韓穎，呂曉玲

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

竹柳葉中黃酮類(lèi)化合物的提取工藝和成分分析研究

韓穎，呂曉玲

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

以竹柳葉為原料，采用乙醇回流提取法對(duì)竹柳葉黃酮的提取工藝進(jìn)行研究，確定最優(yōu)提取工藝，并對(duì)黃酮類(lèi)成分進(jìn)行初步分析。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黃酮得率為指標(biāo)，選取提取溫度、料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用高效液相-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜（LCMS-IT-TOF）技術(shù)對(duì)黃酮成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明：竹柳葉黃酮的最佳提取工藝為提取溫度80℃、料液比1∶40（g/mL）、乙醇濃度55%、提取時(shí)間2 h，此條件下，黃酮得率為4.0%。共推測(cè)出6種黃酮類(lèi)化合物，即異牡荊素-7-O-葡萄糖苷、蘆丁、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、芹黃素-7-O-葡萄糖醛酸苷、金圣草素-葡萄糖醛酸苷。

竹柳葉；黃酮；提取；分析

竹柳為楊柳科柳屬植物，是從美國(guó)引進(jìn)的一個(gè)多元雜交速生新樹(shù)種，屬于落葉喬木，生長(zhǎng)潛力大。該樹(shù)種速生性好、高密植性、適應(yīng)性強(qiáng)，是一種良好的木材，常用于生產(chǎn)新型燃料，防風(fēng)固沙，保護(hù)生態(tài)環(huán)境[1]。竹柳在工業(yè)生產(chǎn)，環(huán)境保護(hù)等方面作用巨大，但目前對(duì)于竹柳中的活性成分還沒(méi)有研究，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)竹柳葉中含有較高含量的黃酮類(lèi)化合物，對(duì)竹柳的綜合利用起到一定作用。

黃酮類(lèi)化合物是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類(lèi)化合物[2]，黃酮類(lèi)化合物以C6-C3-C6的形式建立其骨架，而苯基間的三碳橋常與氧發(fā)生環(huán)化[3]。分為黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、異黃酮類(lèi)、黃烷酮類(lèi)等。黃酮類(lèi)化合物具有多種生理活性，人體攝入后具有較強(qiáng)的抗氧化作用，以及明顯的降血脂、抗衰老、抑菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛等功效[4-6]。

本試驗(yàn)對(duì)竹柳葉中的黃酮類(lèi)化合物的提取工藝進(jìn)行研究，并利用LCMS-IT-TOF技術(shù)其黃酮成分進(jìn)行初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹柳葉：甘肅省寶納有年金龍林業(yè)有限公司提供，曬干后粉碎過(guò)30目篩，密封保存?zhèn)溆茫惶J丁標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、硝酸鋁（均為分析純）：北京化學(xué)試劑公司；乙腈、乙酸、甲醇（均為色譜純）：天津市化學(xué)試劑供銷(xiāo)公司；超純水：由Millipore超純水機(jī)制得。

DFY-500型植物粉碎機(jī)：上海儀器儀表科技有限公司；CP214型電子天平：奧豪斯儀器有限公司；756PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；EMS-20水浴磁力攪拌器：天津歐諾儀器儀表有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；LCMS-IT-TOF：日本島津公司。

1.2 黃酮類(lèi)化合物提取工藝的研究

1.2.1 黃酮含量的測(cè)定

1.2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱(chēng)取11.25 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，75%乙醇定容，即得0.45 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0、0.25、0.50、1.00、1.25、1.50、1.75 mL于10 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液0.3mL，搖勻靜置6min，加入10%Al（NO3）3溶液0.3mL，搖勻靜置6 min，加4%NaOH溶液4 mL，加75%乙醇定容，搖勻靜置12 min，按照分光光度法，在510 nm處測(cè)吸光度A，以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 樣品黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取適量樣品粗提液于10 mL比色管中，按上述方法測(cè)吸光度，并計(jì)算黃酮得率（%，以蘆丁計(jì)）。

