菅志遠(yuǎn)，沈先鋒，方 程，高 義

1. 十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院) 肝膽胰外科診療中心，湖北 十堰 442000；2. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院 循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，武漢 430071

EphA2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其信號(hào)調(diào)控機(jī)制

菅志遠(yuǎn)1，沈先鋒1，方 程2，高 義1

1. 十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院) 肝膽胰外科診療中心，湖北 十堰 442000；2. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院 循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，武漢 430071

〔目的〕探討EphA2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其信號(hào)調(diào)控機(jī)制?！卜椒ā硄RT-PCR法檢測EphA2在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，篩選得到表達(dá)量較高細(xì)胞株系，利用siRNA沉默該細(xì)胞系中EphA2的表達(dá)，利用MTT、Transwell、Western blot、qRT-PCR法檢測細(xì)胞生物學(xué)功能變化及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)變化?！步Y(jié)果〕在人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HT29和SW480中篩選得到EphA2高表達(dá)細(xì)胞HCT116，構(gòu)建載體EphA2-siRNA并成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞HCT116。MTT、Transwell法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，EphA2-siRNA組中細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。qRT-PCR和westernblot分析表明，與對照組相比，EphA2-siRNA組中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白E-cadherin、TCF-4、β-catenin和p-GSK-3βSer9的表達(dá)量均呈現(xiàn)下降趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?！步Y(jié)論〕 結(jié)直腸癌細(xì)胞中EphA2的表達(dá)與結(jié)直腸癌的進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，EphA2可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展。

EphA2；Wnt/β-catenin信號(hào)通路；結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。近幾年，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人們的健康[1]。外科手術(shù)治療、放療、化療等綜合治療措施的應(yīng)用使結(jié)直腸癌的治愈率有了很大提高，但癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然導(dǎo)致大多數(shù)患者復(fù)發(fā)、死亡[2]。Eph基因家族，具有受體酷氨酸激酶的活性，在對腫瘤細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移等相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控過程中起到關(guān)鍵性的作用[3]。EphA2是Eph家族中的一員，研究[4]發(fā)現(xiàn)，該基因在多種腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過檢測EphA2在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，利用siRNA沉默結(jié)直腸癌細(xì)胞EphA2的表達(dá)，檢測細(xì)胞生物學(xué)功能變化及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)變化，闡述EphA2可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與藥物

結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、HT29、SW480購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所；1640培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000以及siRNA購于美國Therm公司；MTT試劑、抗EphA2單抗以及二抗購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；CO2培養(yǎng)箱和SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)購自美國Therm公司；7700型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng)

結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、HT29、SW480，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清1640培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；1～2 d更換培養(yǎng)基，2～4 d用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞消化稀釋，將稀釋后的siRNA與LipofectamineTM2000混合，室溫靜置20 min，使之充分混勻；將上述混合液加入6孔板，即維持siRNA轉(zhuǎn)染濃度50 mmol/L，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，充分混勻，6 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 qRT-PCR檢測EphA2 mRNA的表達(dá)

北方欠發(fā)達(dá)地區(qū)由于水資源短缺，工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受到影響，如甘肅石羊河流域的農(nóng)田大面積無法耕種，煤化工等耗水產(chǎn)業(yè)不能就近布局。南方部分欠發(fā)達(dá)省份的一些地區(qū)受水污染影響，農(nóng)田無法耕種，“癌癥村”出現(xiàn)，城市不得不舍近求遠(yuǎn)尋找新水源?？梢姡钒l(fā)達(dá)地區(qū)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展受到的水資源制約也日趨明顯。

收集對數(shù)期細(xì)胞，提取總RNA，合成cDNA, 使用ABI 7900HTSequence Detection System進(jìn)行PCR反應(yīng)，數(shù)據(jù)應(yīng)用2-ΔΔCt分析。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖

接種細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1×104/mL，每孔吸取200 μL加入96孔板；放入CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液1次；按實(shí)驗(yàn)既定時(shí)間點(diǎn)，分別培養(yǎng)至24、48、72 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h；吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，充分溶解紫色結(jié)晶物；酶聯(lián)免疫檢測儀處測定各孔OD值，波長設(shè)置為450 nm。

