周學鵬 萬云燕 江斌

NVP-BEZ235體外對膽管癌細胞株QBC939增殖及凋亡的影響

周學鵬 萬云燕 江斌

目的 研究NVP-BEZ235體外對膽管癌細胞株QBC939增殖及凋亡的影響。方法 在體外培養(yǎng)人膽管癌細胞株QBC939，通過流式細胞儀檢測NVP-BEZ235對QBC939凋亡的影響；MTT法檢測NVP-BEZ235作用24小時、48小時和72小時對QBC939的增殖影響；Western blot分析NVP-BEZ235作用48小時對QBC939凋亡的影響(PARP)，并檢測分析相關(guān)信號通路蛋白Bcl-2、Akt、p-Akt、c-FLIPL和 Mcl-1 表達水平的變化。結(jié)果 NVP-BEZ235能抑制QBC939的增殖，抑制作用具有時間依賴性和濃度依賴性，同時能誘使細胞發(fā)生凋亡。NVP-BEZ235導致細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Mcl-1、c-FLIPL和Bcl-2表達下調(diào)，并降低p-Akt表達。結(jié)論 NVP-BEZ235抑制 Akt的磷酸化，NVP-BEZ235通過PI3K/Akt通路下調(diào)Bcl-2、Mcl-1和c-FLIPL的表達，從而誘使QBC939出現(xiàn)凋亡，抑制QBC939增殖。

膽管癌； NVP-BEZ235； 增殖； 凋亡

膽管癌通常是由于膽道長期處于炎癥和損傷環(huán)境，并由修復性膽管上皮細胞增殖而引起，是一種高度惡性的腫瘤。大約90.0%患者發(fā)現(xiàn)時已屬于癌癥晚期，手術(shù)治療并不能根治，預后差。膽管癌對普通化療抵抗性很強，總生存期沒有增加。研究發(fā)現(xiàn)，許多信號通路與膽管癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并且靶向治療膽管癌顯示了潛在價值[1]。NVP-BEZ235是一種PI3K/mTOR雙重抑制劑，有研究提示NVP-BEZ235對結(jié)腸癌細胞、腎癌細胞、乳腺癌細胞、白血病細胞等都顯示有很好的抗瘤活性[2-5]。我們利用膽管癌細胞QBC939為對象，探討NVP-BEZ235對QBC939增殖、凋亡的影響，以期為進一步臨床研究提供依據(jù)。

材料與方法

一、材料

NVP-BEZ235購自Cell Signaling公司，用DMSO溶解后貯存于-20℃。實驗前用新鮮培養(yǎng)液按一定比例稀釋到所需濃度。甲基噻唑基四唑(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、DMSO購自Amresco公司； GAPDH抗體購自Millipore 公司；Bcl-2、PARP、Akt 抗體購自碧云天公司，p-Akt、Mcl-1和c-FLIPL抗體購自Cell Signaling公司，堿性磷酸酯酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、堿性磷酸酯酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自碧云天公司。Annexin V-FITC(PI)凋亡試劑盒購自天津三箭公司。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：人膽管癌細胞株QBC939購自武漢普諾賽公司。細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.細胞凋亡率檢測：按1×106/孔的密度將QBC939細胞接種于6孔板中，加入NVP-BEZ235使終濃度分別為0、25、50、125、250和500 nM，在37℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后依據(jù)Annexin V-FITC(PI)凋亡檢測試劑盒說明書操作進行染色，流式細胞儀測定凋亡率。實驗重復3次。

3.MTT法測定細胞增殖：對數(shù)生長期的細胞消化后計數(shù)，調(diào)整濃度為5×104/ml，接種于96孔板中，每孔100 μl，并設(shè)2孔作空白對照孔，放入 5%CO2培養(yǎng)箱中37℃過夜貼壁。第2天加入不同濃度藥物，每個濃度3個復孔，終體積200 μl/孔。培養(yǎng)不同時間后加入 MTT，加入前每空移除 100 μl培養(yǎng)基。每孔加入10 μl濃度為5 mg/ml MTT溶液，37℃反應(yīng)4 h后每孔加100 μl DMSO溶解，吹打混勻后在酶標儀上檢測各孔490 nm的吸光值(OD)。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%，細胞抑制率=100%-細胞存活率。

