殷全玉, 張玉蘭, 許希希, 陸霜, 李夢匣, 郭鳳清, 劉國順

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院, 河南 鄭州, 450002)

一株煙堿降解菌的篩選、保存及其降解性能

殷全玉, 張玉蘭, 許希希, 陸霜, 李夢匣, 郭鳳清, 劉國順

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院, 河南 鄭州, 450002)

為了探究不同培養(yǎng)基保存方式、不同培養(yǎng)液條件下煙堿降解菌的降解性能, 以煙堿為唯一碳源和氮源,從河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌校區(qū)現(xiàn)代煙草農(nóng)業(yè)科教園區(qū)植煙土壤、腐爛煙葉中分離得到25株煙堿降解菌(耐受煙堿濃度為6 g/L), 并選擇降解效率較高的幾株作為繼續(xù)研究對象。研究表明: 用煙堿作為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基(煙堿濃度2～3 g/L)斜面保存的菌株降煙堿活性較高; 篩選得到一株煙堿高效降解菌5A-6-2, 在其它碳、氮源同時(shí)存在時(shí), 仍然具有較強(qiáng)的煙堿降解能力; 將5A-6-2接種至固體煙葉碎片中, 28 ℃發(fā)酵7 d后, 煙葉中煙堿含量下降了44.2%; 通過16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn), 其與惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)同源性為99%。

煙堿降解菌; 篩選; 保存; 降解特性

煙堿(Nicotine)又稱尼古丁, 占煙草生物堿的95%以上, 是影響煙草品質(zhì)的重要因素之一[1]。我國部分烤煙煙葉煙堿含量較高, 尤其是上部煙葉, 白肋煙的煙堿含量甚至高達(dá)6.0%, 高煙堿煙葉可用性較差[2]。中國卷煙產(chǎn)量世界第一, 每年產(chǎn)生的煙草廢棄物約100萬t。這些廢棄物如果不加處理就直接投放到環(huán)境中, 會造成土壤和地下水的嚴(yán)重污染, 破壞生態(tài)安全, 危害人類的健康[3]。如果將這些廢物合理利用, 將會是一筆巨大的財(cái)富, 同時(shí)能夠減輕環(huán)境的壓力。大量研究表明, 利用微生物降解煙堿, 在提高煙葉品質(zhì)、降低煙草危害、保護(hù)環(huán)境和提高煙草資源利用率等方面具有重要意義和發(fā)展前景, 是目前煙草研究的一個(gè)熱點(diǎn)[4–5]。國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的可降解煙堿的細(xì)菌主要有節(jié)桿菌屬(Arthrobacternicotinoborans)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.No.4)、纖維單胞菌屬(Cellulomonassp)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrumintermedium)等多個(gè)屬不同種的細(xì)菌菌株[6–8]。龍章德等[9]從廣西都安縣地區(qū)的土壤中分離得到一株能高效降解煙堿的菌株D9, 其煙堿降解率為82%, 耐受煙堿的最高濃度為8 g/L。任平等[10]從植煙土壤和煙葉上分離得到一株強(qiáng)降解煙堿的菌株Y523, 其煙堿降解率為63.8%。

本研究從多年植煙土壤、腐爛煙葉中分離得到能夠降解煙堿的菌株, 并對菌株降解煙堿的能力進(jìn)行測試, 對菌株進(jìn)行初步鑒定, 為進(jìn)一步研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 菌種與試劑

采集河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院許昌試驗(yàn)園區(qū)多年植煙區(qū)土壤樣品3份, 煙葉堆肥3份, 從中篩選煙堿降解菌。

主要試劑包括胰蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、煙堿(≥99%)、瓊脂、HCl(36%～38%)、NaCl(分析純, 下同)、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2、CuCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、NaOH。

1.2 主要儀器和設(shè)備

LRH-150B生化培養(yǎng)箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)、HCY-CA恒溫?fù)u瓶柜(太倉市豪成實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司)、ZZSY-2150電熱鼓風(fēng)干燥箱(鄭州市生元儀器有限公司)、FA2004B電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)、LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、T6新世紀(jì)的紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)和JW-1016低速離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基[1]: 酵母膏5.0 g/L, 胰蛋白胨10.0 g/L, 氯化鈉5.0 g/L, pH7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中添加2.0%瓊脂。