1.6 Western blot 檢測各受體蛋白的表達(dá)

收集對數(shù)期生長細(xì)胞，破碎細(xì)胞提取蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，依次加一抗、二抗孵育洗膜，成像儀檢測結(jié)果。具體實(shí)驗(yàn)方法參照已發(fā)表文章[5]。

1.7 Transwell檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

定量變量用mean±SD表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析EphA2對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的增殖、侵襲和遷移的影響，比較各受體蛋白、mRNA表達(dá)的影響。

2 結(jié)果

2.1EphA2在HCT116細(xì)胞中高表達(dá)

使用qRT-PCR檢測EphA2在人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HT29和SW480中的表達(dá)。結(jié)果顯示，在HCT116中EphA2mRNA的表達(dá)水平高于其他細(xì)胞(圖1)。因此，選擇HCT116細(xì)胞進(jìn)行研究。

圖1 EphA2在各結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

2.2 干擾EphA2表達(dá)抑制HCT116細(xì)胞的增殖

在HCT116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA，干擾EphA2表達(dá)，并用MTT檢測對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，EphA2-siRNA組中細(xì)胞的增殖受到抑制，且差異顯著(P<0.05)，見圖2。

圖2 EphA2不同表達(dá)量對于細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 干擾EphA2 抑制HCT116細(xì)胞的侵襲和遷移能力

為了評(píng)價(jià)EphA2對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響，我們分別進(jìn)行了鋪或不鋪Matrigel的Transwell實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染EphA2-siRNA的HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移至小室下層的細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組，差異明顯(P<0.05)，見圖3。表明干擾EphA2的表達(dá)可以抑制HCT116細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

圖3 EphA2對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

2.4EphA2-siRNA對Wnt/β-catenin通路中E-cadherin、TCF-4及β-catenin表達(dá)的影響

利用qRT-PCR和westernblot實(shí)驗(yàn)分別檢測EphA2-siRNA組、EphA2-non組和Blank(空白)組中E-cadherin、TCF-4及β-catenin蛋白的表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，EphA2-siRNA組中3種mRNA的表達(dá)均下降，且結(jié)果差異顯著(P<0.05)，見圖4。

圖4 不同表達(dá)量的EphA2對Wnt/β-catenin通路中3種蛋白表達(dá)量的影響

Westernblot結(jié)果也一樣，跟對照組相比3種蛋白的表達(dá)均有所下降，見表1。

表1 western blot 實(shí)驗(yàn)檢測3種蛋白條帶強(qiáng)弱百分比(%)

2.5EphA2-siRNA對HCT116細(xì)胞GSK-3β和磷酸化GSK-3βSer9表達(dá)變化的影響

采用westernblot方法分別檢測GSK-3β和磷酸化p-GSK-3βSer9蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，EphA2-siRNA組，EphA2-non組和Blank(空白)3組中，GSK-3β蛋白條帶亮度無明顯差別；而p-GSK-3βSer9蛋白條帶亮度有明顯差異 ，與對照組相比，p-GSK-3βSer9在EphA2-siRNA組的表達(dá)水平下降。見表2。

表2 western blot 檢測GSK-3β、p-GSK-3βSer9 蛋白條帶強(qiáng)弱百分比(%)

3 討論

隨著生活習(xí)慣及生存環(huán)境的變化，癌癥發(fā)病率持續(xù)增高，結(jié)直腸癌作為一種常見的消化道腫瘤，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康[6]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織近年的研究報(bào)告，2012年全球約有136萬人被確診為結(jié)直腸癌，其數(shù)量之大使結(jié)直腸癌在惡性腫瘤中排名前3位，僅次于肺癌和乳腺癌。此外，統(tǒng)計(jì)結(jié)果[7]顯示，約有69萬結(jié)直腸癌患者死亡，位居所有惡性腫瘤第4位。更令人擔(dān)憂的是，結(jié)直腸癌在全球的發(fā)病率及死亡率不斷攀升，且發(fā)病的地域分布也存在很大差異。據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病率也呈逐年遞增的趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的生命安全，給社會(huì)造成了極大的壓力。隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，已經(jīng)有很多先進(jìn)的技術(shù)可以應(yīng)用到癌癥的治療當(dāng)中，其中主要包括了手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療以及放射性療法。雖然這些方法也被應(yīng)用到結(jié)直腸癌的治療中，但是，目前此疾病的預(yù)后仍不樂觀[8]。因此，對于疾病發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的分子及分子機(jī)制的研究，對于進(jìn)一步探究結(jié)直腸癌的治療靶位點(diǎn)以及完善發(fā)展此疾病的治療方法具有重要的意義。

