謝 瑩， 盧辛未， 譚 鐳， 詹 雁， 阮 佳， 徐超群

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041）

UPLC法測(cè)定馬甲子藥材中馬甲子素和messagenic acid B

謝 瑩1，2， 盧辛未1，2， 譚 鐳2， 詹 雁2， 阮 佳2， 徐超群2

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041）

建立UPLC同時(shí)測(cè)定馬甲子藥材中馬甲子素和messagenic acid B 2種抗腫瘤活性成分的方法。采用Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1mm×50mm，1.7μm）色譜柱，乙腈-0.1%甲酸溶液流動(dòng)相梯度洗脫；流量：0.45mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)320nm。結(jié)果表明：馬甲子素和messagenic acid B分別在0.1986～3.972μg，0.1514～3.028 μg范圍進(jìn)樣量與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均加標(biāo)回收率分別為99.20%（RSD=1.34%）和99.69%（RSD=0.56%）。該方法能在3.5min內(nèi)使馬甲子素和messagenic acid B最大程度地分離，相比較HPLC而言，更加快捷、高效。

馬甲子；messagenic acid B；超高效液相色譜；抗腫瘤活性

0 引 言

馬甲子（Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir）為鼠李科馬甲子屬植物，主要含有三萜類、總黃酮和環(huán)肽生物堿等成分，具有治療瘡癰潰瘍，解毒消腫的功效[1]。本課題組經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)研究，從馬甲子葉中分離出一種新型的五環(huán)三萜類化合物，結(jié)構(gòu)鑒定并命名為馬甲子素。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，相比于馬甲子葉中抗腫瘤活性成分白樺脂酸[2-3]，馬甲子素的抗腫瘤活性更強(qiáng)[4]。單獨(dú)的馬甲子素含量的HPLC測(cè)定方法已見報(bào)道[5-6]。通過(guò)對(duì)馬甲子化學(xué)成分的進(jìn)一步研究，從馬甲子葉中首次分離出一種化合物單體，經(jīng)鑒定為已知化合物messagenic acid B[7-8]，與馬甲子素僅存在單雙取代基的差異，均屬于以白樺脂酸為母核的五環(huán)三萜類衍生物，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性[9]。本文通過(guò)建立超高效液相色譜（UPLC）含量測(cè)定方法[10]，在10 min內(nèi)完成一次馬甲子樣品分析。此方法分離度好，重復(fù)性高，能同時(shí)測(cè)定馬甲子藥材中兩種活性成分，可較為全面地控制有效成分的含量，為馬甲子藥材的質(zhì)量控制和合理種植、采收提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試藥

Waters ACQUITY超高效液相色譜，包括四元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣恒溫樣品管理器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站。

乙腈（色譜純，美國(guó)Sigma）；超純水；甲酸、甲醇均為分析純（成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司）。

馬甲子素對(duì)照品和messagenic acid B對(duì)照品（成都普思生物科技股份有限公司，經(jīng)峰面積歸一法計(jì)算，純度均大于98%）；馬甲子鮮葉采于四川省成都市新津牧馬山，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院鑒定為鼠李科馬甲子屬多年生木本植物馬甲子Paliurus ramosissmus（Lour.）Poir。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 樣品的配置

分別精密稱取馬甲子素和messagenic acid B對(duì)照品1.986mg、1.514mg，用甲醇超聲溶解并定容至10mL，即得各自對(duì)照品溶液。精密吸取各自對(duì)照品溶液2.5mL至10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，混合均勻，作混合對(duì)照品溶液。

精密稱取經(jīng)冷凍干燥后的馬甲子葉粉末5.0 g（過(guò)4號(hào)篩），置具塞三角瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，80℃加熱回流提取3 h，取出冷卻后，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相 A：乙腈；流動(dòng)相B：0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序如表1所示，流量：0.45mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；進(jìn)樣量：4 μL；混合對(duì)照品和馬甲子供試品的色譜圖分別見圖 1（a）和圖 1（b）。

1.2.3 線性關(guān)系

表1 UPLC線性梯度洗脫程序

圖1 混合對(duì)照品和供試品溶液的UPLC圖譜

分別精密吸取馬甲子素和messagenic acid B對(duì)照品溶液，按 1，2，4，8，15，20 μL 的進(jìn)樣量，以 1.2.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2），分別計(jì)算線性回歸方程：y（馬甲子素）=8×106x+36 725（r2=0.999 8）；y（messagenic acid B）=9×106x+51485（r2=0.9999）。 表明馬甲子素對(duì)照品和messagenic acid B對(duì)照品分別在 0.1986～3.972μg，0.1514～3.028μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液4μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定馬甲子素和messagenic acid B峰面積的RSD分別為1.48%和1.35%，表明儀器精密度較好，具體數(shù)據(jù)如表2所示。

