次臨床乳房炎發(fā)生次數(shù)見表4。由表4可知：隨著胎次增加，奶牛患臨床乳房炎發(fā)生次數(shù)增加較快：1、2、3胎及1—3胎共計發(fā)生臨床乳房炎的平均次數(shù)分別為0.01±0.01、0.52±0.03、0.91±0.05和1.44±0.07。CXCR1-642與2胎牛、CXCR1-816與3胎牛臨床乳房炎發(fā)生次數(shù)有顯著相關(guān)（P＜0.05），其它SNP位點與各胎次臨床乳房炎發(fā)生次數(shù)均無顯著相關(guān)（P＞0.05）。多重比較表明：2胎牛CXCR1-642 AG基因型個體臨床乳房炎發(fā)生次數(shù)（0.61±0.06）顯著高于AA型（0.33±0.09），

圖1 40個個體CXCR1基因CDS區(qū)SNP位點連鎖圖Fig. 1 The linkage map of SNP in the CDS of CXCR1 gene for 40 Holstein cows

表2 CXCR1基因 CDS區(qū)4個SNP位點等位基因、基因型頻率及H-W平衡檢驗Table 2 The genotypic frequencies, alleles, and values of X2test significance for 4 SNP in the CDS of CXCR1 gene

3胎牛CXCR1-816 AA基因型個體臨床乳房炎發(fā)生次數(shù)（0.55±0.10）顯著低于AC和CC型個體（0.99± 0.08和0.90±0.07）。

2.4 CXCR1基因不同SNP位點的生產(chǎn)壽命

圖2 CXCR1基因CDS區(qū)AA變化圖Fig. 2 The change of AA in the CDS of CXCR1 gene

表3 CXCR1基因4個SNP位點單倍型頻率Table 3 The haplotypes frequencies of 4 SNP, in the CDS of CXCR1 gene

表4 CXCR1基因不同SNP位點各胎次臨床乳房炎發(fā)生次數(shù)Table 4 The number of CM for SNPs of CXCR1 of different parities

在本研究中，結(jié)合奶牛出生、初產(chǎn)季節(jié)、初產(chǎn)月齡、淘汰日期等信息，用生產(chǎn)月齡、離群月齡和離群胎次3個指標(biāo)來度量奶牛的生產(chǎn)壽命。生產(chǎn)月齡從13到58個月不等（圖3），其中36個月最多，其次為37個月，平均為36.86±0.33月。離群月齡從26—85不等（圖4），其中64最多，其次為65，平均為64.19±8.30。離群胎次從1—5胎不等（圖5），其中3胎最多，其次為4胎，平均為3.04±0.78。

圖3 奶牛生產(chǎn)月齡分布Fig. 3 The distribution of production months of cows

圖4 離群月齡分布Fig. 4 The distribution of culling months of cows

圖5 離群胎次分布Fig. 5 The distribution of culling parities of cows

CXCR1基因CDS區(qū)不同SNP位點奶牛生產(chǎn)月齡、離群月齡和離群胎次見表5。由表5可知：CXCR1-816基因型與奶牛離群月齡有極顯著相關(guān)（P＜0.01），CXCR1-816基因型與奶牛生產(chǎn)月齡和離群胎次有顯著相關(guān)（P＜0.05），而其它SNP位點與生產(chǎn)月齡、離群月齡和離群胎次均無顯著相關(guān)（P＞0.05）。多重比較表明：CXCR1-816 AA基因型個體生產(chǎn)月齡、離群月齡和離群胎次均顯著高于CC基因型個體（P＜0.05）。

2.5 生存分析

CXCR1基因CDS區(qū)4個SNP位點的奶牛生存分析結(jié)果表明：僅有CXCR1-816位點與奶牛生存時間有顯著相關(guān)（P＜0.05，表6）。進一步分析發(fā)現(xiàn)：CXCR1-816 CC基因型個體生存時間顯著低于AA和AC基因型（表7）。CXCR1-816 不同基因型生存曲線見圖6。由圖6可知：CXCR1-816 CC基因型個體在各時間段的生存概率均低于AA和AC基因型個體。

表6 CXCR1基因CDS區(qū)4個SNP位點奶牛的Cox生存分析Table 6 The Cox survival analysis of 4 SNPs of CXCR1 gene for dairy cows

3 討論

3.1 CXCR1基因遺傳多態(tài)性分析

圖6 奶牛CXCR1-816不同基因型生存曲線Fig. 6 The survival curve of cows for different genotypes of CXCR1-816

表7 CXCR1-816不同基因型生存時間平均數(shù)與中數(shù)的估計Table 7 The estimation value of mean and median of survival time for different genotypes of CXCR1-816

