米志寬，符兆英，王愛(ài)紅 ，王 磊，李 飛，鄭 軍，雷 星，任清泉

1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(延安 716000)， 2. 延安大學(xué)附屬醫(yī)院(延安 716000)

乳漿大戟抑制原代人胃癌多藥耐藥細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡研究*

米志寬1，符兆英1，王愛(ài)紅1△，王 磊2，李 飛2，鄭 軍2，雷 星2，任清泉2

1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(延安 716000)， 2. 延安大學(xué)附屬醫(yī)院(延安 716000)

目的：研究乳漿大戟抑制原代培養(yǎng)多藥耐藥人胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。方法：制備人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細(xì)胞，用不同稀釋度的乳漿大戟提取液處理人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞的核形態(tài)改變并測(cè)定凋亡指數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；以不加乳漿大戟提取液的細(xì)胞作對(duì)照。結(jié)果：乳漿大戟對(duì)人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細(xì)胞有增殖抑制作用，該作用有時(shí)間和濃度依賴性。乳漿大戟處理后的人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞核固縮、染色不均勻和核碎片等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，凋亡形態(tài)顯示的凋亡指數(shù)和流式細(xì)胞術(shù)顯示的凋亡率均明顯上升，均有時(shí)間和濃度依賴性；以上作用與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：乳漿大戟提取液具有抑制人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

胃癌(Gastric cancer)是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，分別居我國(guó)農(nóng)村和城市惡性腫瘤發(fā)病率的第一位和第二位[1-3]。早期胃癌以手術(shù)治療為主，中晚期則以化療為主要治療手段。但由于腫瘤細(xì)胞往往對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性(Multidrug resistance, MDR)，而使得療效不佳[4-6]。本文研究了乳漿大戟(Euphorbia esula Linn)抑制人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的作用，旨在尋找一種對(duì)抗或逆轉(zhuǎn)人胃癌多藥耐藥的中藥材。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰酶購(gòu)自Gibco公司，噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和碘化丙啶(PI)購(gòu)自Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)板為丹麥Cyclone公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼公司產(chǎn)品，熒光顯微鏡和倒置顯微鏡均為日本OLYMPUS產(chǎn)品。酶標(biāo)檢測(cè)儀為美國(guó)Bio-Rad產(chǎn)品。

2 人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細(xì)胞制備 取手術(shù)切除的多藥耐藥人胃癌組織新鮮標(biāo)本，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整單細(xì)胞懸液至活細(xì)胞濃度為5×108/L，用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，加100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，在37℃、5% CO2和飽和濕度的無(wú)菌條件下常規(guī)培養(yǎng)，加入終濃度為0.5μg/ml 的阿霉素以選擇并維持耐藥細(xì)胞；每2～3天更換新鮮培養(yǎng)液1次；細(xì)胞生長(zhǎng)接近鋪滿瓶底時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 將乳漿大戟原液用含10% FBS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成不同稀釋度：20、40、 80 、 160 、 320、 640 μg/ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，用含10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)液制成濃度為1×104/ml的單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.1 ml，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好，棄去舊培養(yǎng)液，將不同濃度的乳漿大戟稀釋液按每孔0.2 ml加入培養(yǎng)孔，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照(不加乳漿大戟的細(xì)胞孔，每孔加0.2 ml 10% FBS RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液)，在37℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。

培養(yǎng)24 h和48 h后的細(xì)胞，分別加入5% MTT溶液20μl/孔，終濃度5mg/ml，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去各細(xì)胞孔的上清液，每孔加入100 μl DMSO，緩慢振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)處讀取A值。以只含10% FBS 的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液的孔調(diào)零，取6個(gè)復(fù)孔的算術(shù)平均值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：抑制率%=(正常細(xì)胞對(duì)照孔的平均A值-乳漿大戟處理孔的平均A值)/正常細(xì)胞對(duì)照孔的平均A值×100%。

