龐文彪，李莉紅，皇甫冰，劉茂林，張銳虎，宋國(guó)華

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心； 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001)

研究報(bào)告

中國(guó)地鼠口腔頰囊黏膜癌變過(guò)程凋亡相關(guān)基因caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2的表達(dá)

龐文彪#，李莉紅#，皇甫冰，劉茂林，張銳虎，宋國(guó)華*

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心； 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001)

目的 探討凋亡相關(guān)基因caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2在中國(guó)地鼠口腔正常黏膜、上皮單純?cè)錾⑸掀ぎ惓Ｔ錾枉[狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其意義。方法 采用免疫組織化學(xué)法、RT-PCR檢測(cè)正常中國(guó)地鼠口腔黏膜上皮、單純?cè)錾掀?、異常增生上皮和鱗癌組織中caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果 在口腔黏膜癌變過(guò)程中，鱗癌組織中抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯高于口腔正常黏膜、上皮單純?cè)錾?、上皮異常增?P<0.05)；異常增生上皮caspase-3、caspase-9、Bax表達(dá)均明顯高于正常組(P<0.05)，但隨著增生程度的加重，caspase-3、caspase-9、Bax表達(dá)明顯降低(P> 0.05)。相關(guān)性分析顯示，鱗癌組織中Bcl-2與Bax、caspase-3、caspase-9呈負(fù)相關(guān)(P< 0.05)。 RT-PCR 結(jié)果表明，與正常組織相比，鱗癌組織中Bcl-2高表達(dá)，而caspase-3、caspase-9、Bax的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)地鼠鱗癌組織中caspase-3、caspase-9、Bax表達(dá)降低而B(niǎo)cl-2表達(dá)上升，揭示了caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2表達(dá)與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可以為口腔頰囊黏膜癌的基因治療提供一些線索或并為評(píng)價(jià)OSCC的生物學(xué)特征及預(yù)后提供參考。

中國(guó)地鼠；口腔鱗狀細(xì)胞癌；凋亡

在我國(guó)，鱗狀細(xì)胞癌在口腔頜面部的惡性腫瘤中占80%以上，5年的生存率約為60%，并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。隨著人們生活習(xí)慣的不斷改變，口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)在人群中的發(fā)病情況由原來(lái)男女構(gòu)成比約為2∶1轉(zhuǎn)變?yōu)榕曰颊叩脑鲩L(zhǎng)速度大于男性[1]。在美國(guó)，每年約30 000口腔癌的新發(fā)病例中，有90%的口腔癌患者為口腔鱗狀細(xì)胞癌[2]。目前，國(guó)內(nèi)的口腔醫(yī)療與衛(wèi)教雖已將進(jìn)入發(fā)達(dá)國(guó)家之林，但遺憾的是大部分主要進(jìn)行手術(shù)切除，這不僅使患者在日常生活存在許多不便，同時(shí)外形的改變?cè)斐苫颊咝睦砩弦泊嬖谝恍┘膊?。相關(guān)學(xué)者針對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制作了很多研究，但是具體機(jī)制還不太明確。

研究表明，腫瘤的形成是細(xì)胞增殖的調(diào)控與細(xì)胞凋亡發(fā)生紊亂的結(jié)果，細(xì)胞凋亡狀態(tài)及其調(diào)控基因的異常參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3，4]。細(xì)胞凋亡即細(xì)胞程序性死亡，是細(xì)胞在基因與多種因子共同調(diào)控作用下發(fā)生的正常生理過(guò)程，細(xì)胞凋亡調(diào)控程序障礙會(huì)打亂機(jī)體細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)平衡，引起細(xì)胞的過(guò)度增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生?？谇击[狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展與口腔黏膜上皮細(xì)胞的增殖/凋亡失衡有關(guān)。caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，在許多惡性腫瘤中的研究較多，而在口腔癌中的聯(lián)合研究比較少見(jiàn)。本文采用免疫組化、RT-PCR檢測(cè)中國(guó)地鼠正?？谇火つそM織、單純?cè)錾M織、異常增生組織及口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2 的表達(dá)情況，并觀察其與細(xì)胞凋亡及四基因之間的關(guān)系，為OSCC的發(fā)生機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)中國(guó)地鼠60只，8～10周齡，雄性，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(晉)2015-0001】。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在屏障環(huán)境【SYXK(晉)2015-0001】下進(jìn)行，溫度控制在25℃左右，相對(duì)濕度40%～70%，12 h/12 h光暗循環(huán)條件下，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的要求進(jìn)行操作。

