王 仲，賴鐘雄，金琦芳，郭玉瓊，常笑君

（1.賀州學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542899；2.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002）

茶樹錳超氧化物歧化酶基因CsMSD克隆及其表達(dá)分析

王 仲1，賴鐘雄2，金琦芳1，郭玉瓊2，常笑君2

（1.賀州學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542899；2.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002）

為了解茶樹CsMSD在干旱脅迫下的表達(dá)規(guī)律，采用RT-PCR和RACE技術(shù)，對(duì)茶樹干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)重要基因錳超氧化物歧化酶基因CsMSD進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)其在不同程度干旱脅迫下的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，茶樹CsMSD核苷酸序列全長(zhǎng)1013bp，開放閱讀框長(zhǎng)693bp，共編碼230個(gè)氨基酸；CsMSD蛋白分子量為25.47kD，理論等電點(diǎn)pI=6.38，存在9個(gè)磷酸化位點(diǎn)，亞細(xì)胞定位于線粒體中，且蛋白質(zhì)序列中具有MSD特征結(jié)構(gòu)域；qPCR分析干旱脅迫下茶樹葉片中CsMSD的表達(dá)變化情況發(fā)現(xiàn)，CsMSD在干旱脅迫下的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著上調(diào)。研究認(rèn)為鐵觀音茶樹CsMSD在應(yīng)對(duì)干旱脅迫中發(fā)揮著重要的作用。

鐵觀音茶樹；CsMSD；基因克?。桓珊得{迫；qPCR

植物體內(nèi)超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是一類與清除活性氧有關(guān)的金屬酶，對(duì)保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷具有十分重要的作用，是植物防御系統(tǒng)中第一個(gè)清除活性氧的關(guān)鍵酶［1］。1969年，McCord等［2］首次發(fā)現(xiàn)了SOD在生物體內(nèi)能夠歧化超氧陰離子。植物中SOD依據(jù)活性中心金屬輔因子不同主要有三類：CuZnSOD、FeSOD和MnSOD［3］。不同類型SOD在植物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位不同，MnSOD可能存在于線粒體和過氧化物酶體中。其中線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生超氧陰離子的主要場(chǎng)所，MnSOD可能在保護(hù)細(xì)胞免受超氧陰離子損傷中發(fā)揮重要作用［4］。

干旱是我國(guó)茶園生產(chǎn)的重要限制因素，一方面我國(guó)不同地區(qū)降水分布不均；另一方面茶園多地處丘陵或山地等，水資源不足而灌溉設(shè)施不夠完善。茶樹中抗旱生理研究［5］表明，對(duì)茶樹超氧化物歧化酶、丙二醛、可溶性糖、過氧化物酶和游離脯氨酸與茶樹抗旱指數(shù)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，其中超氧化物歧化酶與茶樹抗旱的關(guān)聯(lián)程度最大。超氧化物歧化酶活性可以作為茶樹抗旱能力強(qiáng)弱的重要指示標(biāo)志。目前，茶樹干旱脅迫下超氧化物歧化酶相關(guān)研究主要集中在酶活性的變化上［6，7］，而對(duì)其基因表達(dá)層面的研究較少。鑒于此，本研究以鐵觀音茶樹葉片為試驗(yàn)材料，通過同源克隆獲得茶樹超氧化物歧化酶基因家族重要成員CsMSD基因序列，并檢測(cè)其在干旱脅迫下的表達(dá)規(guī)律。以期為進(jìn)一步研究CsMSD基因在茶樹抵御干旱脅迫中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

以鐵觀音茶樹葉片為材料，提取總RNA用于后續(xù)試驗(yàn)。Tripure Isolation Reagent購(gòu)于 Roche，SMART RACE反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Clontech公司，SYBR ExScriptTM試劑盒、SYBR Premix Ex TapTM試劑盒、pMD18-T載體、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞為Takara公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶樹葉片總RNA提取及cDNA合成

參照趙姍姍等［8］的RNA提取和檢測(cè)方法，按照SMART RACE說明書合成第一鏈cDNA。

1.2.2 茶樹CsMSD基因克隆引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的鐵觀音茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)基因保守區(qū)或者ORF上下游引物，采用RT-PCR擴(kuò)增獲得其保守序列。獲得CsMSD保守區(qū)序列后，進(jìn)一步設(shè)計(jì)3’端和5’端RACE引物，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增獲得各成員的末端序列。試驗(yàn)引物委托廈門閩博公司合成，試驗(yàn)測(cè)序委托上海博尚進(jìn)行。用于CsMSD基因克隆的所有引物序列相關(guān)信息及用途見表1。

