高歡歡 王文博 呂召云

摘要 [目的]確定黑腹果蠅和斑翅果蠅取食后櫻桃微生物的動態(tài)變化。[方法]利用2種果蠅分別取食櫻桃、共同取食櫻桃和自然腐爛4種處理方式，經(jīng)過2、4、6、8、10、12 d后，采用16S rDNA和ITS基因分析的方法分離鑒定櫻桃中的微生物。[結(jié)果]所有處理共分離鑒定出16種細菌和12種真菌。隨著時間的延長，不同處理櫻桃中微生物的動態(tài)發(fā)生了變化。自然腐爛8～12 d的櫻桃中微生物種類增多，優(yōu)勢細菌種群為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）；黑腹果蠅取食第6天，微生物種類最多，優(yōu)勢細菌種群為厚壁菌門；而斑翅果蠅以及2種果蠅同時取食櫻桃2 d后微生物種類就開始增加，可見斑翅果蠅的取食改變了微生物的多樣性，從而加快了櫻桃腐爛的速度，隨后黑腹果蠅形成二次為害；另外，在2種果蠅取食后的櫻桃中，白地霉（Geotrichum candidum）是櫻桃中較穩(wěn)定的優(yōu)勢真菌種群，但在自然腐爛的櫻桃中并未發(fā)現(xiàn)。[結(jié)論]該研究可為探索微生物、櫻桃、果蠅三者之間的協(xié)同進化關(guān)系提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 斑翅果蠅；黑腹果蠅；櫻桃；微生物多樣性；動態(tài)

中圖分類號 Q969.462.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0155-05

Abstract [Objective] The aim was to understand the dynamics of microbial diversity in natural cherry and the cherry treated by Drosophila suzukii and Drosophila melanogaster. [Method] The dynamics of microbial diversity in natural cherry and the cherry treated by Drosophila suzukii and Drosophila melanogaster， separately， and together， microorganisms in cherry treated by D. suzukii and D. melanogaster， for 2， 4， 6， 8， 10， 12 days were separated， purified， and identified through ITS and 16S rDNA genetic analysis. [Result] The Results showed that， 16 bacterial species and 12 fungi species were identified from all the materials. The dynamic of microbial diversity was changed with the increasing of time. The microorganism species was abundant from 8 to 12 day under the natural condition. The dominant populations of bacteria were Pseudomonas fluorescens and Staphylococcus sp.. After fed by D. melanogaster for 6 days， the largest number of microorganism species occurred at the 6th day and the bacteria of Firmicutes were dominant populations. While fed by D. suzukii or by two species of Drosophila together， the microorganism species increased from 2 to 6 day. It was concluded that，the decay of cherry was accelerated due to that the microbial diversity in cherry was changed by D. suzukii. D. melanogaster formed continuing harm through the mechanical injury from D. suzukii. in which the dominant populations of bacteria were the bacteria of Proteobacteria. Moreover， Geotrichum candidum was the steady and dominant fungus in cherry treated by Drosophila species but absent in the natural cherry. [Conclusion] This study provides a theoretical foundation for investigating coevolution among cherry， Drosophila sp. and microorganisms.

Key words Drosophila suzukii；Drosophila melanogaster；Cherry；Microbial diversity；Dynamics

山東省是甜櫻桃的生產(chǎn)大省，種植面積已超過5.0萬hm2，占全國的45.6%，產(chǎn)量和面積均居全國第一[1]，產(chǎn)品輸出量很大，經(jīng)濟效益較為顯著。近年來，櫻桃生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)蟲害問題，其中黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）和斑翅果蠅（D.suzukii）的種群密度較大，二者隸屬雙翅目果蠅科，寄主廣泛，包括櫻桃、草莓、葡萄等60多種植物，在全世界各地均有發(fā)現(xiàn)[2-3]。黑腹果蠅喜愛在腐爛的果實上產(chǎn)卵取食[4]；斑翅果蠅雌蟲的產(chǎn)卵管一側(cè)生有許多小鋸齒，呈鐮刀狀，堅硬狹長[5]，偏好在剛開始成熟變色的水果上產(chǎn)卵，孵化為幼蟲后蛀食果肉為害，果實逐漸軟化以致變褐腐爛，可造成高達40%～80%的產(chǎn)量損失[6]。因此，后者對櫻桃等水果的危害則更嚴重。