4 吖啶橙染色測(cè)定凋亡指數(shù) 將人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞在10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中37℃、5% CO2和飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 ml，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，加入用10% FBS RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的乳漿大戟稀釋液：40、80、160 μg/ml，每孔4 ml，并設(shè)立不含乳漿大戟的對(duì)照組。37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)24、48 h和72 h后分別收獲細(xì)胞。將細(xì)胞以1%福爾馬林固定，用吖啶橙染色，熒光顯微鏡高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞核濃染、固縮和染色體邊緣化者為凋亡細(xì)胞。隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，記錄其中的凋亡細(xì)胞數(shù)。按以下公式計(jì)算凋亡指數(shù)：凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌多藥耐藥細(xì)胞原代培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，用含10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)液配成1×104/ml濃度，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 ml，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，加入用10% FBS RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的乳漿大戟稀釋液：40、 80、 160 μg/ml，每孔4 ml，并設(shè)立不含乳漿大戟的對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每個(gè)濃度和未加乳漿大戟的對(duì)照分別收集106個(gè)細(xì)胞，1000 r/min離心7 min，棄上清，用PBS洗2遍。加入500 μl 4℃預(yù)冷的70%乙醇在4℃固定1 h，1000 r/min離心7 min，棄上清，用PBS洗2遍，3 ml PBS重懸細(xì)胞。每管加入PI溶液1 ml，充分混勻，避光室溫靜置30 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，取3次的平均值計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

結(jié) 果

1 MTT實(shí)驗(yàn)顯示的乳漿大戟對(duì)多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的增殖抑制作用 不同濃度的乳漿大戟稀釋液處理人胃癌多藥耐藥細(xì)胞原代培養(yǎng)后，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，乳漿大戟稀釋液明顯地抑制了多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的增殖活性，而且隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 乳漿大戟對(duì)多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞增殖活力抑制作用的MTT檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與前一濃度比較，△P<0.05；與24 h抑制率比較，▲P<0.05

2 凋亡形態(tài)顯示的乳漿大戟誘導(dǎo)多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞凋亡指數(shù)升高的情況 乳漿大戟稀釋液處理后的人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)吖啶橙染色，熒光顯微鏡下觀察凋亡形態(tài)，可見(jiàn)細(xì)胞核固縮、染色不均勻、邊緣化和核碎片、以及熒光增強(qiáng)等細(xì)胞凋亡變化的形態(tài)學(xué)改變，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和計(jì)算凋亡指數(shù)的結(jié)果顯示，乳漿大戟誘導(dǎo)多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡指數(shù)隨藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)明顯的升高趨勢(shì)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 乳漿大戟處理多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞后的凋亡指數(shù)±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，△P<0.01

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示的乳漿大戟誘導(dǎo)多藥耐藥人胃癌細(xì)胞凋亡率上升的情況 人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)梯度濃度的乳漿大戟稀釋液處理24 h、48 h和72 h后，作流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況，可見(jiàn)各藥物濃度組誘導(dǎo)人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡率與未加藥對(duì)照組之間差異顯著，細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度的增加和藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 乳漿大戟處理多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)的凋亡率±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，△P<0.01

討 論

腫瘤的發(fā)生是由細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡失去平衡所導(dǎo)致；抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是抗腫瘤治療的的一個(gè)重要研究領(lǐng)域和很有希望的研究領(lǐng)域。用中藥抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是多年來(lái)和近年來(lái)國(guó)內(nèi)抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一[7-8]。細(xì)胞凋亡在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用，化學(xué)藥物雖可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，但容易出現(xiàn)多藥耐藥，并且不良反應(yīng)較重。

腫瘤多藥耐藥指腫瘤細(xì)胞一旦對(duì)一種化療藥產(chǎn)生耐藥，就會(huì)對(duì)多種化療藥產(chǎn)生交叉耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤耐藥有多種機(jī)制，包括細(xì)胞膜P-糖蛋白過(guò)度表達(dá)使藥物外排增加、藥物在細(xì)胞內(nèi)的滅活降解增加、抑制細(xì)胞凋亡、減弱化療藥物的毒性、降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性等[9-13]。腫瘤多藥耐藥研究在多年來(lái)一直被重視，逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥目前仍然是國(guó)內(nèi)外抗腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)。中藥毒副作用小，易被患者接受，在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥上具有一些優(yōu)勢(shì)[14-15]。比西藥在治療多藥耐藥胃癌方面更具有潛在的前景。