圖2 馬甲子素和messagenic acid B的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次的馬甲子葉粉末5份（過(guò)4號(hào)篩），按1.2.1方法制得供試品溶液，進(jìn)樣4μL，測(cè)定馬甲子素和messagenic acid B的含量，其RSD分別為1.93%和0.93%，表明本方法具有較好的重復(fù)性，具體數(shù)據(jù)如表3所示。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取等量同一批次的馬甲子葉粉末（過(guò)4號(hào)篩），按1.2.1方法制得供試品溶液，分別在2，4，8，10，12，24h進(jìn)樣 4μL， 測(cè)定馬甲子素和 messagenic acid B的含量，其RSD分別為0.87%和1.20%（如表4所示）。結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

1.2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取5份同一批次馬甲子葉粉末均2.5 g（過(guò)4號(hào)篩），分別測(cè)定含量后，精密加入混合對(duì)照品適量，按1.2.1方法制得供試品溶液，進(jìn)樣4μL，計(jì)算平均回收率，結(jié)果如表5所示，表明回收率較好。

1.2.8 樣品測(cè)定

取10批等量的馬甲子葉粉末（過(guò)4號(hào)篩），分別按照1.2.1方法制得供試品溶液，進(jìn)樣4μL，在本文所述色譜條件下，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表6。

表5 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果

2 結(jié)束語(yǔ)

目前對(duì)馬甲子研究處于物質(zhì)基礎(chǔ)研究和初步藥效學(xué)階段，messagenic acid B是首次從馬甲子葉中分離得到的具有較好抗腫瘤活性的白樺脂酸類衍生物，將該成分與馬甲子素共同作為活性指標(biāo)成分是一種相對(duì)比較為合理的質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。單個(gè)的馬甲子素HPLC含量測(cè)定方法已被報(bào)道，其完成一次樣品分析時(shí)間至少要40min。采用UPLC對(duì)馬甲子進(jìn)行含量測(cè)定未見文獻(xiàn)報(bào)道，本文方法大幅縮短了含測(cè)定時(shí)間，分離度較高，峰型完整，同時(shí)檢測(cè)2種活性成分的含量，可較為全面地控制馬甲子藥材中活性成分的動(dòng)態(tài)變化。從樣品UPLC圖譜發(fā)現(xiàn)，messagenic acid B附近有兩個(gè)較為獨(dú)立的色譜峰（圖1（b）所示供試品中3號(hào)峰和4號(hào)峰），根據(jù)峰位與峰型推測(cè)，其結(jié)構(gòu)可能與馬甲子素非常相近，計(jì)劃對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。

[1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].5版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：242.

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（編輯：莫婕）

UPLC determination of paliurusene and messagenic acid B content in Paliurus ramosissimus leaves

XIE Ying1，2，LU Xinwei1，2，TAN Lei2，ZHAN Yan2，RUAN Jia2，XU Chaoqun2
（1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China；2.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China）

A UPLC method was established for simultaneous determination of two antitumor active ingredients（paliurusene and messagenic acid B） in paliurus ramosissmus.A Waters ACQUITY UPLC BEH-C18 （2.1 mm×50 mm，1.7 μm） column with acetonitrile-0.1%methanoic acid as a mobile phase was adopted for gradient elution at the flow rate of 0.45 mL/min，the column temperature was 30℃ and the detection wavelength was 320 nm.The results showed that two active ingredients （paliurusene and messagenic acid B）had a good linearity relationship between the sample content and peak area within the selected concentration range（0.198 6-3.972 μg，0.151 4-3.028μg）.The average sample recovery rate was 99.20%（RSD=1.34%） and 99.69%（RSD=0.56%）respectively.Two active ingredientsachieved the greatestdegree ofseparation in 3.5 min.Compared with HPLC，this method was much faster and more efficient.

Paliurus ramosissmus；messagenic acid B；UPLC；antitumor activity

A

1674-5124（2017）04-0048-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.04.011

2016-08-23；

2016-10-18

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（15ZC1978）；四川省科研院所科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（14010139）

謝 瑩（1992-），女，陜西咸陽(yáng)市人，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樗巹W(xué)。