腐爛的果實中會滋生大量微生物，可對2種果蠅幼蟲的生長發(fā)育起到促進作用[7]。Milan等[4]發(fā)現(xiàn)，腐爛水果中的酵母可以為果蠅的生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)和必需氨基酸。當食物中酵母的數(shù)量低于0.1%時，黑腹果蠅1齡幼蟲死亡率顯著上升[8]。微生物群落還可影響果蠅的嗅覺和產(chǎn)卵行為，相對于單一的微生物環(huán)境，黑腹果蠅趨向于在酵母和醋酸菌共存的微生物環(huán)境中產(chǎn)卵，2種微生物參與果蠅體內(nèi)乙醇、醋酸的代謝，產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物有利于果蠅的生長發(fā)育[9]。因此，果蠅生存環(huán)境中的微生物對果蠅的生長發(fā)育和種群繁衍具有不可或缺的作用。櫻桃作為果蠅重要的寄主之一，腐爛過程中微生物多樣性的動態(tài)變化是了解果蠅與微生物協(xié)同進化關(guān)系的關(guān)鍵所在，但鮮見相關(guān)報道。為此，筆者將黑腹果蠅和斑翅果蠅分別或者同時取食新鮮櫻桃，隨著取食時間的增加，觀察微生物多樣性的動態(tài)變化，分析了微生物與2種果蠅生長發(fā)育的關(guān)系，旨在為研究果實、微生物和果蠅三者之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源。

黑腹果蠅和斑翅果蠅采集于山東省濟南市歷城區(qū)柳埠鎮(zhèn)王家峪村（117°10′E，36°27′N）櫻桃園中，飼養(yǎng)于人工氣候箱中，溫度（25.0±0.5）℃，濕度為70%±0.5%，光周期（L∶D）為16∶8 h，飼養(yǎng)4～5代后取羽化3 d的活體成蟲以及在櫻桃園中采摘的新鮮櫻桃用于試驗。

1.1.2 主要儀器與試劑。

超凈工作臺（SW-Cj-ZFD，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、人工氣候箱箱（RXZ-328A型，寧波江南儀器廠）、離心機（D-78532，德國Tuttlingen）、PCR儀（EPS301，美國Pharmacia公司）、電泳儀（JY3000，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（JY04S-3C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

NB培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PBS緩沖液、DNA提取試劑盒（Fungal DNA Kit D3390-01，OMEGA BIO-TEK公司）、2×Taq Plus PCR Master Mix（天根生化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同腐爛程度的櫻桃中微生物的分離。

在高壓滅菌過的組織培養(yǎng)瓶（直徑5.5 cm，高9.0 cm）中放入新鮮櫻桃，分別接入4對斑翅果蠅、4對黑腹果蠅成蟲以及斑翅果蠅和黑腹果蠅各2對，為保證果蠅的生命力，同時放入少量蜂蜜水，以不放入果蠅為自然腐爛處理，每個處理5個重復(fù)，分別取食2、4、6、8、10、12 d后，在無菌條件下將所取樣品在PBS緩沖液中勻漿，吸取勻漿液稀釋1×103、1×104和1×105倍。在各個處理中不同濃度的混合液中吸取400 μL，分別涂布于NB板和孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，每個濃度3次重復(fù)。涂板后放置25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，NB培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。經(jīng)過純化培養(yǎng)后，挑取純化好的各細菌菌落在LB液體培養(yǎng)基中過夜，搖勻，一部分用于16S rDNA鑒定，一部分加入等體積的60%甘油，-20 ℃保存，備用。