1.1.2 主要試劑

兔抗人、大鼠、小鼠、兔caspase-9、Bax、Bcl-2多克隆抗體，兔抗大鼠、小鼠caspase-3多克隆抗體，SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒和30% H2O2，均購(gòu)自武漢博士德生物公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司。

1.2 方法

1.2.1 口腔癌前病變和鱗癌動(dòng)物模型制備

隨機(jī)將60只雄性中國(guó)地鼠分為三個(gè)組，分別為模型組(24只)、溶劑對(duì)照組(12只)、空白對(duì)照組(24只)。每周一、三、五上午9：00進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)操作：①模型組：用小頭棉簽在中國(guó)地鼠雙側(cè)頰囊涂擦0.5% DMBA丙酮液，用洗耳球吹干并禁食禁水2 h；②溶劑對(duì)照組：?jiǎn)瓮勘?，涂抹方法同模型組；③空白對(duì)照組：不做任何處理。

持續(xù)15周，同時(shí)按WHO標(biāo)準(zhǔn)的12項(xiàng)分級(jí)記錄判定[5]頰囊病理改變，最終成功建模。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遵循“3R”原則，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的處死方法進(jìn)行處理。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)頰囊組織中caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

根據(jù)病理鑒定后的結(jié)果，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)挑選出的口腔正常黏膜組織、上皮單純?cè)錾M織、上皮異常增生組織及鱗癌組織。按SABC試劑盒給的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體操作：載玻片防脫片劑處理；切片常規(guī)脫蠟至水；30% H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫5～10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次；熱修復(fù)抗原；5%BSA 封閉；一抗、二抗處理；DAB 室溫顯色；蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察免疫組織化學(xué)切片caspase-9、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況，細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜和/或細(xì)胞核呈棕黃色、棕褐色或彌漫性著色的為陽(yáng)性細(xì)胞。每組選定3個(gè)重復(fù)，采用Image Pro Plus(IPP)圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，隨機(jī)選取每張切片不同的5個(gè)視野，在高倍鏡(×200)下觀察，測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度值，以每例5個(gè)視野的平均光密度的平均值作為該例的測(cè)量值。平均光密度值越高說(shuō)明表達(dá)越強(qiáng)，反映組織內(nèi)蛋白含量越多。

1.2.3 RT-PCR法測(cè)定頰囊組織中caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)

取15周頰囊凍存組織中口腔鱗癌組織(模型組)和正常組織(正常組)，Trizol 法常規(guī)提取總RNA，用核酸濃度檢測(cè)計(jì)和酶標(biāo)儀測(cè)定RNA濃度和純度(A260/280比值)。若A260/280≥1.8，說(shuō)明RNA達(dá)到實(shí)驗(yàn)純度要求，能夠繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序，以總RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用Primer Premier 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)上下游引物，由軟件Oligo 6評(píng)估引物，并在NCBI官方網(wǎng)站對(duì)引物進(jìn)行Blast特異性檢驗(yàn)，全部引物在華大基因公司合成，引物序列見(jiàn)表1。應(yīng)用ABI 7300型熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：2× SYBR? Premix Ex TaqII 10 μL；50× ROX Reference Dye 0.4 μL；上游引物0.8 μL(濃度10 μmol/mL)；下游引物0.8 μL(濃度10 μmol/mL)；cDNA溶液2 μL；滅菌蒸餾水(dH2O)6 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，(95℃ 5 s，60℃ 31 s)×40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本同時(shí)做三個(gè)重復(fù)。

β-Actin基因作為內(nèi)參對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△CT進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR所用引物Tab.1 Primer sequences for the real-time quantitative PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 病理鑒定結(jié)果

