林曉驥，錢(qián)紫君，倪勵(lì)斌，孫妮，周曉海，童歡歡，周舒萍，姚榮欣

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325027）

組蛋白去乙?；?在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及意義

林曉驥，錢(qián)紫君，倪勵(lì)斌，孫妮，周曉海，童歡歡，周舒萍，姚榮欣

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325027）

目的：觀察組蛋白去乙?；?（HDAC6）在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）中的表達(dá)情況，并探討其與各種臨床病理因素及生存情況的關(guān)系。方法：選取2007年12月-2015年9月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院確診的93例DLBCL患者和15例反應(yīng)性淋巴結(jié)增生患者作為研究對(duì)象。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)DLBCL組織HDAC6蛋白表達(dá)情況，χ2檢驗(yàn)和Kaplan-Meier法分析HDAC6的表達(dá)與各種臨床因素和生存情況的關(guān)系。結(jié)果：在93例DLBCL組織中HDAC6高表達(dá)率為69.9%，顯著高于反應(yīng)性淋巴結(jié)增生組織的20%（P＜0.05）。在DLBCL中，高表達(dá)組國(guó)際預(yù)后指數(shù)（IPI）評(píng)分為0～2分的比例顯著高于低表達(dá)組（P＜0.05），乳酸脫氫酶升高和β2-微球蛋白值升高比例均顯著低于低表達(dá)組（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示HDAC6高表達(dá)組的5年總生存時(shí)間和無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間均顯著高于低表達(dá)組。結(jié)論：HDAC6在DLBCL患者中呈高表達(dá)，高表達(dá)組患者有IPI評(píng)分低和腫瘤負(fù)荷輕的特點(diǎn)。HDAC6高表達(dá)是DLBCL的良好預(yù)后因素。

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤；組蛋白去乙酰化酶6；預(yù)后

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是惡性淋巴瘤WHO分類(lèi)中最常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）類(lèi)型，占成人NHL的30%～40%，為一組異質(zhì)性很強(qiáng)的B細(xì)胞性淋巴瘤[1]。DLBCL臨床病程呈侵襲性，隨著免疫化療的引入，本病的長(zhǎng)期緩解率得到了進(jìn)一步提高，但仍有部分DLBCL患者療效不佳。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者熱衷于對(duì)DLBCL發(fā)病機(jī)制和預(yù)后相關(guān)因

素進(jìn)行研究[2-3]。組蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）作為HDAC家族中的一員，被證實(shí)與多種不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。MARQUARD等[4]研究揭示，在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)有HDAC6的異常表達(dá)，而且HDAC6的表達(dá)程度與患者的預(yù)后呈正相關(guān)，HDAC6高表達(dá)的患者生存時(shí)間更長(zhǎng)。但有關(guān)HDAC6在DLBCL中的作用研究甚少，因此我們探討HDAC6在DLBCL中的表達(dá)及臨床意義，為DLBCL的預(yù)后提供可靠的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2007年12月至2015年9月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院確診，資料完整的93例DLBCL患者為研究對(duì)象，另選15例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者作為對(duì)照。所有病例的組織病理學(xué)診斷嚴(yán)格按照WHO造血和淋巴組織腫瘤性疾病分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[5]。臨床分期和近期療效分別參照Ann Arbor標(biāo)準(zhǔn)[6]和1999年淋巴瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色：所有石蠟標(biāo)本制成3～5 μm厚度的切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色（SP法）。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，將已確定的陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。用HDAC6鼠抗人單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）檢測(cè)HDAC6的表達(dá)，胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒判為陽(yáng)性。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色程度評(píng)分及實(shí)驗(yàn)分組：不著色為0分，著色淡為1分，著色適中為2分，著色深為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。按兩積分相乘計(jì)算總分，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～6分為中等陽(yáng)性（++），＞6分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]，將HDAC6表達(dá)（-/+）劃為低表達(dá)組，（++～+++）劃為高表達(dá)組。

1.2.3 治療方法：所有DLBCL患者均接受R-CHOP或CHOP方案化療。CHOP方案：環(huán)磷酰胺750 mg/m2，靜脈注射，第1天；表阿霉素70～90 mg/m2，靜脈注射，第1天；長(zhǎng)春地辛2 mg/m2，靜脈注射，第1天；潑尼松100 mg/m2，口服1～5 d。R-CHOP方案：在CHOP方案基礎(chǔ)上，在化療前1 d給予利妥昔單抗375 mg/m2，靜脈滴注。3周為1療程，中位化療療程為5（4～8）個(gè)。對(duì)化療后殘留病灶或化療前巨大腫塊給予區(qū)域放療（范圍8～50 Gy，中位45 Gy）。