1.2.2 微生物分離物的基因鑒定。

1.2.2.1 細菌分離物的16S rDNA鑒定。

對于分離純化后的細菌采用16S rDNA鑒定法。以過夜、搖勻的菌液作為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：DNA模板2.0 μL，2.0×Taq Plus PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加入ddH2O補充至25.0 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)熱 3 min，94 ℃熱變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72 ℃反應(yīng)后延伸 5 min。

引物序列，16S rDNA-27F：5′-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′；16S rDNA-1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.2.2.2 真菌的ITS鑒定。

對于分離純化后的真菌采用ITS鑒定法。在鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基種收集真菌的菌絲，按照DNA提取試劑盒（Fungal DNA Kit D3390-01）提取各個真菌的DNA，通過1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同“1.2.2.1”。

引物序列，ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.2.2.3 測序分析。

將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定16S rDNA和ITS的條帶分別為1 500 kb左右和500 kb左右后，切膠回收，送上海生工生物工程有限公司測序部測序，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行Blast分析，尋找同源性最高的16S rDNA和ITS基因序列，并以此來判斷微生物的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃中的細菌種類及系統(tǒng)發(fā)育樹

經(jīng)過分離和鑒定，在斑翅果蠅、黑腹果蠅取食以及2種果蠅同時取食不同時間的櫻桃中共分離到16種細菌（表1）。細菌主要隸屬變形菌門、厚壁菌門和放線菌門，其中變形菌門γ-變形菌綱包括8種細菌，分別是比林歐文菌（Erwinia billingiae）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、沙雷氏菌（Serratia sp.）、雷氏普羅威登菌（Providencia rettgeri）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、菠蘿泛菌（Pantoea ananatis）、糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），厚壁菌門包括葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.），以及3種芽孢桿菌綱細菌，分別是臺中類芽孢桿菌（Paenibacillus taichungensis）、紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）和蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）。有4種不動桿菌屬細菌（Acinetobacter sp.）隸屬于放線菌門，其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1，經(jīng)過Blast分析后，與NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫中已有的細菌序列達到99%的同源性。

2.2 櫻桃中的真菌種類及系統(tǒng)發(fā)育樹

在3種處理方式下的櫻桃中分離鑒定得到12種真菌（表2）。其中，7種細菌隸屬于半知菌亞門，包括白地霉（Galactomyces candidum）、2種青霉屬真菌（Penicillium sp.）、柄藍狀菌（Talaromyces minioluteus）、4種曲霉屬真菌（Aspergillus sp.）、層生鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）。其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2，經(jīng)過Blast分析后，與NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫中已有的真菌序列同源性較高。

2.3 櫻桃中微生物多樣性的動態(tài)變化

不同的果蠅取食后，櫻桃中的細菌種類差異很大。櫻桃在自然腐爛的情況下分離得到5種細菌、7種真菌；斑翅果蠅取食后的櫻桃中分離得到10種細菌、3種真菌；黑腹果蠅侵染后分離得到10種細菌、8種真菌；2種果蠅同時取食后分離得到11種細菌、8種真菌。可見，黑腹果蠅參與取食的櫻桃中，細菌和真菌的種類均多于自然腐爛的櫻桃和斑翅果蠅取食的櫻桃；而因斑翅果蠅取食而產(chǎn)生的真菌種類較少。

隨著時間的變化，在自然腐爛的櫻桃中，第10天微生物種類較多，分離得到4種細菌和7種真菌；在斑翅果蠅剛剛?cè)∈硻烟? d后，微生物種類已較多，其中細菌6種，真菌1種，為白地霉，第4天豐富度急劇減少，第10天仍有5種細菌，但種類已發(fā)生變化，真菌增加至3種；黑腹果蠅取食后的櫻桃中細菌種類在第6天時最多，其中細菌7種，真菌8種，但過于腐爛的櫻桃（10 d以后）中微生物的種類反而有所減少；2種果蠅同時取食后，櫻桃內(nèi)的微生物種類在第2～6天時均較多，6 d以后微生物種類開始下降（表1、2）。