趨化因子受體和趨化因子在機體炎癥發(fā)生時起著非常重要的作用，當(dāng)奶牛發(fā)生乳房炎時CXCR1基因表達產(chǎn)物增多[30]。本試驗在中國荷斯坦牛第2號染色體CXCR1基因CDS區(qū)共發(fā)現(xiàn)了13個SNP突變位點。PIGHETTI等[31]報道，CXCR1基因CDS區(qū)共有11個SNP位點，也包括4個連鎖群。本研究與之相比，333C＞G、337A＞G和642A＞G均為新發(fā)現(xiàn)的突變位點，并未發(fā)現(xiàn)621A＞G位點，也分為4個連鎖群，群內(nèi)完全連鎖。由于621A＞G 為終止密碼子突變，會導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，說明本研究所檢測的中國荷斯坦牛群體中不存在該位點終止密碼子突變。333C＞G和337A＞G屬于連鎖群2，642 A＞G 為獨立的連鎖群，與其它位點不連鎖。徐敏等[27]分析了荷斯坦牛、西門塔爾牛、通江黃牛3個牛品種共160頭個體CXCR1基因編碼區(qū)多態(tài)性，在CDS區(qū)643、735、819位發(fā)現(xiàn)3個SNP位點。官久強等[28,32]分析了470頭中國荷斯坦牛CXCR1基因編碼區(qū)的多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了6個SNPs：735 C＞G 、816 C＞A、819 A＞G、980 A＞G、995 A＞G和1008 C＞T。本研究與上述研究相比較，多發(fā)現(xiàn)了4個SNP位點。

3.2 CXCR1基因與臨床乳房炎發(fā)病次數(shù)和生產(chǎn)壽命的關(guān)系

本研究所發(fā)現(xiàn)的CXCR基因CDS區(qū)4個SNP連鎖群（642 A＞G、816 A＞C、980A＞G和1068 C＞T）內(nèi)，CXCR1-642位點與2胎奶牛發(fā)生乳房炎次數(shù)有顯著相關(guān)（P＜0.05）。由于CXCR1-642位點為首次發(fā)現(xiàn)的位點，并且CXCR1-642位點與其他胎次臨床乳房炎發(fā)生次數(shù)無顯著相關(guān)（P＞0.05），所以該結(jié)果有待進一步探索。CXCR1-980和CXCR1-1068位點與臨床乳房炎發(fā)病次數(shù)無顯著相關(guān)（P＞0.05），同時這兩個位點與奶牛生存時間也無顯著相關(guān)。CXCR1-816位點與3胎臨床乳房炎發(fā)病次數(shù)有顯著相關(guān)（P＜0.05），AA基因型個體臨床乳房炎發(fā)病次數(shù)顯著低于AC和CC基因型個體。多因素方差分析和生存分析也表明：CXCR1-816位點與奶牛生產(chǎn)壽命有顯著相關(guān)，CC型個體生存時間平均為63.68月，極顯著低于AA型個體（65.5月），CC型比AA型奶牛提前淘汰2個月左右。可見臨床乳房炎發(fā)病次數(shù)較少的基因型個體存活時間較長。綜合以上3方面統(tǒng)計數(shù)據(jù)所得結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CXCR1-816位點與3胎臨床乳房炎發(fā)病次數(shù)及奶牛生產(chǎn)月齡、離群月齡和離群胎次均有顯著相關(guān)，推測該位點及其連鎖群的突變可能對其基因表達產(chǎn)生影響，從而影響乳房炎發(fā)病次數(shù)、生產(chǎn)壽命等相關(guān)指標(biāo)，但這一推論有待進一步通過實驗進行驗證。因此，在種公牛站進行遺傳評定工作中，增加CXCR1-816基因型檢測，篩選其中AA型個體公牛并留種，逐漸淘汰后代中CC型母牛，可降低奶牛群體中臨床乳房炎發(fā)病次率，延長生產(chǎn)壽命，從而提高奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。

在本研究中，816 A＞C、291 C＞T、1008 C＞T及3′端792 G＞A和1079 C＞T處于第三連鎖群內(nèi)[31]，雖然CXCR1基因CDS區(qū)上述3個位點均為同義突變，沒有造成AA改變。而3′端792 G＞A和1079C＞T 2個突變位點，經(jīng)RNAhybrid軟件進行預(yù)測，均沒有發(fā)現(xiàn)miRNA結(jié)合位點。由于本研究并未對CXCR1基因5′端啟動子區(qū)SNP突變及其與CDS區(qū)SNP進行連鎖分析，在該基因5′端啟動子區(qū)是否存在與CDS區(qū)816 A＞C完全連鎖的突變并不得而知，也未見相關(guān)報道。因此，816 A＞C與奶牛臨床乳房炎發(fā)病次數(shù)及生產(chǎn)壽命顯著關(guān)聯(lián)的遺傳機制有待進一步深入研究。