式中：C為粗提液的質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為粗提液體積，mL；m為樣品質(zhì)量（干基），mg。

1.2.2 提取工藝單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 提取溫度的選擇

料液比為1∶20（g/mL），乙醇濃度為75%，提取時(shí)間為 1.5 h，分別在 50、60、70、80、90 ℃的溫度下，提取1.5 h，測(cè)定黃酮得率。

1.2.2.2 料液比的選擇

提取溫度為80℃，乙醇濃度為75%，提取時(shí)間為1.5 h，料液比分別為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），測(cè)定黃酮得率。

1.2.2.3 乙醇濃度的選擇

提取溫度為 80℃，料液比為 1∶30（g/mL），提取時(shí)間為1.5 h，分別用濃度為55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，測(cè)定黃酮得率。

1.2.2.4 提取時(shí)間的選擇

提取溫度為 80℃，料液比為 1∶30（g/mL），乙醇濃度為 65%，提取時(shí)間分別為 1、1.5、2、2.5、3 h，測(cè)定黃酮得率。

1.2.3 提取工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)提取溫度、料液比、乙醇濃度和提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3 黃酮類(lèi)化合物成分分析

1.3.1 樣品制備

取竹柳葉粉末1.0 g，加40 mL 55%乙醇，回流提取2 h，濾液旋蒸，凍干，得黃酮樣品；取適量黃酮樣品溶于甲醇中，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液供LCMS分析。

1.3.2 液質(zhì)聯(lián)用分析（LCMS-IT-TOF）

1.3.2.1 液相色譜條件

色譜柱：GeminiC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：A相為0.1%乙酸水溶液，B相為乙腈，梯度洗脫（0～5 min，20%～22%B；5 min～8 min，22%～25%B；8 min～10 min，25%～27%B；10 min～20 min，27%～28%B；20 min～25 min，28%～30%B；25 min～30 min，30%B）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：3 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；波長(zhǎng)：330 nm。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；掃描模式：正離子掃描；m/z掃描范圍：50～1 000；電噴霧電壓：4.5 kV；霧化氣流速：1.5 L/min；干燥氣（N2）壓力：0.1 MPa；CDL 溫度：200℃；加熱模塊（BH）溫度：200℃；檢測(cè)器電壓：1.54 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮類(lèi)化合物提取工藝的確定

2.1.1 黃酮含量的測(cè)定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=12.86 1x-0.015 9（R2=0.999 3），式中：y為吸光度值，x為溶液的濃度，R2為相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，蘆丁在0.011 25 mg/mL～0.078 75 mg/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好。

2.1.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 提取溫度對(duì)得率的影響

提取溫度對(duì)得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取溫度對(duì)得率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on yield of flavonoids

由圖1看出，黃酮的得率隨著溫度的升高而增加，而當(dāng)溫度超過(guò)80℃時(shí)，黃酮的得率變化不大，這可能是因?yàn)闇囟鹊纳邥?huì)加快分子的運(yùn)動(dòng)，也能軟化并破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)使黃酮類(lèi)成分流出。從節(jié)能的角度考慮，選擇提取溫度為80℃為宜。

2.1.2.2 料液比對(duì)得率的影響

料液比對(duì)得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)得率的影響Fig.2 Effects of liquid-solid ration on yield of flavonoids

從圖2可以看出，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，黃酮類(lèi)化合物的得率最高，當(dāng)料液比大于1∶30（g/mL）時(shí)，總黃酮得率反而降低，之后黃酮得率變化不大。這可能是因?yàn)槿軇┝窟^(guò)多時(shí)，一些其他類(lèi)物質(zhì)也被提取出來(lái)，使黃酮得率呈下降趨勢(shì)。故選擇料液比為1∶30（g/mL）為宜。

2.1.2.3 乙醇濃度對(duì)得率的影響

乙醇濃度對(duì)得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)得率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on yield of flavonoids