分別于第6、9、12、15周將模型組和空白對(duì)照組隨機(jī)處死6只，溶劑對(duì)照組隨機(jī)處死3只，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，6周內(nèi)中國(guó)地鼠的形態(tài)呈相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，改變不明顯；在9周以后逐漸出現(xiàn)不典型增生，并逐漸嚴(yán)重；建模12周時(shí)，出現(xiàn)2只患有原位癌及鱗癌的中國(guó)地鼠，占13.3%；建模15周時(shí)患有原位癌及鱗癌的中國(guó)地鼠達(dá)到6只，占40%?？瞻讓?duì)照組、溶劑對(duì)照組與模型組標(biāo)本病理鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組標(biāo)本病理鑒定結(jié)果Tab.2 Results of pathological examination of the specimens

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)中國(guó)地鼠口腔頰黏膜癌變各階段的蛋白表達(dá)

2.2.1 caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示caspase-3、caspase-9陽(yáng)性染色表達(dá)于細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)，表現(xiàn)為黃色、棕黃或棕褐色顆粒(見(jiàn)圖1)。在正?？谇火つぶ衏aspase-3、caspase-9表達(dá)程度較均一，可見(jiàn)中等陽(yáng)性反應(yīng)，主要為基底細(xì)胞和棘細(xì)胞層底部或極少量表層細(xì)胞的胞質(zhì)著色，及角化層著色，偶見(jiàn)基底上細(xì)胞或表層細(xì)胞胞核著色。上皮單純?cè)錾鷆aspase-3、caspase-9的陽(yáng)性表達(dá)較正常黏膜組織輕度增加，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。隨著上皮異常增生程度的加劇，caspase-3、caspase-9陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在重度上皮異常增生組織中表達(dá)最強(qiáng)，染色最深呈棕褐色，陽(yáng)性細(xì)胞彌漫遍布上皮全層。在鱗狀細(xì)胞癌組織中，caspase-3陽(yáng)性表達(dá)明顯減少，表現(xiàn)為弱陽(yáng)性染色，染色較淺呈淡黃色且不規(guī)則的分布在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。從正?？谇火つさ疆惓Ｔ錾?，caspase-3、caspase-9的表達(dá)呈增加趨勢(shì)，其caspase-3的平均光密度明顯高于鱗癌組織，caspase-3陽(yáng)性表達(dá)顯著低于正常組、上皮單純?cè)黾雍蜕掀ぎ惓Ｔ錾M(P<0.001)。經(jīng)單因素方差分析caspase-3、caspase-9在正?？谇火つ?、上皮單純?cè)錾M織、上皮異常增生組織及鱗癌組織中的表達(dá)差異有顯著性(F=149.16，P<0.001；F=206.48，P<0.001)。caspase-3除正?？谇火つづc上皮異常增生之間，其他各組之間差異有顯著性(P<0.001)。caspase-9多重比較分析兩組之間差異有顯著性(見(jiàn)表3和圖2)。

表3 caspase-3、caspase-9在口腔黏膜癌變各階段A值比較Tab.3 Comparison of the OD values of caspase-3 and caspase-9 at different stages of the oral mucosa carcinogenesis

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001; 與單純?cè)錾M比較△P<0.05，○P<0.01，☆P<0.001;與異常增生組比較▲P<0.05，●P<0.01，★P<0.001。(下表同)

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001; Compared with the simple hyperplasia group,△P<0.05,○P<0.01,☆P<0.001; Compared with the epithelial dysplasia group,▲P<0.05,●P<0.01. (The same in following tables)