LB-煙堿培養(yǎng)基[1]: 酵母膏5.0 g/L, 胰蛋白胨10.0 g/L, 氯化鈉5.0 g/L, 99%煙堿2 g/L, pH7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后, 煙堿用0.22 μm濾膜過濾除菌后根據(jù)需要在滅菌后加入。固體培養(yǎng)基中添加2.0%瓊脂。

煙堿降解菌選擇培養(yǎng)基(YJ培養(yǎng)基)[1]: K2HPO4·3H2O 17.4 g/L, KH2PO44.0 g/L, (NH4)2SO40.1 g/L,酵母浸粉1.0 g/L, 99%煙堿3 g/L, 微量元素溶液10.0 mL/L, PH7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后, 煙堿用0.22 μm濾膜過濾除菌后根據(jù)需要加入。

微量元素溶液: 稱取MgSO4·7H2O 1.0 g, MnSO4·H2O 0.4 g, CaCl20.15 g, CuCl2·2H2O 0.2 g,FeSO4·7H2O 0.02 g, 用0.1 mol/LHCl溶液溶解定容至100 mL。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 煙堿降解菌的初步篩選[10]

分別取土壤及堆肥樣品1.0 g, 加入9 mL 0.9%生理鹽水, 配成濁液, 充分振蕩混勻, 自然沉淀一段時(shí)間, 取上部較澄清液體, 得到10-1倍稀釋液; 取10-1倍稀釋液1.0 mL, 溶于9 mL 0.9%生理鹽水中, 得到10-2倍稀釋液; 以此類推, 配制10-3～10-5不同濃度梯度稀釋液。

取10-1～10-5稀釋菌液各50 μL, 涂布在煙堿煙堿降解菌選擇固體培養(yǎng)基(煙堿濃度2 000 mg/L)中,28 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d, 挑選出生長較多、較大的單菌落分離純化。

采用逐步提高選擇培養(yǎng)基中煙堿含量的方法進(jìn)行高濃度煙堿降解菌的篩選, 煙堿濃度分別為2、3、4、5和6 g/L, 28 ℃恒溫培養(yǎng), 并觀察分離株的生長狀況。

2.2 復(fù)篩

初步得到多種耐受高濃度煙堿(6 g/L)且以煙堿為唯一碳源的菌株, 對其降解煙堿能力進(jìn)行復(fù)篩:將菌株的菌懸液接入煙堿濃度為3 g/L的YJ培養(yǎng)基中, 于37 ℃、180 rpm搖床培養(yǎng)48 h后, 測定培養(yǎng)液中煙堿含量, 根據(jù)煙堿降解率的大小復(fù)篩菌株。

2.3 培養(yǎng)液中煙堿的定量檢測

培養(yǎng)液5000 r/min離心10 min, 上清液用0.05 mol/L鹽酸溶液稀釋到合適的吸光值范圍(0.2～0.8)。以0.05 mol/L鹽酸溶液作參比, 分別在236、259和282 nm處測樣品吸光值。用99%的純煙堿作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 具體方法為: 用0.05 mol/L鹽酸溶液配制不同濃度(0、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 g/L)煙堿溶液, 以0.05 mol/L鹽酸溶液做參比, 測定不同煙堿濃度溶液在236、259和282 nm處的吸光值。以此標(biāo)準(zhǔn)曲線來檢測培養(yǎng)液中煙堿濃度[1]。

煙堿降解率=(對照煙堿-接菌培養(yǎng)液煙堿)/對照CK煙堿×100%[11]。

2.4 不同培養(yǎng)基保存菌株對其降解性能的影響

挑選降解率較高的幾株菌, 分別用LB培養(yǎng)基、YJ2培養(yǎng)基(煙堿濃度為2 g/L的選擇培養(yǎng)基)、YJ4培養(yǎng)基(煙堿濃度為4 g/L的選擇培養(yǎng)基)斜面劃線, 28 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d, 制備菌懸液。然后將等量菌懸液接種在煙堿濃度4 g/L的選擇液體培養(yǎng)基內(nèi), 于37 ℃、180 rpm搖床中培養(yǎng)。以不接菌的空白培養(yǎng)基為對照, 檢測48 h培養(yǎng)液中煙堿的含量, 計(jì)算煙堿降解率。