從圖3可知，當(dāng)乙醇濃度為65%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，可能是因?yàn)闈舛葹?5%的乙醇溶液的極性與黃酮類(lèi)化合物的極性相近，更易提取出黃酮類(lèi)物質(zhì)，之后乙醇濃度增加，得率反而降低，這可能是因?yàn)橐掖紳舛雀邥r(shí)，一些醇溶性的雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分也溶出，導(dǎo)致黃酮的得率下降。故選乙醇濃度為65%。

2.1.2.4 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

提取時(shí)間對(duì)得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on yield of flavonoids

從圖4可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮得率先增加，之后趨于平穩(wěn)，這是因?yàn)樘崛r(shí)間越長(zhǎng)，溶劑越能夠充分滲透到細(xì)胞內(nèi)與活性物質(zhì)接觸溶解，使黃酮溶出，得率增加。故選提取時(shí)間為1.5 h為宜。

2.1.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)直觀分析見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)直觀分析Table 2 Intuitive analysis of orthogonal experiment

續(xù)表2 正交試驗(yàn)直觀分析Continue table 2 Intuitive analysis of orthogonal experiment

表2和表3結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)黃酮得率的影響順序從大到小依次為C>B>A>D，最佳提取工藝組合為A2B3C1D3，但這個(gè)提取工藝不包括在正交試驗(yàn)分析表中，需做驗(yàn)證試驗(yàn)。經(jīng)驗(yàn)證，在此工藝條件下，得到黃酮得率為4.0%。因此，最佳工藝為A2B3C1D3，即提取溫度為80℃，料液比為1∶40（g/mL）、乙醇濃度為 55%、提取時(shí)間為2 h。料液比和乙醇濃度這兩個(gè)因素對(duì)黃酮得率影響顯著。

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.2 黃酮成分分析

黃酮樣品的液相色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 竹柳葉中黃酮類(lèi)化合物的液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of flavonoids in bamboo willow leaves

由圖5可知，在此液相條件下，樣品中的黃酮成分得到較好分離。根據(jù)一、二級(jí)質(zhì)譜圖對(duì)液相色譜圖的色譜峰進(jìn)行分析，推斷出6個(gè)黃酮類(lèi)化合物。

2.2.1 化合物I的結(jié)構(gòu)分析

化合物I的一、二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 化合物I的一、二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 MS/MS2spectrum of compound I

由圖6可知，正離子掃描的m/z為595.164 5，為[M+H]+峰，表明該化合物的相對(duì)分子量為594。m/z 595.164 5離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，產(chǎn)生的主要碎片離子為：m/z577.154 1和m/z457.113 3，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、裂解途徑及相關(guān)文獻(xiàn)[7]，推測(cè)該化合物為異牡荊素-7-O-葡萄糖苷。

2.2.2 化合物II的結(jié)構(gòu)分析

化合物II的一、二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7。

圖7 化合物II的一、二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.7 MS/MS2spectrum of compound II

由圖7看出，正離子掃描的m/z為611.160 8，是[M+H]+峰，表明該化合物的相對(duì)分子量為610。對(duì)m/z 611.160 8離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到的主要碎片離子是m/z303.049 8和m/z465.105 1，m/z 465.105 1為母離子m/z611.1608失去一個(gè)質(zhì)量數(shù)146（鼠李糖）得中性碎片后生成的離子[M+H-146]+，在此基礎(chǔ)上又失去一個(gè)質(zhì)量數(shù)162（葡萄糖）的中性碎片后生成m/z 303.049 8[M+H-146-162]+，此碎片離子可能是化合物II的組成苷元槲皮素，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、裂解途徑及相關(guān)文獻(xiàn)[8]，推測(cè)該化合物為蘆丁。

2.2.3 化合物III的結(jié)構(gòu)分析

化合物III的一、二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖8。

圖8 化合物III的一、二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.8 MS/MS2spectrum of compound III

由圖8可知，正離子掃描的m/z為449.108 2，是[M+H]+峰，表明該化合物的相對(duì)分子量為448。二級(jí)碎片離子為m/z287.055 1，表明該化合物的組成苷元可能為木犀草素，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、裂解途徑及相關(guān)文獻(xiàn)[7，9]，推測(cè)該化合物為木犀草素-7-O-葡萄糖苷。