乳漿大戟(英文名稱Leafy Spurge)在多種植物類書籍和中藥材書籍中均有記載[16-17]，是大戟科大戟屬的一種植物。根據(jù)中國(guó)植物志[16]，乳漿大戟又稱貓眼草、乳漿草和華北大戟等。乳漿大戟是一種多年生草本植物，根圓柱狀，20 cm以上長(zhǎng)，直徑約4mm，褐色或黑褐色。莖單生或叢生，30～60 cm高，主干直徑約4mm。葉長(zhǎng)2～7 cm，寬4～7mm，線形，先端尖，基部楔形，無(wú)葉柄。雄花多枚，苞片寬線形；雌花1枚，子房柄明顯伸出總苞之外。蒴果三棱狀球形，直徑5～6mm。種子卵球狀，長(zhǎng)約3mm，直徑約2mm，成熟時(shí)黃褐色。乳漿大戟分布于全國(guó)大部分地區(qū)，在陜北地區(qū)比較多見(jiàn)。乳漿大戟地上全草可作為藥用，味苦辛、性微寒、有毒，歸胃、肝、脾、肺經(jīng)，有散結(jié)、拔毒、逐水、消腫、祛痰、鎮(zhèn)咳之功效具拔毒止癢之效[17]。

已發(fā)現(xiàn)乳漿大戟提取物具有抑制體外培養(yǎng)的惡性腫瘤傳代細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[3,18-20]。本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了乳漿大戟對(duì)多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞增殖和凋亡的作用：用MTT實(shí)驗(yàn)研究了乳漿大戟對(duì)人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的增殖抑制或細(xì)胞毒作用、用吖啶橙染色熒光顯微鏡凋亡細(xì)胞核形態(tài)觀察研究了乳漿大戟對(duì)人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響，用流式細(xì)胞術(shù)研究了乳漿大戟誘導(dǎo)人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的凋亡率。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳漿大戟具有明顯的抑制多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，該研究為利用乳漿大戟逆轉(zhuǎn)人胃癌多藥耐藥或進(jìn)行胃癌輔助治療打下了一定的基礎(chǔ)。

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(收稿：2016-10-18)

Euphorbia esula inhibition of primary culture multi-resistant gastric cancer cell proliferation and induce the apoptosis of research

Mi Zhikuan, Fu Zhaoying, Wang Aihong, et al.

Yan’an University Medical College(Yan’an 716000)

Objective: To study the Euphorbia esula by inhibiting the generation of cultivating multi-resistant gastric cancer cell proliferation and induce cell apoptosis. Methods: For the preparation of human gastric cancer multi-resistant primary cells, diluted with different degrees of Euphorbia esula extract processing people primitive culture cell, stomach multi-resistant determined by MTT experiment to observe the cell growth inhibition phenomenon, acridine orange staining fluorescence microscope determination of observing the nuclear morphological changes of apoptotic cells and apoptotic index, rate of flow cytometry to detect cell apoptosis. Results: Euphorbia esula on gastric cancer multi-resistant primitive culture cell proliferation inhibition, which had the time and the concentration dependence. Euphorbia esula multi-drug resistance of cancer of the stomach after processing the original generation of cultured cells, apoptosis index and apoptosis rate of rise, had the time and the concentration dependence. The above changes were statistically significant (P<0.05,P<0.01). Conclusions: Euphorbia esula extract could inhibit people primitive cultivating multi-resistant gastric cancer cell proliferation and induce cell apoptosis.

Stomach neoplasms/pathology @Euphorbia esula Drug tolerance Apoptosis Drug resistance,multiple Cell prliferation Primary cell cultare

*陜西省延安市科技項(xiàng)目(2014HM-05)

胃腫瘤/病理學(xué) @乳漿大戟 藥物耐受性 細(xì)胞凋亡 抗藥性，多藥 細(xì)胞增殖 原代細(xì)胞培養(yǎng)

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.006

△通訊作者