4.Western blot 檢測蛋白表達：收集不同藥物濃度處理48小時的細胞蛋白，每孔加入40 μg樣品用10%SDS-PAGE電泳分離蛋白。半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜20 V 60分鐘，加入5%脫脂奶粉室溫條件下?lián)u蕩封閉2小時，棄封閉液，TBST洗膜3次，按相應(yīng)濃度稀釋一抗(Bcl-2、PARP、Akt按1：500稀釋，GAPDH、p-Akt、Mcl-1、c-FLIPL按1∶1000稀釋)，4℃過夜孵育(大約12小時)，次日TBST洗膜7分鐘×3次后，按1：1000稀釋相應(yīng)二抗，室溫搖床孵育2小時，洗膜7分鐘×3次后，按BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒進行顯影。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

1.NVP-BEZ235對QBC939細胞凋亡的影響：用0、25、50、125、250和500 nM的NVP-BEZ235處理48小時后，采用Annexin V-FITC(PI)雙染法檢測，隨著NVP-BEZ235濃度的增加，細胞凋亡程度增加。各組NVP-BEZ235處理后48小時晚期凋亡率均高于0 nM(P<0.05)，并且125、250和500 nM的NVP-BEZ235處理后48小時早期期凋亡率均高于0 nM(P<0.05)。見表1。

注：與0 nM比較，aP<0.05

2.NVP-BEZ235對膽管癌細胞株QBC939增殖的影響：用0 nM、25 nM、50 nM、125 nM、250 nM、500 nM的NVP-BEZ235分別作用于膽管癌細胞株QBC939 24小時、48小時、72小時，MTT法檢測細胞的增殖，進而計算出NVP-BEZ235對細胞生長的抑制率。不同濃度NVP-BEZ235處理后膽管癌細胞QBC939增殖情況，見圖1。圖1表明，NVP-BEZ235能抑制QBC939的生長，對細胞的生長抑制均具有明顯的濃度依賴性和時間依賴性。藥物劑量與抑制率之間的關(guān)系采用直線相關(guān)性分析，24小時r=0.818，P<0.05；48小時r=0.828，P<0.05；72小時r=0.856，P<0.05。NVP-BEZ235濃度>50 nM時，相同濃度不同時間點間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.Western blot檢測結(jié)果：NVP-BEZ235可誘使細胞發(fā)生凋亡，不同濃度處理后，檢測發(fā)現(xiàn)PARP可降解，Bcl-2、Mcl-1、c-FLIPL在NVP-BEZ235處理后的的表達量明顯下降，NVP-BEZ235能抑制p-Akt，濃度越大，p-Akt-表達量越低(圖2)。

討 論

PI3K/Akt通路在人體很多腫瘤中都發(fā)揮效應(yīng)，該通路與細胞增殖、分化、凋亡、黏附、遷移和代謝等過程相關(guān)，同時與腫瘤微環(huán)境的形成有關(guān)[6]。NVP-BEZ235作為雙激酶抑制劑能同時靶向PI3K和mTOR通路，通過與該通路兩種關(guān)鍵激酶PI3K和mTOR競爭性結(jié)合ATP，進而調(diào)控下游物質(zhì)(如p-Akt、p-Ser473、p-p70S6K、p-S6K1和p-4EBP1等)的表達水平[7]。本研究結(jié)果表明，NVP-BEZ235在體外能抑制QBC939的生長，并具有時間依賴性和濃度依賴性，NVP-BEZ235可以誘使QBC939發(fā)生凋亡并抑制其增殖。

Bcl-2是最早確定為抗凋亡活性的基因，Bcl-2表達量高低與細胞抗凋亡能力強弱呈正相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著NVP-BEZ235藥物濃度加大，細胞凋亡程度加深，Bcl-2表達量下降，說明Bcl-2可能介入了NVP-BEZ235誘使QBC939凋亡過程。Mcl-1屬于Bcl-2家族抗凋亡蛋白成員之一，Mcl-1蛋白的高表達不僅與癌癥的產(chǎn)生以及發(fā)展密切相關(guān)，還會致機體對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，從而大大降低其敏感性。Choudhary等[8]發(fā)現(xiàn)，NVP-BEZ235在用于治療惡性淋巴增殖性疾病時，可降低Mcl-1的表達水平。本實驗還證實，NVP-BEZ235誘使QBC939凋亡時，Mcl-1表達量明顯下降。

