殷 杰， 胡 南， 李 樂， 謝紅艷，唐正午， 趙維超， 丁德馨

(南華大學(xué) 藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

Cs137輻照對甲狀腺FRTL細胞RET及RAS-MAPK信號通路的影響

殷 杰， 胡 南， 李 樂， 謝紅艷，唐正午， 趙維超， 丁德馨

(南華大學(xué) 藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

探討不同劑量的Cs137對甲狀腺FRTL細胞RET蛋白以及下游MAPK信號通路的影響.通過不同劑量 (0.05,0.1,0.15,0.2,0.5,1 Gy) Cs137，對甲狀腺FRTL細胞進行輻照，MTT法檢測細胞增殖抑制率，Western blot檢測未輻照組，輻照敏感組和輻照抗性組中RET及下游RAS、RAF、MEK蛋白表達情況.結(jié)果：甲狀腺FRTL細胞在0.2 Gy輻照時輻照敏感度增加；而到1 Gy輻照時輻照抗性增加. 在0.2 Gy輻照敏感條件下，誘導(dǎo)RET、RAS、RAF、MEK蛋白表達下調(diào)；而當1 Gy 輻照時，RET、RAS、BRAF、MEK蛋白表達上調(diào).不同劑量Cs137輻照能夠誘導(dǎo)RET蛋白表達，對后面MAPK信號通路存在影響，最終影響到甲狀腺FRTL細胞的細胞增殖抑制率，誘導(dǎo)甲狀腺低劑量輻射致癌成為可能.圖3，表2，參12.

甲狀腺FRTL細胞；低劑量輻射；RET；MAPK信號

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的一類癌癥.其中甲狀腺乳頭狀癌是發(fā)病率最高的甲狀腺惡性腫瘤，占甲狀腺癌的70%～80%，占全身惡性腫瘤的1%～2%[1]，女性多見，近年來其發(fā)病率有上升趨勢.

目前對甲狀腺癌發(fā)生的分子機制的研究較少.近年來研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺癌中，存在一種原癌基因RET基因，與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系[2].輻射可促使DNA的雙鏈斷裂，從而引起RET基因激活[4].Collins等[5]研究證實了RET基因激活與放射暴露因素密切相關(guān)[6].RET癌基因活化已經(jīng)確定,其與輻照劑量關(guān)系尚未明確,RET受輻射劑量影響誘導(dǎo)甲狀腺致癌成為研究的重點.

RAS/RAF/MEK通路是“MAPK”眾多信號通路中的一個分支[7-12]，該通路與細胞的生長、增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移緊密相關(guān).RAS基因的激活，可誘導(dǎo)甲狀腺癌細胞異常增殖，侵襲生長和轉(zhuǎn)移.因此，RAS/RAF/MEK信號通路將成為甲狀腺癌發(fā)生的一個重要通路，該信號傳導(dǎo)通路的異常激活與甲狀腺癌的發(fā)生及惡性進展密切相關(guān).

1 材料與方法

1)甲狀腺FRTL細胞(ATCC細胞株)購于上海拜力生物科技有限公司.

2)將輻照細胞密度調(diào)整為5×105細胞/mL，再取用5×106個細胞及10 mL細胞溶液移至新培養(yǎng)瓶，待細胞貼壁完全，即可用于輻照.采用不同劑量(0.05,0.1,0.15,0.2,0.5,1,2 Gy)Cs137輻照甲狀腺FRTL細胞后將其接種于96孔板，每孔1×104個細胞，八個劑量組(0.05,0.1,0.15,0.2,0.5,1,2 Gy)，每組種植10個復(fù)孔，分別培養(yǎng)(3，9 h)后，加入cck-8試劑(每孔10 μL)置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)3 h后，在酶聯(lián)免疫儀450 nm波長下測吸光度OD450值，根據(jù)公式計算出各組細胞的細胞增殖抑制率.

3)Western Blot檢測未輻照組、低劑量輻射敏感組(0.2 Gy)和輻射抗性組(1 Gy)中RET，RAS，RAF和MEK蛋白表達情況.

4)實驗數(shù)據(jù)結(jié)果均采用單因素方差分析，并通過SPSS13.0軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析，顯著性標準為P<0.05.

2 結(jié) 果

1)甲狀腺FRTL細胞生長情況

甲狀腺細胞FRTL細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10 %新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞經(jīng)傳代和收集，取對數(shù)生長期細胞進行實驗.生長情況見圖1.