1.2.4 隨訪(fǎng)：隨訪(fǎng)的截止時(shí)間為死亡或2015年12 月11日，中位隨訪(fǎng)時(shí)間47（4～98）個(gè)月。本組的研究終點(diǎn)是總生存時(shí)間（overall survival，OS）和無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間（progression-free survival，PFS）。OS定義為初次確診至死亡或末次隨訪(fǎng)時(shí)間，PFS定義為治療有效開(kāi)始至淋巴瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)、死亡或末次隨訪(fǎng)時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 DLBCL組織中HDAC6的表達(dá)情況（×400）

2.1 DLBCL患者HDAC6表達(dá)情況 HDAC6呈棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞的胞質(zhì)。93例DLBCL患者中，低表達(dá)組28例（占30.1%），其中弱陽(yáng)性12例，陰性16例；高表達(dá)組65例（占69.9%），其中中等陽(yáng)性24例，強(qiáng)陽(yáng)性41例，見(jiàn)圖1。15例反應(yīng)性淋巴結(jié)增生患者中，高表達(dá)組3例（占20%），低表達(dá)組13例（80%），與DLBCL患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 DLBCL患者HDAC6表達(dá)情況與臨床特征關(guān)系HDAC6高表達(dá)組的國(guó)際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）為3～5的患者比例顯著低于低表達(dá)組（P＜0.05）；高表達(dá)組的乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）升高患者比例顯著低于低表達(dá)組（P＜0.05），β2-微球蛋白升高患者比例亦低于低表達(dá)組（P＜0.05）；低表達(dá)組與高表達(dá)組的性別、年齡、Ann Arbor分期、ECOG評(píng)分、GCB/ 非GCB比例以及原發(fā)部位差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 HDAC6表達(dá)與DLBCL臨床特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 HDAC6對(duì)DLBCL患者生存的影響 93例患者5年OS和5年P(guān)FS分別為59.5%和46.1%；HDAC6低表達(dá)組的5年OS（為41.9%）顯著低于高表達(dá)組（為69.0%）（χ2=5.54，P=0.011）；低、高表達(dá)組的5年P(guān)FS分別為32.2%和53.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.30，P= 0.038），見(jiàn)圖2。依據(jù)治療方案分層分析顯示，接受CHOP方案和R-CHOP方案的患者5年OS分別是52.8% 和67.3%（χ2=5.31，P=0.018）。HDAC6表達(dá)在治療方案分層方面仍然與DLBCL患者的總生存率顯著相關(guān)（P＜0.05），接受CHOP方案患者中HDAC6低、高表達(dá)組5年OS分別為38.9%和62.5%，而接受R-CHOP方案患者中HDAC6低、高表達(dá)組5年OS分別為40%和76%，見(jiàn)圖3。

圖2 HDAC6的表達(dá)對(duì)DLBCL患者預(yù)后的影響

3 討論

IPI是DLBCL患者最經(jīng)典的預(yù)后評(píng)價(jià)體系，但I(xiàn)PI未能涉及腫瘤的分子生物學(xué)指標(biāo)，即使具有相同IPI評(píng)分的患者預(yù)后仍有可能存在較大差異。因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛致力于尋找與DLBCL預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物。由于DLBCL細(xì)胞表面的抗原獲取相對(duì)容易，其作用也成為研究的熱點(diǎn)。

圖3 HDAC6的表達(dá)對(duì)接受不同治療方案DLBCL患者預(yù)后的影響

HDAC是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)過(guò)程中的調(diào)控關(guān)鍵酶之一。HDAC6為HDAC家族中的一員，其基因位于Xp11.23染色體上，主要在腎臟、心臟及肝臟等組織表達(dá)。目前，HDAC6由于與腫瘤關(guān)系密切而備受廣大科研工作者青睞。LEE等[9]研究顯示在SKOV3轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞系、MCF-7乳腺癌細(xì)胞系和SKBR3乳腺癌細(xì)胞系中，HDAC6基因的敲除能不同程度地抑制細(xì)胞增殖；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)HDAC6特異性的shRNA處理后的SCID小鼠的腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑制，如進(jìn)一步用野生型的HDAC6重構(gòu)HDAC6敲除的小鼠，能重新獲得最初的表型。由此可見(jiàn)，HDAC6在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中扮演著極其重要的角色，可能會(huì)成為治療腫瘤的重要分子靶點(diǎn)。