2.2.2 Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察，Bax、Bcl-2蛋白陽(yáng)性染色表現(xiàn)為不同程度的棕黃色或棕褐色顆粒狀著色，Bax陽(yáng)性物質(zhì)主要見(jiàn)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽(yáng)性細(xì)胞呈彌漫性分布，少數(shù)見(jiàn)散在分布(見(jiàn)圖1)，Bcl-2 陽(yáng)性物質(zhì)主要見(jiàn)于胞核和/或胞質(zhì)，細(xì)胞輪廓較為清晰。經(jīng)單因素方差分析，Bax、Bcl-2組間比較差異均有顯著性(F=72.096，P<0.001；F=63.439，P<0.001)。正常口腔黏膜Bax表達(dá)程度較均一，為局限于基底層與角化層細(xì)胞的棕黃色中陽(yáng)性表達(dá)，Bcl-2僅在基底層有少量陽(yáng)性細(xì)胞，表現(xiàn)為黃色或棕色顆粒。從上皮單純?cè)錾疆惓Ｔ錾?，相?duì)于正常組，Bax、Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)均有所增強(qiáng)，Bax陽(yáng)性細(xì)胞幾乎遍布角質(zhì)層以下的上皮各層但染色強(qiáng)度無(wú)明顯改變，總體增幅較小，單純?cè)錾c異常增生之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)；異常增生組織中Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)和著色強(qiáng)度明顯增加，與正常組和單純?cè)錾M相比差異有顯著性(P<0.05)。鱗癌組織中，Bax陽(yáng)性表達(dá)明顯下降，細(xì)胞著色較淡呈淺黃色，為弱陽(yáng)性表達(dá)。Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞在鱗癌組表達(dá)最強(qiáng)，呈彌漫性表達(dá)于胞核及胞質(zhì)， 著色呈現(xiàn)異質(zhì)性，表現(xiàn)為棕色或棕褐色顆粒。鱗癌組Bax、Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)與正常組、單純?cè)錾M、鱗癌組相比差異均有顯著性(P<0.001)(表4、圖2)。

2.2.3 四種蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示口腔黏膜癌變過(guò)程中caspase-3、caspase-9、Bax、 Bcl-2 均存在顯著的變動(dòng)趨勢(shì)，我們猜想基因之間可能存在著一定的關(guān)系，共同參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步的相關(guān)性分析揭示在鱗癌組織中，caspase-3與caspase-9在口腔異常增生組織(r=0.90，P<0.05)、鱗癌組織(r=0.89，P<0.05)中存在明顯的相關(guān)性，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Bax與Bcl-2在鱗癌組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.92，P<0.05)；鱗癌組織中caspase-3、caspase-9的表達(dá)與Bax呈正相關(guān)，與Bcl-2呈負(fù)相關(guān)。四個(gè)基因在鱗癌組織中兩兩之間均存在相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

2.3 RT-PCR法測(cè)定中國(guó)地鼠頰囊組織中caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)

為了明確凋亡相關(guān)因子在口腔癌中的表達(dá)情況，我們進(jìn)一步利用以β-actin為內(nèi)參的RT-qPCR檢測(cè)了兩組地鼠頰囊組織中凋亡相關(guān)因子caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常組織相比，地鼠頰囊鱗癌組織中caspase-3、caspase-9、Bax的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2在鱗癌組織中高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)，差異有顯著性(t=5.50，P<0.01)(見(jiàn)表5和圖3)。

表4 Bax、Bcl-2在口腔黏膜癌變各階段A值比較Tab.4 Comparison of the A values of Bax and Bcl-2 at different stages of oral mucosa carcinogenesis

注：Normal：對(duì)照組;SH：?jiǎn)渭冊(cè)錾M；ED：異常增生組；SCC：鱗癌組。圖1 caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2 的免疫組化結(jié)果(IHC×200，bar=100 μm)Note.Normal：the control group;SH：the simple hyperplasia group；ED：the epithelial dysplasia group；SCC：the squamous cell carcinoma group.Fig.1 Expressions of caspase-3,caspase-9,Bax and Bcl-2 at different stages of carcinogenesis. (Immunohistochemical staining)

注：A:與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001; 與單純?cè)錾M比較△P<0.05，○P<0.01，☆P<0.001;與異常增生組比較▲P<0.05，●P<0.01，★P<0.001。圖2 口腔黏膜癌變各階段caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白的表達(dá)Note. Compared with the control group,*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; Compared with the simple hyperplasia group,△P<0.05,○P<0.01,☆P<0.001; Compared with the epithelial dysplasia group,▲P<0.05,●P<0.01,★P<0.001.Fig.2 The expression of caspase-3，caspase-9，Bax and Bcl-2 protein at different stages of oral mucosa carcinogenesis

基因名Genes正?？谇火つormaloralmucosa原位癌及鱗癌Carcinomainsituandsquamouscellcarcinomascaspase-31.00±0.050.27±0.10***caspase-91.04±0.370.44±0.06**Bax1.38±0.260.65±0.11**Bcl-21.01±0.202.09±0.27**