2.5 菌株5A-6-2降解性能

2.5.1 不同反應(yīng)體系中菌株對煙堿的降解效果

用2 g/L的煙堿選擇培養(yǎng)基斜面保存菌種, 28 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d, 制備菌懸液, 然后將菌懸液分別接種在等量的YJ2液體培養(yǎng)基和LB2(煙堿濃度為2 mg/L的LB培養(yǎng)基)液體培養(yǎng)基中, 于37 ℃、180 rpm搖床中培養(yǎng)48 h, 以不接菌的空白培養(yǎng)基為對照, 檢測培養(yǎng)液中煙堿的含量, 計(jì)算煙堿降解率。

2.5.2 不同培養(yǎng)基保存菌株降解效果對比

分別用YJ2和LB斜面保存菌種5A-6-2, 28 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d, 制備菌懸液, 然后將菌懸液分別接種在LB2液體培養(yǎng)基中, 于37 ℃、180 rpm搖床中培養(yǎng)48 h, 以不接菌的空白培養(yǎng)基為對照, 檢測培養(yǎng)液中煙堿的含量, 計(jì)算煙堿降解率。

2.5.3 固體煙葉發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

稱取20 g調(diào)制后煙葉碎片(含水率15%～17%)放入三角瓶中, 實(shí)驗(yàn)組加入等量菌懸液(10%比例接菌), 對照組加入等量無菌水, 調(diào)節(jié)物料水分含量至45%～50%, 紗布封口, 28 ℃發(fā)酵7 d后, 取出煙葉,64 ℃烘干、粉碎, 用鹽酸提取脫色法測定粉末中煙堿含量。與對照組比較, 計(jì)算煙葉煙堿降解率。3次重復(fù), 每次5瓶。

2.6 煙堿降解菌5A-6-2 16S rDNA序列的測定[12]

將菌株于30 ℃180 rpm條件下培養(yǎng)至對數(shù)期后，采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物(正向引物序列 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’, 反向引物序列5’-CGGCTACCTTGTTACGACTTC-3’)進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系(50 μL): 模板(菌液)1 μL, 16S L(27F)2 μL, 16S R(1492R)2 μL, 2×Taq Mix酶25 μL, 重蒸水20 μL。

PCR反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 循環(huán)36次, 72 ℃延伸10 min, 10 ℃保溫。

PCR引物由鄭州久是生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，PCR產(chǎn)物的純化和測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。利用BlaLst將測序結(jié)果在NCBI基因庫中進(jìn)行同源性比較和鑒定。

3 結(jié)果

3.1 煙堿紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線

用0.05 mol/L鹽酸溶液配制不同濃度(0、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 g/L)煙堿溶液, 以0.05 mol/L鹽酸溶液做參比, 測定不同濃度溶液在259 nm處的吸光度值[13–14], 煙堿紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由圖1可知, 煙堿濃度在0.005～0.030 g/L范圍內(nèi), 吸光值(Y)與煙堿濃度(X)呈正相關(guān), 回歸方程為Y = 34.457X + 0.020 4, R2= 0.999 4。

3.2 煙堿降解菌生長情況及降解率

YJ3培養(yǎng)液中加入菌懸液, 于37 ℃、180 rpm搖床中培養(yǎng)48 h后, 通過測定培養(yǎng)液中煙堿含量, 發(fā)現(xiàn)不同菌株煙堿降解能力有很大差異(表1), 從20.39%到52.17%。在10株菌中降解率超過40%的有5株，其中編號為5A-6-2的菌株降解率最高, 達(dá)到52.17%。

3.3 不同培養(yǎng)基保存對菌株降解煙堿性能的影響

以4A-1-1、4A-2、17A-1、17A-2為實(shí)驗(yàn)對象, 分別用LB培養(yǎng)基、YJ2培養(yǎng)基、YJ4培養(yǎng)基斜面劃線培養(yǎng)一段時(shí)間, 制備菌懸液接種至YJ4培養(yǎng)液中, 于37 ℃、180 rpm搖床培養(yǎng)48 h, 檢測培養(yǎng)液中煙堿的含量, 并計(jì)算煙堿降解率。結(jié)果如表2所示。