圖1 甲狀腺FRTL細胞觀察圖(放大倍數(shù)：10×和40×)Fig.1 Observation of thyroid FRTL cells (Magnification: 10 × and 40 ×)

2)不同劑量固定輻照的Cs137對甲狀腺FRPL細胞增殖抑制率的影響

根據(jù)細胞增殖抑制率公式：

IR(inhibitor rate)(%)=(1-輻照組OD450值/未輻照組OD450均值)×100%

計算出輻照6 h和12 h后所對應(yīng)的細胞增殖抑制率，見表1和圖2.

圖2 不同劑量Cs137固定輻照甲狀腺FRPL細胞6h、12h細胞增殖抑制率(%)Fig 2 Different dose of Cs137 fixed irradiated FRTL cells in cell proliferation inhibition rate after 6 and 12 hours 0.2和0.5 Gy輻照劑量組與其他輻照劑量組比較：細胞增殖抑制率有顯著性差異，*P<0.05.

輻照值/Gy0.050.10.150.20.5126h4.20±0.477.44±0.317.52±0.5531.94±1.31*25.61±1.48*6.79±0.448.01±0.9012h12.36±0.5715.76±0.5019.81±0.4839.69±1.53*33.29±1.43*3.67±0.473.00±0.36

0.2和0.5Gy輻照劑量組與其他輻照劑量組比較：細胞增殖抑制率有顯著性差異，*P<0.05.

通過對結(jié)果分析：細胞輻照敏感性與輻照劑量有直接關(guān)系，低劑量超輻射敏感性(HRS)是指細胞在收到單位低劑量輻射時所導(dǎo)致細胞存活分數(shù)下降度較大，敏感性增高，一般發(fā)生在0.2～0.5 Gy范圍內(nèi)，隨著照射劑量增大(0.5～1 Gy)出現(xiàn)敏感下降，即增加輻射抗拒現(xiàn)象(IRR).在低于臨界劑量閾值時不足以觸發(fā)細胞內(nèi)的修復(fù)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞高致死.即HRS，高于該臨界值時觸發(fā)細胞內(nèi)修復(fù)反應(yīng)，使得細胞存活率增高即IRR.低劑量輻射敏感點和抗性點是研究甲狀腺FRTL細胞低劑量輻射敏感性的重要檢測點,選定0.2 Gy為甲狀腺FRTL細胞低劑量輻射敏感點，1 Gy為甲狀腺FRTL細胞輻射抗性點.

3) 不同劑量Cs137對甲狀腺FRTL細胞中RET蛋白及RAS，RAF和MEK蛋白影響

Westernblot 檢測未輻照組，輻照敏感組(0.2 Gy)和輻照抗性組(1 Gy)中RET、RAS、RAF和MEK蛋白表達情況，結(jié)果如下，見圖3.

圖3 Western blot檢測未輻照組，低劑量輻射敏感組(0.2 Gy)和輻射抗性組(1 Gy)中RET、RAS、RAF和MEK蛋白表達情況.Fig 3 Western blot was used to detect the expression of RET,RAS and MEK protein in untreated group,low dose radiation sensitive group (0.2 Gy) and radiation resistant group (1 Gy)

從Western結(jié)果：低劑量敏感組(0.2 Gy)RET,RAS,RAF和MEK表達量較未輻照組(0 Gy)和輻射抗性組(1 Gy)表達量低，有顯著性差異(P<0.05).說明在0.2 Gy輻照條件下，Cs137抑制RET蛋白表達，從而引起下游RAS、RAF、MEK蛋白表達也相應(yīng)降低；而當1 Gy 輻照時，Cs137重新激活RET蛋白表達，并引起下游RAS、RAF、MEK蛋白表達增加.說明不同劑量Cs137對RET蛋白及其下游RAS、RAF、MEK蛋白表達不同.

表2 Western Blot檢測未輻照組、低劑量輻射敏感組(0.2 Gy)和輻射抗性組(1 Gy)中RET,RAS,RAF,MEK蛋白結(jié)果

低劑量輻照敏感組(0.2 Gy)與未輻照組和輻射抗性組(1 Gy)比較： RET、RAS、RAF和MEK蛋白均有顯著性差異，*P<0.05.