2.2.4 化合物IV的結(jié)構(gòu)分析

化合物IV的一、二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖9。

圖9 化合物IV的一、二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.9 MS/MS2spectrum of compound IV

圖9表明，正離子掃描的m/z為625.175 8，是[M+H]+峰，表明該化合物的相對(duì)分子量為624，在其二級(jí)質(zhì)譜圖中可以看到m/z317.068 3的碎片離子，說(shuō)明該化合物的組成苷元是異鼠李素，此碎片離子是通過(guò)母離子m/z625.175 8失去一個(gè)質(zhì)量數(shù)308（葡萄糖+鼠李糖）的中性碎片形成的，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、裂解途徑及相關(guān)文獻(xiàn)[10]，推測(cè)該化合物為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷。

2.2.5 化合物V的結(jié)構(gòu)分析

化合物V的一、二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖10。

圖10 化合物V的一、二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.10 MS/MS2spectrum of compound V

由圖10可知，正離子掃描的m/z為447.092 6，是[M+H]+峰，表明該化合物的相對(duì)分子量為448，二級(jí)碎片離子為m/z271.060 2，表明該化合物的組成苷元為芹黃素，m/z 271.060 2碎片離子是母離子m/z447.092 6失去一個(gè)質(zhì)量數(shù)176（葡萄糖醛酸）的中性碎片后生成的離子[M+H-176]+，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、裂解途徑及相關(guān)文獻(xiàn)，推測(cè)該化合物為芹黃素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

2.2.6 化合物VI的結(jié)構(gòu)分析

化合物VI的一、二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖11。

圖11 化合物VI的一、二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.11 MS/MS2spectrum of compound VI

由圖11可知，正離子掃描的m/z為477.102 2，是[M+H]+峰，表明該化合物的相對(duì)分子量為478，二級(jí)碎片離子m/z301.069 8為該化合物的苷元組成，推測(cè)該苷元為金圣草素，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、裂解途徑及相關(guān)文獻(xiàn)，推測(cè)該化合物為金圣草素-葡萄糖醛酸苷。

3 結(jié)論

選用竹柳葉為原料，采用乙醇回流提取法對(duì)黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究，用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，得出最優(yōu)提取工藝為提取溫度80℃、料液比1∶40（g/mL）、乙醇濃度55%、提取時(shí)間2 h。利用LCMS-IT-TOF技術(shù)分析了其中的6種黃酮類(lèi)成分，為竹柳葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)的研究提供了理論依據(jù)。

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Research of Extraction Process and Analysis of Flavonoids from Bamboo Willow Leaves

HAN Ying，Lü Xiao-ling

（Institute of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The ethanol refluxing extraction process of flavonoids from bamboo willow leaves was studied to determine the optimal extraction conditions.The flavonoids were also analyzed.Based on the single-factor tests，the ethanol refluxing extraction conditions of flavonoids were optimized by orthogonal experiment concluding extraction temperature，liquid-solid ration，ethanolconcentr-ation and extraction time in order to increase the yield of flavonoids.The liquid chromatography-mass spectrometry-ion trap-time-of-flight（LCMS-IT-TOF）method was applied to analyze flavonoids from bamboo willow leaves.The reswlts showed that：The optimal extraction conditions of flavonoids were extraction temperature of 80 ℃，material-liquid ratio of 1 ∶40（g/mL），ethanol concentration of 55%and extraction time of 2 h.Under the optimal conditions，the maximum yield of flavonoids was 4.0%.Six flavonoids including isovitexin-7-O-glucoside，rutin，luteolin-7-O-glucoside，isorhamnetin-3-O-rutinoside，apigenin-7-O-glucuronide and chrysoeriol-glucuronide were speculated.

bamboo willow leaves；flavonoids；extraction；analysis

2016-11-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.012

韓穎（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品添加劑與功能配料。