由表2可知, 煙堿為唯一碳源和氮源培養(yǎng)基保存的菌株比LB培養(yǎng)基保存的菌株降解煙堿能力強(qiáng),其中YJ2濃度保存比LB培養(yǎng)基保存平均降解率高了14.61%; YJ4濃度下保存比LB培養(yǎng)基平均降解率高11.80%。

圖1 煙堿紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 各個(gè)菌株降解3 g/L煙堿的降解率

表2 不同培養(yǎng)基保存的菌株煙堿降解率 /%

3.4 5A-6-2菌株降解煙堿性能

3.4.1 不同反應(yīng)體系中5A-6-2降解效果

將等量5A-6-2菌懸液分別接種在YJ2液體培養(yǎng)基和LB2液體培養(yǎng)基中, 于37 ℃、180 rpm搖床中培養(yǎng)48 h, 以不接菌的空白培養(yǎng)基為對照, 檢測培養(yǎng)液中煙堿的含量, 計(jì)算煙堿降解率。結(jié)果如表3所示。

由表3可知, YJ2培養(yǎng)基體系中煙堿降解率為45.25%, LB2培養(yǎng)基體系中煙堿降解率為68.65%,LB2培養(yǎng)基煙堿降解率較高, 表明在其他碳源等營養(yǎng)物質(zhì)豐富的條件下, 菌株5A-6-2能夠降解煙堿且降解效率較高。這一結(jié)果為菌株5A-6-2降解煙葉中煙堿提供理論支持。

3.4.2 利用YJ2和LB2培養(yǎng)基保存菌株降解效果對比

分別用YJ2和LB2培養(yǎng)基斜面保存菌種5A-6-2, 28 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d, 制備菌懸液, 然后將菌懸液分別接種在LB2液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 rpm搖床中培養(yǎng)48 h后, 檢測培養(yǎng)液中煙堿含量。由表4可知, YJ2保存的菌株降解率為68.6%, LB2保存的菌株降解率為24.5%, YJ2保存菌株活性較高。

3.4.3 煙葉發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在三角瓶內(nèi)研究5A-6-2菌株對煙葉中煙堿降解效果, 結(jié)果發(fā)現(xiàn),以10%比例接入5A-6-2菌液, 28 ℃發(fā)酵7 d后, 煙葉煙堿含量下降了44.18%, 而對照組煙堿含量未下降, 這表明5A-6-2菌株對于降解烤后煙葉煙堿是有效的。

表3 不同反應(yīng)時(shí)間體系中5A-6-2菌株的煙堿降解率 /%

表4 利用YJ2和LB2培養(yǎng)基保存的菌株不同時(shí)間降解效果對比 /%

3.5 煙堿降解菌16SrDNA序列的測定結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆的篩選和測序, 得到長度為1 500 bp的序列。為確定5A-6-2的分類學(xué)地位, 利用Blast在NCBI基因庫中進(jìn)行同源性檢索[15–17], 顯示5A-6-2與假單胞菌屬(Pseudomon- as putida)的多種細(xì)菌具有較高的同源性(99%), 結(jié)合生理生化特性,確定該降解菌為假單胞菌屬。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以篩選出的幾株高效降解菌為研究對象, 研究保存菌株培養(yǎng)基的差異對菌株降解效率的影響, 結(jié)果表明以煙堿為唯一碳氮源的培養(yǎng)基保存菌株效果較好, 培養(yǎng)基中煙堿的濃度對降解率也有一定影響, 不同菌株對煙堿濃度的要求不同, 需要進(jìn)一步探索研究。以5A-6-2為研究對象, 研究菌株對煙堿為唯一碳氮源的培養(yǎng)基(煙堿濃度2 g/L)和含有相同濃度煙堿的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中煙堿降解效果,結(jié)果表明, 菌株5A-6-2對牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的煙堿降解效率更高, 為菌株5A-6-2降解煙葉中煙堿提供理論支持。用菌株5A-6-2菌懸液降解調(diào)制后煙葉中煙堿, 發(fā)酵7d后, 煙葉中煙堿含量降解44.2%。

[1] 孔雯. 煙堿降解菌的分離、鑒定降解特性及其降解途徑的初步研究[D]. 武漢: 中南民族大學(xué), 2011.