另外，本研究也發(fā)現(xiàn)同一基因型在不同胎次間表現(xiàn)不一致，如CXCR1-816位點僅與3胎臨床乳房炎發(fā)病次數(shù)有顯著相關(guān)，而與1胎和2胎奶牛臨床乳房炎發(fā)病次數(shù)無顯著相關(guān)。造成該結(jié)果可能有以下幾個原因：一是由于奶牛年青時抗病力較強，臨床乳房炎等疾病性狀發(fā)生率較低，從而造成統(tǒng)計結(jié)果不顯著；二是臨床乳房炎本身的度量問題。在生產(chǎn)中臨床乳房炎常以可以看到明顯的乳房紅腫、觸摸有疼痛感和硬塊或乳樣呈豆腐樣等癥狀為判斷條件，并伴隨著乳中體細(xì)胞數(shù)上升和血液中某些免疫因子發(fā)生變化。經(jīng)轉(zhuǎn)換后的體細(xì)胞數(shù)（也稱為體細(xì)胞評分）與臨床乳房炎有較高的遺傳相關(guān)[5]，且在一個泌乳期中有多次記錄，增加了結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性。第三個原因是引起乳房炎的病原菌類型較為復(fù)雜。不同病原菌導(dǎo)致臨床乳房炎的表現(xiàn)可能不一致，其發(fā)病機制也有所不同，這無疑增加基因型與病原菌間互作的復(fù)雜性。

4 結(jié)論

CXCR1-816 A＞C突變與中國荷斯坦?；寂R床乳房炎次數(shù)和生產(chǎn)壽命有顯著相關(guān)， CXCR1-816 CC型基因型個體有較多的臨床乳房炎發(fā)病次數(shù)和較短的生產(chǎn)壽命，因此被提前淘汰。在進一步驗證其功能情況下，該位點可用于中國荷斯坦牛生產(chǎn)壽命的分子標(biāo)記輔助選擇。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Association Between SNPs in the CDS Regions of CXCR1 Gene and the Clinical Mastitis and Lifetime for Chinese Holstein

WANG MengQi1, NI Wei1, ZHANG HuiMin1, YANG ZhangPing1, WANG XiPu2, JIANG YanSen2, MAO YongJiang1,2
(1College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009;2Jiangsu Junlebao Dairy Co., Ltd., Xuzhou 221721, Jiangsu)

【Objective】 The objective of this study was to investigatethe association between the SNPs in the coding sequence (CDS) of CXCR1 gene and the clinical mastitis and lifetime for Chinese Holstein.【Method】SNPs in the CDS of CXCR1 gene were screened by using PCR and direct sequencing for 20 cows with low SCS and 20 cows with high SCS. Finally, the selected SNPs of CXCR1 gene for 866 Chinese Holstein cows were detected using flight mass spectrometry. The clinical mastitisand productive life of tested cows were collected from the management system of dairy farm. The association between the SNPs and the clinical mastitis and productive life of tested cows was analyzed using multi factor variance analysis, Logistic regression, Cox regression.【Result】A total of 13 SNPs were found in the CDS region of CXCR1 gene (291 C＞T, 333 C＞G, 337 A＞G, 365 C＞T, 570 A＞G, 642 A＞G, 735 C＞G, 816 A＞C, 819 A＞G, 980 A＞G、, 995 A＞G, 1008 C＞T and 1068 A＞G), and these SNPs were divided into 4 linkage groups，and four SNPs were selected from each linkage group for further analysis（642 A＞G, 816 A＞C, 980A＞G and 1068 A＞G). A total of 9 haplotypes were observed for 4 SNPs of CXCR1 gene, the GAGG haplotype frequency was the highest (0.3141), and the frequency of haplotype ACAA was the lowest (0.0017). CXCR1-642 A＞G showed a significant association with the number of dairy cows suffering from clinical mastitis in second lactation (P＜0.05). The number of dairy cows suffering from clinical mastitis for individual with AG genotype was significantly higher than that of AA genotype (P＜0.05). The number of dairy cows suffering from clinical mastitis for individual with CXCR1-816 AA genotype was significantly higher than that of AC and CC genotypes (P＜0.05). The other SNPs showed no significant association with the number of clinical mastitis. CXCR1-816 A＞C mutation showed an extremely significant association with culling age (P＜0.01) and a significant association with productive month and culling lactation (P＜0.05). The productive month, culling age and culling lactation for the individual of CXCR1-816 AA were significantly higher than that of CC genotype (P＜0.05). Cox regression showed that only CXCR1-816 showed significant association with the productive life（P＜0.05), the survival probability of individual with CC genotype was significantly lower than that of AA and AC genotype in each time period. 【Conclusion】The mutation of CXCR1-816 A＞C showed significant association with the clinical mastitis and lifetime for Chinese Holstein, and this SNP could be used for molecular marker-assisted selection of productive life for Chinese Holstein when the molecular function of this mutation were proved.

Chinese Holstein; CXCR1; SNPs; clinical mastitis; productive lifetime

2016-07-25；接受日期：2017-04-01

國家自然科學(xué)基金（31372286）、江蘇省優(yōu)勢學(xué)科（PAPD）、江蘇省企業(yè)研究生工作站資助

聯(lián)系方式：王夢琦, E-mail：770406499@qq.com 。通信作者毛永江，E-mail：cattle@yzu.edu.cn