配置25μl的PCR反應(yīng)體系，其中12.5μl的Tap Mix，1μl的 cDNA 模板，10μM/L 的上下游引物各1μl，9.5μl的H2O。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)定為：94℃預(yù)變性 3min；94℃變性 30s，退火 30s，72℃延伸，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8min；根據(jù)引物特性設(shè)定相應(yīng)的退火溫度，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度調(diào)整延伸時(shí)間。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN翻譯CsMSD最大開放閱讀框的蛋白質(zhì)，使用NCBI進(jìn)行CsMSD的氨基酸同源性分析，使用ExPASy ProtParam在線工具預(yù)測(cè)CsMSD蛋白的基本理化性質(zhì)，使用Softberry ProtComp 9.0預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位情況，使用Chlorop1.1預(yù)測(cè)其是否存在信號(hào)肽，使用Tmpred預(yù)測(cè)CsMSD蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，使用SOPMA分析CsMSD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用NetPhoS對(duì)CsMSD蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，使用COILS Server軟件對(duì)CsMSD蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用PredictProtein在線軟件對(duì)CsMSD蛋白功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析，采用Mega 6近鄰相接法（Neighbor-Joining，NJ）對(duì)來自不同植物的 MSD氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 茶樹CsMSD基因克隆相關(guān)引物信息

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析

劉玉英等［9］研究7個(gè)茶樹品種在干旱脅迫下葉片中SOD活性的變化規(guī)律，結(jié)果均呈現(xiàn)“先升高后下降”的變化趨勢(shì)。綜合其他相關(guān)研究，得出茶樹SOD活性在干旱脅迫10天左右時(shí)達(dá)到最高，因此對(duì)鐵觀音茶樹盤栽苗進(jìn)行干旱脅迫處理，脅迫10天后下午進(jìn)行取樣。干旱脅迫處理為：對(duì)照CK正常供水，土壤含水量/田間持水量為80（±5）%；T1輕度干旱脅迫，土壤含水量/田間持水量為60（±5）%；T2中度干旱脅迫，土壤含水量/田間持水量為40（±5）%；T3重度干旱脅迫，土壤含水量/田間持水量為20（±5）%。提取經(jīng)不同處理的鐵觀音茶樹葉片總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，采用相應(yīng)的引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。

參考孫美蓮等［10］篩選的內(nèi)參引物序列，選取18S作為內(nèi)參基因，檢測(cè)CsMSD基因在不同干旱脅迫程度下的相對(duì)表達(dá)量。在CsMSD基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qPCR擴(kuò)增，其中上游引物序列為 5’-GCGTGCTCCCAAACATCT AAG-3’，下游引物序列為 5’-TTACAAGGCTCTGG ATGGGTG-3’，擴(kuò)增溫度為 62℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹錳超氧化物歧化酶基因CsMSD克隆

采用各對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到保守區(qū)序列500bp以上（圖1）。進(jìn)一步在保守區(qū)上設(shè)計(jì)引物進(jìn)行5’端RACE、3’端RACE擴(kuò)增，將相應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收、連接和轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆子進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTn比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示與數(shù)據(jù)庫(kù)中的可可、開心果、油茶等植物的MSD基因序列相似性較高。表明獲得的基因序列為鐵觀音茶樹錳超氧化物歧化酶的基因序列，將其命名為CsMSD（GenBank登錄號(hào)KP189419）。分析該基因序列及其編碼的氨基酸序列（圖2），表明其核苷酸序列全長(zhǎng)1013bp，開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)693bp，共編碼230個(gè)氨基酸。

圖1 茶樹CsMSD基因保守區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 茶樹CsMSD基因序列及其編碼的氨基酸序列

2.2 茶樹CsMSD基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

茶樹CsMSD蛋白基本理化性質(zhì)分析顯示，茶樹CsMSD蛋白的原子組成為C1159H1787N301O336S5，分子量為25.47kD，理論等電點(diǎn)pI=6.38，帶負(fù)電的氨基酸（Asp+Glu）23個(gè)，帶正電的氨基酸（Arg+Lys）21個(gè)，總平均親水性為-0.269，且性質(zhì)較穩(wěn)定，說明該蛋白為穩(wěn)定的親水酸性蛋白。分析CsMSD蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域（圖3），結(jié)果表明蛋白質(zhì)序列中具有保守的Sod_Fe_N和Sod_Fe_C特征結(jié)構(gòu)域。結(jié)合CsMSD氨基酸序列中具有MnSOD特有的5個(gè)氨基酸殘基（圖2），說明該蛋白為茶樹MnSOD蛋白。