注：A:與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3 口腔黏膜癌變各階段caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)Note. Compared with the control group，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.Fig.3 The expression of caspase-3, caspase-9, Bax and Bcl-2 mRNA at different stages of the oral mucosa carcinogenesis

3 討論

近年來(lái)，大量學(xué)者關(guān)于人類惡性腫瘤的研究不僅局限于分子層面而且已經(jīng)深入到基因水平。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜且多因素引起的過(guò)程，其最主要的原因就是惡性腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖與細(xì)胞凋亡障礙，即細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡失衡所引起的。

細(xì)胞凋亡是一種重要的自穩(wěn)機(jī)制, 對(duì)多細(xì)胞動(dòng)物機(jī)體的正常發(fā)育和自身穩(wěn)定具有極其重要的作用, 細(xì)胞凋亡失衡與許多疾病尤其是與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6]。細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中主要起負(fù)調(diào)控作用, 可以阻遏腫瘤細(xì)胞迅速生長(zhǎng)。根據(jù)目前對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí), 可將與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因大致分為促凋亡基因和抗凋亡基因兩大類。當(dāng)細(xì)胞促凋亡基因活性受抑制和/或抗凋亡基因被激活, 使該細(xì)胞不能凋亡而長(zhǎng)期存活, 再加上癌基因異常高表達(dá)和/或腫瘤抑制基因活性受抑制, 最終可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變和腫瘤形成[7]。與其他腫瘤一樣，口腔癌作為頭頸部較常見(jiàn)的腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展也與細(xì)胞凋亡失衡有關(guān)。OSCC綜合治療效果不佳且預(yù)后較差，在過(guò)去三十年里，雖然在臨床診斷及治療上取得很大進(jìn)步，但其5年生存率并沒(méi)得到很好改善[8，9]。因此，從細(xì)胞凋亡方面研究口腔癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

嚴(yán)格控制細(xì)胞凋亡過(guò)程的眾多基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2 家族、caspase家族、癌基因C-myc、抑癌基因p53 等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2家族是一類在細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)[11]，Bcl-2 和Bax分別是Bcl-2 家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因，在腫瘤細(xì)胞凋亡中具有重要的調(diào)控作用[12]，當(dāng)Bcl-2表達(dá)量增多時(shí)，Bcl-2/Bax異源二聚體的數(shù)量相應(yīng)增加，通過(guò)抑制線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放來(lái)抑制細(xì)胞凋亡；而當(dāng)Bax表達(dá)量較高時(shí)，Bax/Bax同源二聚體數(shù)量增加，此同源二聚體與增加線粒體膜上的通道結(jié)合使其通透性增加，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，從而激活caspase成員的一系列反應(yīng)而促使生物細(xì)胞凋亡[13]。caspase 家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程中極其重要的一組蛋白酶，無(wú)活性的caspase 酶原被不同信號(hào)分子激活裂解維持細(xì)胞生存的蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。caspase-3和caspase-9是caspase家族中的關(guān)鍵效應(yīng)酶，caspase-9位于內(nèi)源性傳導(dǎo)通路的起始部分，是重要的凋亡啟動(dòng)因子。細(xì)胞色素C在dATP條件下與Apaf-1(凋亡因子1)結(jié)合形成多聚體，激活caspase-9，進(jìn)而激活caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。