目前研究結(jié)果顯示，HDAC6在口腔鱗癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌以及多發(fā)性骨髓瘤等均呈高表達(dá)，且HDAC6的表達(dá)與腫瘤的大小、惡性程度和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-13]。然而有關(guān)HDAC6在DLBCL中的表達(dá)情況以及與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性報(bào)道甚少。MARQUARD等[14]研究表明HDAC6在31例DLBCL患者中存在異常表達(dá)，HDAC6表達(dá)率高達(dá)71%，而且HDAC6低表達(dá)患者可能預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示在DLBCL患者中有69.9%呈高表達(dá)HDAC6，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，而高表達(dá)HDAC6的DLBCL患者IPI評(píng)分為3～5、LDH升高和β2-微球蛋白值升高比例均顯著低于低表達(dá)患者，因此本研究提示DLBCL患者存在HDAC6的異常表達(dá)，而高表達(dá)組患者有IPI評(píng)分低和腫瘤負(fù)荷輕的特點(diǎn)。本研究通過(guò)生存分析發(fā)現(xiàn)HDAC6高表達(dá)組的5年0S和PFS均顯著高于低表達(dá)組。眾所周知，R-CHOP方案治療DLBCL的療效和預(yù)后遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于接受CHOP方案治療的患者，而本研究同樣顯示接受R-CHOP方案治療的DLBCL患者的預(yù)后較好。為了排除治療方案對(duì)預(yù)后的干擾，我們對(duì)治療方案進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，在不同治療方案的情況下，HDAC6高表達(dá)組總生存率均顯著高于低表達(dá)組。以上結(jié)果高度提示HDAC6的表達(dá)可能是DLBCL患者的獨(dú)立的良好預(yù)后因素。

綜上所述，HDAC6在DLBCL患者中呈高表達(dá)，而HDAC6的高表達(dá)是DLBCL患者的良好預(yù)后因素。因而我們可以通過(guò)對(duì)HDAC6的表達(dá)分析為DLBCL患者提供更準(zhǔn)確的預(yù)后判斷。

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（本文編輯：吳彬）

Expression of histone deacetylase 6 in diffuse large B-cell lymphoma and its clinical significance

LIN Xiaoji, QIAN Zijun, NI Libin, SUN Ni, ZHOU Xiaohai, TONG Huanhuan, ZHOU Shuping, YAO Rongxin. Department of Hematology, the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To explore the histone deacetylase 6 (HDAC6) expression in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and to analyze its relationship with the clinicopathological characteristics and survival.Methods:The clinical data from 93 DLBCL patients and 15 patients with reactive hyperplasia of lymph node who were treated in the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University from December 2007 to September 2015 was retrospectively analyzed. Cases were subjected to immunohistochemical staining for HDAC6 protein expression in the DLBCL tissue. SPSS was used to analyze the relationship between HDAC6 expression and various clinical factors, and the relationship between HDAC6 and survival.Results:High expression rates of HDAC6 protein in 93 DLBCL tissues were 69.9%, which was signifi cantly higher than 20% in reactive hyperplasia of lymph node (P＜0.05). In DLBLC, the ratio of IPI (0-2) in high expression group was signifi cantly higher than that in low expression group but the ratio of increased LDH and β2-microglobulin in high expression group was signifi cantly lower than that in low expression group (P＜0.05). On Kaplan-Meier analysis, the 5-year overall survival and the 5-year progression free survival in high expression group was signifi cantly higher than that in the low expression one.Conclusion:HDAC6 is highly expressed in DLBCL patients, patients with highly expressed HDAC6 represents low IPI score and light tumor burden. The highly expressed HDAC6 as a favorable prognostic factor has more prognostic value for DLBCL.

diffuse large B-cell lymphoma; histone deacetylase 6; prognosis

R557

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.007

2016-07-01

溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20130205）。

林曉驥（1983-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師。

姚榮欣，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：yaorx0821@ 163.com。