3 討 論

RET 作為原癌基因，能夠編碼跨膜的酪氨酸蛋白激酶受體，RET蛋白的酪氨酸激酶功能區(qū)發(fā)生自動磷酸化而激活，通過RAS/有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)途徑，從而對細胞進行調(diào)節(jié).而RAS是調(diào)節(jié)細胞生長的重要蛋白，其中RAS與腫瘤有緊密相關(guān)，它在腫瘤細胞表達可高達80%，RAS高表達會引起輻射抗性，說明抗輻射作用與RAS活性相關(guān).RAS基因改變可以影響細胞對輻射的敏感度，RAS通過哪些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)細胞的輻射抗性還不完全清楚.RAS-MAPK信號通路是細胞與輻射抗性相關(guān)的重要信號途徑，它在多種致瘤性疾病中通常是上調(diào)的.同樣，該信號傳導(dǎo)通路的異常激活與甲狀腺癌的發(fā)生及惡性進展密切相關(guān).RAS-MAPK通路在正常細胞中表達式如何的？它的上游因子是誰？它的表達高低與輻射劑量之間到底存在什么樣的關(guān)系？這些都是丞待解決的問題.

通過實驗發(fā)現(xiàn)在低劑量0.2 Gy輻照時，可以抑制RET蛋白表達，從而抑制下游RAS/RAF/MEK蛋白表達，引起甲狀腺FRTL細胞對輻照敏感度增加；而在1 Gy輻照時，刺激RET蛋白高表達，并誘導(dǎo)下游RAS/RAF/MEK蛋白表達，甲狀腺FRTL細胞對輻照產(chǎn)生抗性. 說明RET蛋白是RAS-MAPK上游的一個很重要的調(diào)控因子，不同劑量Cs137通過調(diào)控RET及其下游RAS-MAPK相關(guān)蛋白表達，最終影響甲狀腺FRTL細胞輻射敏感性.另外RET,RAS蛋白作為原癌基因被廣泛被關(guān)注，低劑量輻射致癌成為當前研究的一項重要熱點，在1 Gy固定輻照后RET、RAS蛋白高表達，甲狀腺低劑量輻射致癌成為可能.

總之，RET和RAS-MAPK信號途徑 與正常細胞輻射致癌之間關(guān)系緊密相關(guān).從分子水平揭示正常細胞低劑量輻射致癌的機制至關(guān)重要，有望為正常細胞輻射防護開拓新的思路.

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Biography： YIN Jie,male,born in 1981,master,research direction: radioprotection

Cs137on RET and RAS-MAPK Signaling Pathway in FRTL Cells

YIN Jie, HU Nan, LI Le, XIE Hong-yan, TANG Zheng-wu,ZHAO Wei-chao, DING De-xin

(College of Pharmacy and Biological Sciences,University of South China,Hengyang,421001 China)

Objective: To investigate the effect of different doses of Cs137on RET protein and MAPK signaling pathway in FRTL cells. Methods: Thyroid FRTL cells were irradiated with different doses (0.05,0.1,0.15,0.2,0.5,1 Gy) Cs137. MTT assay was used to detect the cell proliferation inhibition rate. The expression of RET,RAS,RAF and MEK protein in untreated group,irradiated sensitive group and irradiated resistant group were detected by Western blot. Results: The irradiation sensitivity of thyroid FRTL cells decreased at 0.2 Gy,while the irradiation resistance increased when irradiated at 1 Gy. The expression of RET,RAS,RAF and MEK protein was down-regulated under 0.2 Gy irradiation,while the expression of RET,RAS,RAF and MEK was up-regulated when 1 Gy was irradiated. Conclusion: Different doses of Cs137can induce the expression of RET protein,which may affect the subsequent MAPK signal pathway,and ultimately affect the cell proliferation inhibition rate of FRTL cells and induce the thyroid cancer.3figs.,2tabs.,12refs.

Thyroid FRTL cells; low dose radiation; RET; MAPK signal

2017-04-18

湖南省教育廳項目(編號：14C0998)；湖南省研究生創(chuàng)新項目(編號：CX2015B386)；衡陽市科技局項目(編號：2014KJ07)

殷杰(1981-)，男，湖南長沙人，碩士，研究方向：輻射防護.

10.3969/j.issn.2095-7300.2017.02-031

R144.1,R146

A