圖1 不同濃度NVP-BEZ235處理后膽管癌細胞QBC939增殖情況

圖2 NVP-BEZ235作用48小時蛋白表達情況

c-FLIPL是一種抗凋亡蛋白，在許多腫瘤細胞中呈高表達，與腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在用抗腫瘤藥物白藜蘆醇作用于H460肺癌細胞時，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇誘使H460肺癌細胞凋亡時，可引起PARP和caspase 8的活化，從而使c-FLIPL、p-Akt、p-EGFR、NF-kB表達量下降[9]。隨著NVP-BEZ235藥物濃度加大，細胞凋亡程度加深，c-FLIPL表達量下降，說明c-FLIPL可能介入了NVP-BEZ235誘使QBC939凋亡過程。

有研究表明，NVP-BEZ235經(jīng)阻斷PI3K/Akt/mTOR通路發(fā)揮治療作用。高表達磷酸化Akt被證實與膽管癌形成呈正相關(guān)，PI3K/Akt/mTOR通路在調(diào)節(jié)膽管癌凋亡中發(fā)揮重要作用。研究NVP-BEZ235誘導人腎癌細胞凋亡時發(fā)現(xiàn)，NVP-BEZ235可以通過抑制磷酸化Akt表達，同時下調(diào)Mcl-1和Bcl-2的表達[3]。在研究抗精神病藥硫利達嗪研究對腎癌細胞凋亡作用時發(fā)現(xiàn)，硫利達嗪可以通過抑制磷酸化Akt表達，從而導致Mcl-1和c-FLIPL的表達降低[10]。本實驗結(jié)果表明，NVP-BEZ235在誘導QBC939凋亡時，磷酸化Akt表達降低，同時Bcl-2、Mcl-1和c-FLIPL的表達隨著NVP-BEZ235濃度的增高逐漸減低。我們推測，NVP-BEZ235經(jīng)PI3K/Akt/mTOR通路通過抑制Akt的磷酸化來下調(diào)Bcl-2、Mcl-1和c-FLIPL的表達，從而讓QBC939出現(xiàn)凋亡，達到抑制QBC939生長的效果。

NVP-BEZ235能通過誘導細胞凋亡抑制膽管癌細胞株QBC939的增殖，與NVP-BEZ235抑制磷酸化Akt表達，從而導致抗凋亡蛋白Mcl-1、c-FLIPL和Bcl-2的表達水平下調(diào)有關(guān)。NVP-BEZ235在膽管癌中的作用有待進一步研究。

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(本文編輯：楊澤平)

Effects of NVP-BEZ235 on proliferation and apoptosis with human cholangiocarcinoma QBC939 cell line in vitro

ZHOUXuepeng，WANYunyan，JIANGBin.

(DepartmentofHepaticandBiliaryPancreaticSurgery，TaiheHospital，HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China)

Objective To investigate the effects of NVP-BEZ235 on proliferation and apoptosis of human cholangiocarcinoma(CCA) cell QBC939 in vitro and to reveal the antineoplastic mechanisms of NVP-BEZ235.Methods Human CCA cell line QBC939 was used in this study.Cell apoptosis by NVP-BEZ235 was analyzed using the flow cytometry.Cell growth inhibition by NVP-BEZ235 for 24h 48h 72h by MTT assay.The antineoplastic mechanisms of NVP-BEZ235 for 48h were assessed by western blotting for PARP、Bcl-2、Akt、p-Akt、c-FLIPLand Mcl-1 assay in QBC939 cell.Results NVP-BEZ235 treatment inhibited the proliferation and induced apoptosis of human CCA cell QBC939，which appeared time-dependent and concentration-dependent effects.NVP-BEZ235 reduced protein levels of Mcl-1、c-FLIPLand Bcl-2 and downregulate protein level of p-Akt significantly.Conclusion NVP-BEZ235 inhibited the phosphorylation of Akt.NVP-BEZ235 downregulated Bcl-2、c-FLIPL、Mcl-1 protein level via PI3K/AKT signaling pathway to induce apoptosis and inhibit the proliferation of human CCA cell QBC939.

cholangiocarcinoma； NVP-BEZ235； proliferation； apoptosis

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.06.013

442000 湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院肝膽胰外科

2017-04-01)