張妹砣++李玉桑++葉曉雪

摘要：為建立中藥復(fù)方六神丸血漿藥物化學(xué)的研究方法，利用HPLC-UV技術(shù)分析比較了空白血漿、體內(nèi)六神丸血漿和體外六神丸血漿樣品成分的異同，鑒定了灌服六神丸后大鼠血漿中移行成分及其代謝產(chǎn)物的變化；檢測了不同時間點體內(nèi)六神丸血漿中成分的含量；測定了六神丸中對應(yīng)成分的標(biāo)準(zhǔn)品入血后，轉(zhuǎn)化為目標(biāo)峰12號物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明：大鼠灌胃六神丸后，HPLC圖顯示15個入血成分，其中10個成分為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，5個成分可能為六神丸所含成分的原型；六神丸經(jīng)大鼠體內(nèi)代謝后，在血漿中被檢測到的主要成分11號和12號移行成分，有良好的濃度-時間依賴性；六神丸中主要成分華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈均轉(zhuǎn)化成12號類移行成分，且12號成分的轉(zhuǎn)化率為：7.48%、2.93%、0.55%、0.94%。說明了大鼠灌胃六神丸后的血中移行成分及其代謝產(chǎn)物，可能為六神丸在體內(nèi)發(fā)揮作用的活性物質(zhì)群；而六神丸入血后的代謝變化規(guī)律，將為進(jìn)一步研究六神丸有效成分及作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：六神丸；血漿藥物化學(xué)；藥物代謝；HPLC

中圖分類號： R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：16749944（2017）12023704

1引言

六神丸是一種擁有100多年歷史，享譽(yù)國內(nèi)外的著名中成藥。六神丸由六味藥材配置而成，包括牛黃、珍珠、蟾酥、明雄黃、麝香、冰片。其具有清熱解毒、消腫止痛的作用[1，2]，應(yīng)用于咽喉腫痛、癰瘍疔瘡等?，F(xiàn)代中藥開發(fā)中，將六神丸應(yīng)用于更多疾病，如消炎、鎮(zhèn)痛、抗肝癌、抗腫瘤等[3～6]。對于六神丸成分的分析，曹陽等有相關(guān)報道[7～9]。本文基于對六神丸HPLC圖譜的分析，旨在建立六神丸血漿藥物化學(xué)的研究方法，從而為探究六神丸有效成分及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

目前對于中藥復(fù)方六神丸的有效成分研究過于分散而缺乏系統(tǒng)性，仍不能明確有效的物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥血漿藥物化學(xué)以中藥口服后含藥血漿為對象，綜合應(yīng)用多種現(xiàn)代技術(shù)，分析鑒定含藥血漿中的移行成分，包括中藥原型成分及其代謝產(chǎn)物，以研究中藥在體內(nèi)發(fā)揮作用物質(zhì) [11]。藥物無論經(jīng)過何種代謝必須由給藥部位進(jìn)入血液循環(huán)，以血液為介質(zhì)輸出到靶點，從而產(chǎn)生作用，中藥亦是如此。藥物進(jìn)入血液可能是其原形化合物，也可能是其代謝產(chǎn)物，還有可能是機(jī)體應(yīng)激產(chǎn)生的活性物質(zhì)發(fā)揮藥效[12～15]。本實驗通過對比分析空白血漿、體內(nèi)六神丸血漿、體外六神丸血漿、體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品血漿以及體外標(biāo)準(zhǔn)品血漿的HPLC-UV圖譜，研究六神丸進(jìn)入血液后的原形藥物及其代謝成分的變化狀況。以此逆向追溯六神丸藥效活性物質(zhì)群，有助于建立六神丸基于生物效應(yīng)的品質(zhì)評價指標(biāo)。

2材料與試劑

2.1儀器

儀器選用分析型高效液相色譜儀（Ultimate 3000 Pump、Ultimate 3000 Auto sampler、Ultimate 3000 Column Compartment、Ultimate 3000 Diode Array Detector）