圖3 茶樹CsMSD蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域

茶樹CsMSD蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CsMSD最可能定位于線粒體中。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示蛋白質(zhì)信號(hào)肽剪切位置分值均較低，表明茶樹CsMSD不存在信號(hào)肽。蛋白質(zhì)在合成后往往需要進(jìn)行跨區(qū)域運(yùn)輸再行使其功能，在跨膜運(yùn)輸過程中需要蛋白質(zhì)中含有特定的跨膜結(jié)構(gòu)。對(duì)CsMSD進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖4），結(jié)果顯示CsMSD蛋白序列含有一個(gè)從內(nèi)到外的22個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的跨膜結(jié)構(gòu)，位于CsMSD第6-27位氨基酸，分值為739。據(jù)此推測(cè)CsMSD跨膜結(jié)構(gòu)更傾向于N-端在內(nèi)的從內(nèi)到外的跨膜方式。

蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)往往也是蛋白質(zhì)的功能區(qū)域。對(duì)CsMSD進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示CsMSD存在9個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中4個(gè)酪氨酸、3個(gè)蘇氨酸和2個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖5）。

對(duì)CsMSD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由37.0%α-螺旋、20.4%延伸鏈、9.6%β-轉(zhuǎn)角和33.0%無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)構(gòu)成。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明其具有較高程度的α-螺旋，和較低程度的β-轉(zhuǎn)角，這可能與其蛋白質(zhì)的功能有關(guān)。預(yù)測(cè)CsMSD蛋白質(zhì)的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（圖6）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Windows值為14和21時(shí)，CsMSD均可能在蛋白質(zhì)序列中形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；而當(dāng)Windows值為28時(shí)，則不存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。并進(jìn)一步預(yù)測(cè)了CsMSD蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型（圖7）。

圖4 茶樹CsMSD蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 茶樹CsMSD蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

圖6 茶樹CsMSD卷曲螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖7 茶樹CsMSD三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 茶樹CsMSD蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過MSD蛋白質(zhì)序列多重比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)茶樹CsMSD與油茶、煙草、可可等植物的MSD氨基酸序列同源性較高。進(jìn)一步選取具有代表性的植物中已知MSD氨基酸序列，使用鄰近歸并法構(gòu)建MSD系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8），結(jié)果顯示茶樹MSD氨基酸序列與油茶的MSD親緣關(guān)系和進(jìn)化距離較近，可能在進(jìn)化的過程中面臨著相近的進(jìn)化壓力。

2.4 茶樹CsMSD在不同程度干旱脅迫下的表達(dá)情況

圖8 MSD系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同程度干旱脅迫情況下鐵觀音茶樹嫩葉中CsMSD基因的相對(duì)表達(dá)情況（圖9），結(jié)果顯示鐵觀音茶樹中CsMSD基因在輕度和中度干旱脅迫下表達(dá)量均輕微上調(diào)，相對(duì)表達(dá)量均為對(duì)照組的2倍左右；在重度干旱脅迫下，表達(dá)量上調(diào)幅度較大，達(dá)到對(duì)照的6.3倍。在輕度和中度干旱脅迫下CsMSD的表達(dá)差異不大，兩者之間的相對(duì)表達(dá)量未達(dá)到顯著差異水平，但與對(duì)照相比均達(dá)到顯著差異水平；在重度干旱脅迫下，茶樹CsMSD基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，與對(duì)照和其他處理間的表達(dá)水平差異均達(dá)到顯著差異水平。推測(cè)在重度干旱脅迫下茶樹CsMSD對(duì)清除葉片細(xì)胞中的活性氧發(fā)揮著重要作用。茶樹CsMSD基因可能在干旱脅迫下通過上調(diào)表達(dá)來提高超氧化物歧化酶活性，實(shí)現(xiàn)調(diào)控體內(nèi)活性氧平衡，參與鐵觀音茶樹應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