[2] 鄧娜娜, 羅笛, 鐘娟, 等. 高煙堿耐受力降解菌Arthrobactersp.AH14鑒定及降解條件優(yōu)化[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2016, 18(5): 62–71

[3] 袁勇軍, 陸兆新, 別小妹, 等. DN2菌降解煙堿的動力學(xué)及其應(yīng)用研究[J]. 中國生物工程雜志, 2006, 26(3): 47–51

[4] 李俊剛, 姜立春, 馬家俊. 高效煙堿降解菌A4發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 45(5): 431–434.

[5] 夏露, 張娟, 王遠(yuǎn)亮, 等. 生物技術(shù)在煙葉發(fā)酵中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(22): 12 013–12 015.

[6] 彭瀚輝, 田云, 李童, 等. 多種煙桿降解菌株的篩選及其協(xié)同作用比例優(yōu)化[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2016, (11): 225–227.

[7] 劉永亮, 王毅, 馬永凱, 等. 微生物代謝尼古丁的研究及其應(yīng)用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2009, 28(4): 821–827.

[8] 鄒芳, 趙娟, 雷燕萍, 等. 一株煙草秸稈降解菌的分離, 鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 土壤, 2016, 48(5): 939–945.

[9] 龍章德, 韋方立, 李俊芳, 等. 一株高濃度煙堿降解菌的篩選, 分離和初步鑒定[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2013,32(5): 612–615.

[10] 任平, 徐升運(yùn), 阮祥穩(wěn), 等. 一株煙堿降解菌的篩選及改善煙葉品質(zhì)的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(7):229–233．

[11] 翟貴發(fā), 陳素卉, 李涵, 等. 煙堿降解菌CW6菌株的分離, 鑒定及其降解特性[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013, 47(5): 676–680.

[12] 王瑞, 施河麗, 陳守文. 煙堿降解菌的分離, 鑒定及其在煙草秸稈發(fā)酵中的應(yīng)用研究[C]//中國煙草學(xué)會2015年度優(yōu)秀論文匯編, 2015: 13.

[13] 徐慧, 黨立志, 楊根華, 等. 煙堿降解菌的篩選, 鑒定及其降解性能的初步研究[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013, 35(4): 580–586.

[14] 萬虎. 煙堿降解菌PseudomonasputidaZB-16A的分離篩選及降解特性研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[15] 夏露. 降解煙堿微生物的篩選, 鑒定及降解條件優(yōu)化[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[16] 張娟, 張麗麗, 扈麟, 等. 煙堿降解菌的篩選與初步鑒定[J]. 中國煙草學(xué)報(bào), 2010, 16(6): 89–93.

[17] 王麗萍, 岳耀穩(wěn), 張仲友. 降解煙堿細(xì)菌K9發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2016(9): 289–291.

(責(zé)任編校: 劉剛毅)

Nicotine degradation bacteria screening, save, and a preliminary study on the degradation of performance

Yin Quanyu, Zhang Yulan, Xu Xixi, Lu Shuang, Li Mengxia, Guo Fengqing, Liu Guoshun
(Tobacco College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to explore the different culture medium preservation methods, the degradation performance of nicotine-degrading bacteria under different culture conditions, with the nicotine regarded as the sole carbon source and nitrogen source, twenty-five nicotine-degrading bacteria are isolated from the tobacco-growing soil and rotten tobacco leaves of the modern tobacco agriculture science and education park of Xuchang Campus of Henan Agricultural University, and the nicotine concentration is 6 g/L, and several strains with high degradation efficiency are selected as the research object. The results show that the nicotine activity of the strain preserved with nicotine as the sole carbon source and nitrogen source (2～3 g / L nicotine) is higher. A nicotine-degrading bacterium 5A-6-2 is screened and still have strong ability of nicotine degradation when other carbon and nitrogen sources are present.5A-6-2 is inoculated into solid flue debris, and the nicotine content of tobacco leaves decrease by 44.2% after 7 d fermentation at 28 ℃. 16S rDNA sequence analysis shows that it is 99% homology to Pseudomonas putida.

nicotine degradation bacteria; screening; save; degradation characteristics

S 572

: A

1672–6146(2017)03–0028–05

10.3969/j.issn.1672–6146.2017.03.007

殷全玉, quanyuy@126.com; 劉國順, liugsh@371.net。

: 2017–01–20

中國煙葉公司技改項(xiàng)目(3401302); 中國煙草總公司山東省公司科技重大專項(xiàng)和重點(diǎn)項(xiàng)目(201308)。