2.2試劑

試劑包括：六神丸（上海雷允上藥業(yè)有限公司，批號：140701），5-羥色胺鹽酸（中國食品藥品鑒定研究院，批號：111656），華蟾毒它靈（上海源葉生物科技有限公司，批號：p24N7F25514），蟾毒它靈（上海源葉生物科技有限公司，批號：p12O7F22619），蟾毒靈（上海源葉生物科技有限公司，批號：W05D6Z7090），華蟾酥毒基（上海源葉生物科技有限公司，批號：W10O7Z22424），酯蟾毒配基（上海源葉生物科技有限公司，批號：PJ0727RB13）。乙腈為色譜純，乙酸乙酯（國藥 AR），其他試劑均為分析純。

2.3動物

健康雄性SD大鼠，體重220 g左右[湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018]。動物實驗員操作證號：TY20160044。

3方法

3.1六神丸灌胃藥液及標(biāo)準(zhǔn)品灌胃藥液的制備

將六神丸研磨成粉，稱取一定量六神丸粉末，配制成8.0 mg/mL的水溶藥液，超聲30 min，使其充分溶解，于4 ℃冰箱保存，備用。

將華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈配制成1 mg/mL的水溶液，超聲30 min，使其充分溶解，于4 ℃ 冰箱保存，備用。

3.2體內(nèi)六神丸血漿樣品和空白血漿樣品的制備

空白血漿的制備：健康SD大鼠4只，禁食12 h，灌胃生理鹽水，在1 h后，將每只大鼠摘眼球取血，各5 mL以上，置于含肝素鈉抗凝劑的離心管內(nèi)，備用。

體內(nèi)六神丸血漿樣品制備：健康SD大鼠3只，禁食12 h，灌胃六神丸水溶液（36.0 mg/kg）約1 mL，給藥1 h后，每只大鼠摘眼球取血5 mL以上，置于含肝素鈉抗凝劑的離心管內(nèi)，制備3份樣品備用。

取以上制備的樣品各5 mL，加入25 mL乙酸乙酯，漩渦混懸30 s，3000 r/min離心5 min，取上清液；將沉淀再加25 mL乙酸乙酯，旋窩混懸30 s，3000 r/min離心5 min，取上清液。合并兩次上清，揮干溶劑，在進(jìn)樣前加入300 μL甲醇，使充分溶解后，用0.45 μm 的濾頭過濾備用。

3.3體外六神丸血漿樣品的處理

為減小藥物與血液樣品處理方法不同所帶來的誤差，取3.1節(jié)條件下制備的六神丸灌胃液1 mL和5 mL空白血漿混合，漩渦混懸30 s，靜置1 h，按照血漿樣品處理方法進(jìn)行預(yù)處理，平行制備3份樣品備用。

3.4不同時間點含藥血漿樣品的處理

健康SD大鼠15只，禁食12 h，分成0.5、1、3、6、24 h五組，每組三只大鼠，每組大鼠灌胃六神丸水溶液（36 mg/kg）一次，約1 mL，在給藥后0.5、1、3、6、24 h的時間點，每組大鼠摘眼球取血5 mL以上，置于含肝素鈉抗凝劑的離心管內(nèi)。每份樣品取血漿5 mL，加25 mL乙酸乙酯，漩渦混懸30 s，3000 r/min離心5 min，取上清液；將沉淀再加25 mL乙酸乙酯，旋窩混懸30 s，3000 r/min離心5 min，取上清液。合并兩次上清，揮干溶劑，在進(jìn)樣前加入300 μL甲醇，使充分溶解后，用0.45 μm的濾頭過濾，制備得到15份樣品，備用。

3.5體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品的處理

健康SD大鼠15只，禁食12 h，分成華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈五組，每組3只，將3.1節(jié)條件下制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液給每組大鼠灌胃（5.0 mg/kg）約1 mL，每組給藥1 h后，每只大鼠摘眼球取血5 mL以上，置于含肝素鈉抗凝劑的離心管內(nèi)。每份樣品取血漿5 mL，加25 mL乙酸乙酯，漩渦混懸30 s，3000 r/min，離心5 min取上清液；將沉淀再加25 mL乙酸乙酯，旋窩混懸30 s，3000 r/min，離心5 min取上清液。合并兩次上清，揮干溶劑，進(jìn)樣前加入300 μL甲醇，使其充分溶解，0.45 μm濾頭過濾，制備15份樣品以備用。