本研究中，當(dāng)上皮出現(xiàn)異常增生時(shí)，Bax的表達(dá)達(dá)到最強(qiáng)，提示機(jī)體試圖通過(guò)Bax/Bax表達(dá)加強(qiáng)來(lái)促進(jìn)異常增生細(xì)胞凋亡，進(jìn)而拮抗細(xì)胞的增殖；隨組織學(xué)分級(jí)的增加，Bcl-2表達(dá)水平越來(lái)越高，Bax的表達(dá)越來(lái)越低，Bcl-2/Bax比例逐級(jí)加劇，癌細(xì)胞的凋亡受抑制，癌細(xì)胞積累加強(qiáng)，促使了腫瘤的形成。許多研究發(fā)現(xiàn)caspase-3和caspase-9在乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤中表達(dá)量明顯降低[16-18]。本實(shí)驗(yàn)中，caspase-3和caspase-9在口腔鱗癌組織中的蛋白和mRNA表達(dá)均明顯下降，與口腔正常黏膜相比，差異有顯著性(P< 0.05)，呈正相關(guān)，提示caspase-3和caspase-9 在OSCC的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用，其機(jī)制可能為促進(jìn)細(xì)胞凋亡。還有相關(guān)研究指出，Bax 蛋白作為線粒體膜上離子通道的組成成分，上調(diào)可使Cyt-C 可穿過(guò)線粒體膜，激活caspase-9蛋白，進(jìn)一步激活caspase-3 蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]，提示我們Bax減少Bcl-2含量增多可能會(huì)抑制caspase-9蛋白活性進(jìn)而抑制caspase-3蛋白活性，引起腫瘤發(fā)生。我們進(jìn)一步分析顯示，鱗癌組織中Bcl-2含量確實(shí)增加而caspase-3、caspase-9、Bax降低，提示caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2基因在口腔黏膜癌發(fā)病過(guò)程中,參與細(xì)胞凋亡與癌變,與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為口腔癌的發(fā)生、發(fā)病機(jī)制,及臨床治療及預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。

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Expression of apoptosis-related genescaspase-3,caspase-9,BaxandBcl-2 during oral buccal mucosa carcinogenesis in Chinese hamster

PANG Wen-biao#, LI Li-hong#, HUANG Fu-bing, LIU Mao-lin, ZHANG Rui-hu, SONG Guo-hua*

(Laboratory Animal Center,Shanxi Medical University; Shanxi Key Laboratory Of Experimental Animal Science And Human Disease Animal Models, Taiyuan 030001,China)

Objective To study the expression and significance of apoptosis-related genescaspase-3,caspase-9,BaxandBcl-2 in oral normal mucosa, oral simple hyperplasia, oral epithelial dysplasia and oral squamous cell carcinomas (OSCC) in Chinese hamsters. Methods The expressions of mRNA and protein of caspase-3, caspase-9, Bax and Bcl-2 in the oral normal mucosa, oral simple hyperplasia, oral epithelial dysplasia and OSCC tissues in Chinese hamsters were examined by immunohistochemistry and RT-PCR. Results During the process of oral carcinogenesis, the expression of Bcl-2 protein was significantly higher in OSCC than in oral normal mucosa, oral simple hyperplasia, and oral epithelial dysplasia (P<0.05). In dysplastic epithelia, the protein expressions of caspase-3, caspase-9 and Bax were more than that of normal epithelia, and along with the increased dysplasis, the expression level was decreased. Further analysis showed that expression of Bcl-2 was negatively related with the expressions of Bax, caspase-3 and caspase-9 (P<0.05). The result of RT-PCR showed thatBcl-2 was significantly increased in OSCC compared with normal mucosa, while the expressions ofcaspase-3,caspase-9 andBaxwere decreased (P<0.05). Conclusions In the Chinese hamster squamous carcinoma, the expressions ofcaspase-3,caspase-9 andBaxare reduced and theBcl-2 expression are increased, indicating that the expressions ofcaspase-3,caspase-9,BaxandBcl-2 are closely related with the occurrence and development of oral squamous cell cancinoma. This study can offer some clues for gene therapy of OSCC, or can provide a reference for evaluating the biological characteristics and prognosis of OSCC.

Chinese hamster; Oral squamous cell carcinomas(OSCC); Apoptosis

SONG Guo-hua. E-mail： ghsongg@hotmail.com

山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專項(xiàng)(2014k08、2015k03)。

龐文彪 (1977-)，男，碩士，研究方向：人類疾病動(dòng)物模型。E-mail: 404535486@qq.com；李莉紅 (1988-)，女，碩士研究生，研究方向：人類疾病動(dòng)物模型。E-mail: 1179407927@qq.com。# 共同第一作者

宋國(guó)華 (1973-)，女，博士，主要研究方向：人類疾病動(dòng)物模型。E-mail: ghsongg@hotmail.com

Q95-33

A

1005-4847(2017)03-0263-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.03.006

2016-11-30