圖9 鐵觀音茶樹CsMSD基因在不同程度干旱脅迫下的表達(dá)情況

3 討論與結(jié)論

SOD活性與植物的耐氧化性、耐旱性之間呈正相關(guān)，且耐旱性隨著耐氧化性增強(qiáng)而增強(qiáng)［11］。而SOD活性受到相應(yīng)SOD基因的表達(dá)調(diào)控。植物轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)［12，13］發(fā)現(xiàn)，過表達(dá) SOD 基因能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的SOD活性。MnSOD轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)［14-17］結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的MnSOD活性和總SOD活性均會(huì)發(fā)生顯著提高；MnSOD轉(zhuǎn)基因高表達(dá)植株的抗氧化能力會(huì)明顯高于對(duì)照。檉柳、水稻等作物的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)更直接表明，MnSOD基因具有提高轉(zhuǎn)基因作物抗干旱能力的作用［18，19］。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定發(fā)現(xiàn)鐵觀音茶樹葉片中CsMSD的相對(duì)表達(dá)量在干旱脅迫下顯著上調(diào)，這與白車軸草中MnSOD基因轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)研究結(jié)果一致［20］。推測(cè)在干旱脅迫中鐵觀音茶樹通過調(diào)控MnSOD上調(diào)表達(dá)來提高自身MnSOD的活性，進(jìn)一步增強(qiáng)自身的抗氧化能力，從而增強(qiáng)自身的耐旱性，達(dá)到應(yīng)對(duì)干旱脅迫的目的。

小麥中MnSOD基因研究［21］結(jié)果表明，MnSOD與作物對(duì)多種非生物脅迫的抗性有關(guān)。MnSOD基因在應(yīng)對(duì)NaCl、Na2CO3、NaHCO3和紫外線等其他類型的脅迫中發(fā)揮重要作用［22］。銀杏中MnSOD基因表達(dá)調(diào)控研究［23］結(jié)果表明，其表達(dá)調(diào)控還受到ABA、IAA、蔗糖和低溫等的誘導(dǎo)。仙客來轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)［15］發(fā)現(xiàn)，MnSOD能夠提高植株對(duì)高溫脅迫的耐受性。擬南芥MnSOD轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，MnSOD基因除了能提高植株各種非生物脅迫下總SOD活性，還能提高抗氧化酶CAT和POD的活性［24］。據(jù)此推測(cè)茶樹MnSOD不僅能在應(yīng)對(duì)干旱脅迫中發(fā)揮重要作用，而且在茶樹應(yīng)對(duì)其他種類非生物脅迫中也能發(fā)揮積極作用。

亞細(xì)胞定位分析顯示茶樹MnSOD蛋白最有可能定位于線粒體中，與銀杏、茄子等［23，24］植物中的結(jié)果一致。推測(cè)茶樹中MnSOD主要負(fù)責(zé)維持線粒體內(nèi)的活性氧平衡。而植物體內(nèi)的活性氧還參與植物器官生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，其中SOD能夠通過影響植物體內(nèi)H2O2的含量進(jìn)而調(diào)控木質(zhì)化次生壁形成和纖維分化等生理過程［25］。水稻中相關(guān)試驗(yàn)［26］結(jié)果還表明，在水稻葉片的不同發(fā)育階段SOD基因的表達(dá)水平有所不同。推測(cè)茶樹中MnSOD基因在植株相應(yīng)的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

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Cloning and Expression Analysis of Manganese Superoxide Dismutase Gene inCamellia Sinensis

WANG Zhong1，LAI Zhong-xiong2，IN Qi-fan1，GUO Yu-qiong2，JCHANG Xiao-jun2
（1.School of Food and Bioengineering，Hezhou University，Hezhou Guangxi 542899；2.Institute of Horticultural Biotechnology，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou Fujian 350002）

The Manganese Superoxide Dismutase Gene，which plays important roles in response to drought stress，was cloned from Camellia sinensis cv.Tieguanyin.The gene sequence（GenBank accession number，KP189419）was found to be 1013bp，containing a 693bp open reading frame which encodes 230 amino acids.The deduced protein molecular weight was 25.47 kD and its theoretical isoelectric point was 6.38.The bioinformatics revealed that the protein did have 9 phosphorylation sites，and that its subcellular cells located in mitochondria.The protein sequences had conserved functional domains related to manganese superoxide dismutase.QPCR analysis indicated that the expression level of CsMSD，when the tea trees was under varied drought stresses，was significantly higher than the control group，which suggested that CsMSD might play important roles during the processes of tea plant responding to the drought stresses.

Camellia sinensis cv.Tieguanyin；CsMSD；gene cloning；drought stress；qPCR

S571.1

A

1673—8861（2017）02—0149—08

［責(zé)任編輯］劉麗英

2017-04-06

王仲（1991-），男，湖南衡陽人，碩士。主要研究方向：茶類資源挖掘與創(chuàng)新利用。

郭玉瓊（1974-），女，福建永春人，福建農(nóng)林大學(xué)副教授，博士。主要研究方向：茶樹生物技術(shù)與茶葉生物化學(xué)。

福建省2015年重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目（2015NZ0002-1）。