3.6體外標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品的處理

為減小藥物與血液樣品處理方法不同所帶來的誤差，取3.1節(jié)條件下制備的5種標(biāo)準(zhǔn)品樣品各1 mL，分別與5 mL空白血漿混合，漩渦混懸30 s，靜置1 h，按照血漿樣品處理方法進(jìn)行預(yù)處理。每種標(biāo)準(zhǔn)品平行制備3組備用。

3.7高效液相色譜條件

DIONEX ultimate 3000 高效液相色譜儀；DIONEX C18色譜柱（250 ×4.6 mm， 5 μm），流動相為乙腈（A）和0.1%三氟乙酸水溶液（B）。梯度洗脫，0～3 min，5%（A）；3～13 min，5%～12%（A）；13～15 min，12%～20%（A）；15～25 min，20%～30%（A）；25～30 min，30%～51%（A）；30～50 min，51%（A）；50～60 min，5%（A）。體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長296 nm，柱溫30 ℃。

張妹砣，等：六神丸血漿藥物化學(xué)的研究

生物與化工

4結(jié)果與分析

4.1六神丸入血后移行成分的分析

將空白血漿樣品、體內(nèi)六神丸血漿樣品和體外六神丸樣品在2.7色譜條件下進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL。相對空白血漿樣品的HPLC圖，體內(nèi)六神丸血漿樣品的HPLC圖中出現(xiàn)了14個移行成分，如圖1。與體外六神丸樣品比較，其中10、11、12、13、14號等五個成分保留時間與原型成分相同，可能為六神丸中所含的原型成分直接吸收入血。其中11號和12號移行成分相對其他成分含量顯著較高，而體外六神丸血漿樣品中所含的大部分原型成分在體內(nèi)已明顯下降甚至消失。其它9個成分為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，可能是六神丸中其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，也可能是體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。六神丸灌胃后入血的14種成分為六神丸在體內(nèi)直接作用物質(zhì)，研究其變化規(guī)律將有利于進(jìn)一步探究其活性成分和作用機(jī)理。

4.2六神丸入血后成分含量變化的檢測

在3.4節(jié)條件下，制備不同時間點的體內(nèi)六神丸血漿樣品，在3.7節(jié)條件下進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL。如圖2-A所示，有部分代謝產(chǎn)物如10、11、12、14號移行成分含量逐漸增加，其中11號和12號移行成分隨著時間延長，濃度顯著增加，呈現(xiàn)濃度-時間依賴關(guān)系。以峰面積為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，建立關(guān)系曲線，如圖2-B所示，可發(fā)現(xiàn)12號移行成分的濃度在6 h累計達(dá)到最大值，之后隨著時間延長呈緩慢降低趨勢。11號移行成分的濃度隨著時間延長不斷增加。另一方面，隨著時間延長，有的代謝產(chǎn)物逐漸減少如13號移行成分，有些甚至消失如5、6、9號三個移行成分。在24 h時，還產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物15號成分。值得注意的是，增加的10、11、12、14號移行成分與六神丸中主要原型成分的保留時間十分相近，可能為原型產(chǎn)成分。而減少的5、6、9號物質(zhì)應(yīng)為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。由此可知，六神丸灌胃后，有的以原型入血，且不斷通過其他成分轉(zhuǎn)化或體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)生成，使得含量不斷增加。部分轉(zhuǎn)化為新的代謝產(chǎn)物，由于缺少來源，逐漸減少甚至消失。而15號峰可能為體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。由此可見，六神丸的藥效關(guān)系是復(fù)雜多變的，不是單成分代謝反應(yīng)的疊加，而是受機(jī)體吸收、代謝及成分間相互作用的綜合影響，使得中藥復(fù)方六神丸比單味藥、單體用藥效果更顯著。