EphA2屬于目前已知的受體酪氨酸激酶(RTKs)最大亞族Eph基因家族，具有重要的受體酪氨酸激酶活性，因此參與了眾多的細(xì)胞生物學(xué)過程[9]。在癌癥細(xì)胞中，Christiansen等[3]發(fā)現(xiàn)，Eph基因在腫瘤細(xì)胞的生長、分化、增殖和遷移等過程中具有重要作用，參與了某些癌癥的發(fā)生及發(fā)展過程。Cui等[10]研究表明，EphA2高表達(dá)于很多上皮來源的腫瘤中，并且可以在一定程度上影響腫瘤的轉(zhuǎn)移以及癌癥預(yù)后。在胃癌相關(guān)研究中，癌癥樣品檢測到了表達(dá)量顯著增加的EphA2基因，并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明了高表達(dá)的EphA2可以通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。對于結(jié)直腸癌，已有研究[12]證明EphA2可以作為有效的癌癥預(yù)后標(biāo)志物。然而，EphA2在結(jié)直腸癌的生物學(xué)作用以及其發(fā)揮作用的機(jī)制研究尚不清楚。

本研究針對目前EphA2在癌癥中的研究成果，旨在進(jìn)一步分析該基因在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能以及潛在的信號(hào)調(diào)控機(jī)制。通過在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的研究，我們發(fā)現(xiàn)抑制EphA2的表達(dá)量可以顯著降低癌細(xì)胞的增殖能力。此外，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞EphA2的表達(dá)，細(xì)胞的侵襲和遷移同時(shí)也一定程度上有所降低。以上結(jié)果說明，EphA2參與了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的生物學(xué)過程，對癌癥的發(fā)生和發(fā)展具有重要的作用。同時(shí)，我們實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步探究了EphA2發(fā)揮作用潛在的生物學(xué)機(jī)制。通過使用qRT-PCR以及westernblot法對相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)量的分析，我們證明了EphA2極有可能是通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長和發(fā)展，從而參與到癌癥的進(jìn)程當(dāng)中。

綜合以上研究結(jié)果，我們證明了EphA2基因參與了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移幾個(gè)生物學(xué)過程，并且通過潛在的Wnt/β-catenin信號(hào)通路途徑在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。

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[責(zé)任編輯 時(shí) 紅]

Biological Functions and Regulatory Mechanisms of EphA2 in Colorectal Carcinoma

JIAN Zhiyuan1, SHEN Xianfeng1, FANG Cheng2, GAO Yi1

1. Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Taihe Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China; 2. Center for Evidence-Based and Translational Medicine, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China.

〔Objective〕To investigate the biological function and mechanism of EphA2 in colorectal cancer. 〔Methods〕The expression of EphA2 in colorectal cancer cell lines were detected by qRT-PCR, screened one cell lines with higher EphA2 expression. Silenced the expression of EphA2 in the cell line which we screened by siRNA technology.〔Results〕The results of MTT and Transwell analysis showed that inhibition of the EphA2 expression could suppress the proliferation, invasion and metastasis of the colorectal carcinoma cells (allP<0.05).AccordingtoqRTPCRandwesternblot,theexpressionofrelatedcrucialproteinofWnt/βcateninpathway,includingE-cadherin,TCF-4andβcatenin,andp-GSK-3βSer9weresignificantdecreasedintheEphA2-siRNAgroup(P<0.05forall). 〔Conclusion〕EphA2 was involved in the development of colorectal carcinoma, and it might participate the tumor progression mediated by Wnt/β catenin pathway.

EphA2; Wnt/β catenin signal path; colorectal carcinoma

1672-7606(2017)02-0115-04

2017-02-21

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(D20152012)

菅志遠(yuǎn)(1975-)，男，河南襄城人，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：消化道腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究。

R735.3

A