4.3標(biāo)準(zhǔn)品入血后移行成分的分析

在3.5節(jié)條件下制備的體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品，在3.6節(jié)條件下制備的體外標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品，在3.7節(jié)的條件下進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL。如圖3所示，對比標(biāo)準(zhǔn)品在體外、體內(nèi)的成分變化，發(fā)現(xiàn)六神丸中華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈在

體內(nèi)代謝后進(jìn)入血漿的成分，主要為10、11、12、13號移行成分，主要轉(zhuǎn)化為12號移行成分。將12號移行成分的峰面積與體外標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積相比，推測華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈轉(zhuǎn)化成12號移行成分的轉(zhuǎn)化率為：7.48%、2.93%、0.55%、0.94%。由此可見，華蟾酥毒基轉(zhuǎn)化率相對最高，酯蟾毒配基的轉(zhuǎn)化率次之，蟾毒靈的轉(zhuǎn)化率最低，同時，華蟾酥毒基在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為10、11號物質(zhì)對應(yīng)的峰面積也是最高的。這與六神丸體內(nèi)代謝的移行成分的分析相契合，說明六神丸中的大部分成分在體內(nèi)主要轉(zhuǎn)化為12號類物質(zhì)，發(fā)揮有效或制毒作用。在本實驗室之前的工作中，發(fā)現(xiàn)六神丸醇提物對抗肝癌活性較六神丸水提物強(qiáng)[2]，對六神丸的各成分含量分析發(fā)現(xiàn)，在其他成分含量相當(dāng)?shù)那疤嵯?，六神丸醇提物中的華蟾酥毒基與酯蟾毒配基的含量是六神丸水提物的四倍，這與血漿中華蟾酥毒基與酯蟾毒配基的代謝分析相契合。推測華蟾酥毒基、酯蟾毒配基以及代謝生成的12號移行成分，可能是六神丸發(fā)揮作用的有效物質(zhì)。

2017年6月綠色科技第12期

5結(jié)語

六神丸是傳統(tǒng)中藥名方，對其藥物代謝研究得較少，對體內(nèi)血漿藥物化學(xué)鮮有報道。在血漿樣品的制備中，對比了甲醇、乙腈、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷提取血漿中六神丸成分的效果，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯的提取效果最佳且穩(wěn)定，對樣品也不造成的干擾。每組制備的三份平行樣品，相同條件下進(jìn)樣分析所得HPLC圖譜相似，以其中最大峰為指標(biāo)，測定峰面積的RSD值均小于5.32，說明本系統(tǒng)的方法穩(wěn)定，具有重現(xiàn)性。

本文首次建立了體內(nèi)六神丸血漿成分的HPLC圖，并實現(xiàn)所有成分的有效分離，與體外六神丸的HPLC圖進(jìn)行對比分析，探索六神丸進(jìn)入體內(nèi)的成分代謝變化，利用標(biāo)準(zhǔn)品體內(nèi)、體外的HPLC圖對比，發(fā)現(xiàn)其都向12號物質(zhì)移行，這體內(nèi)六神丸血漿樣品的主要成分分析相契合。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，部分揭示了六神丸入血后移行成分變化規(guī)律，為之后六神丸有效成分研究奠定基礎(chǔ)，也為六神丸的再開發(fā)提供參考與借鑒。

該研究結(jié)果也表明，要確定中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，不僅要研究體外藥物的成分變化，其關(guān)鍵在于要明確中藥復(fù)方是以何種形態(tài)入血、入血后如何變化、復(fù)方配伍對血中成分產(chǎn)生的影響，只有把握中藥復(fù)方的內(nèi)在實質(zhì)，才能實現(xiàn)中藥復(fù)方研究的科學(xué)化與現(xiàn)代化。至于11、12號物質(zhì)的具體結(jié)構(gòu)，有待進(jìn)一步的研究。

注：A蟾毒靈、C華蟾毒它靈、E酯蟾毒配基、G華蟾酥毒基；大鼠灌胃標(biāo)準(zhǔn)品取血漿的體內(nèi)六神丸血漿樣品HPLC圖：B蟾毒靈、D華蟾毒它靈、F酯蟾毒配基、H華蟾酥毒基

圖3標(biāo)準(zhǔn)品與血漿混合制備的體外樣品HPLC

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