在微生物種類分布方面，自然腐爛的櫻桃中，變形菌門的熒光假單胞菌和葡萄球菌為細菌優(yōu)勢種群，真菌的優(yōu)勢種群為青霉屬和曲霉屬真菌，屬于半知菌亞門。而果蠅取食后，櫻桃中的微生物種類變化很大。斑翅果蠅取食后的櫻桃中，前期優(yōu)勢細菌種群并不明顯，后期變形菌門細菌占據(jù)優(yōu)勢地位，真菌種類則主要為半知菌亞門的白地霉；黑腹果蠅取食后，細菌優(yōu)勢種群為厚壁菌門的芽孢桿菌，真菌優(yōu)勢種群屬于半知菌類真菌；2種果蠅同時取食櫻桃后導(dǎo)致第2～6天細菌和真菌多樣性明顯增加，但白地霉是櫻桃中比較穩(wěn)定的優(yōu)勢真菌種類，同樣，接合菌亞門的卷枝毛霉也是果蠅取食后滋生的真菌，在自然腐爛的櫻桃中并未發(fā)現(xiàn)（表1、2）。

3 結(jié)論與討論

櫻桃作為斑翅果蠅和黑腹果蠅最重要的寄主植物，該研究利用2種果蠅取食櫻桃，對不同腐爛程度的櫻桃進行微生物的分離和鑒定，共培養(yǎng)獲得16種細菌和12種真菌，2種果蠅取食后櫻桃中的微生物種類差異并不大，但與自然腐爛的櫻桃相比，微生物的多樣性發(fā)生了明顯變化。

斑翅果蠅取食櫻桃后第2天，微生物種類較多，新鮮的櫻桃硬度較高[10]，斑翅果蠅的產(chǎn)卵器特化為鋸狀，可以刺破果皮產(chǎn)卵，而黑腹果蠅則無法順利地產(chǎn)卵取食，只能以蜂蜜水為食。而在第6天，櫻桃果皮硬度下降，黑腹果蠅產(chǎn)卵量和取食量增加，導(dǎo)致微生物種類達到最多，表明斑翅果蠅在櫻桃前期產(chǎn)卵造成的傷口可以為黑腹果蠅的產(chǎn)卵提供通道，由此增加了微生物的多樣性。另外自然腐爛8～12 d的櫻桃中，微生物種類較多，但細菌種類仍然少于果蠅取食后的櫻桃，果蠅取食前后導(dǎo)致的微生物多樣性差異可能與果蠅自身腸道內(nèi)的微生物有關(guān)，昆蟲取食寄主后，腸道內(nèi)的微生物經(jīng)過昆蟲的取食和排泄過程會傳遞到寄主體內(nèi)，可使其微生物多樣性發(fā)生動態(tài)變化。黑腹果蠅成蟲腸道中的微生物群落比較穩(wěn)定，有10余種微生物，以醋酸菌和乳酸菌為主，但幼蟲中的微生物群落并不穩(wěn)定，與寄主植物本身有關(guān)[11]。高歡歡等[12]在黑腹果蠅取食后的葡萄中發(fā)現(xiàn)大量醋酸菌的存在，該研究中，2種果蠅取食后的櫻桃中均未發(fā)現(xiàn)醋酸菌和乳酸菌，而是以多種致病菌為優(yōu)勢種群，這與櫻桃中本身存在的多種致病菌有關(guān)。

該研究中，在果蠅取食過程中，白地霉（Geotrichum geotrichum）是唯一持續(xù)存在的真菌。白地霉是水果中常見的真菌[13]，令楨民等[14]發(fā)現(xiàn)白地霉可以參與腐爛果實中產(chǎn)生的正己醇代謝，但也能夠加速果實的腐爛[15]。由此可見，白地霉在與櫻桃和果蠅的關(guān)系中具有重要的作用，已有研究證明白地霉可以促進斑翅果蠅的生長發(fā)育，縮短其發(fā)育歷期[16]。在黑腹果蠅取食后的第6天，產(chǎn)生了大量的青霉屬真菌（Penicillium sp.）、曲霉屬真菌（Aspergillus sp.）和毛霉屬真菌（Mucor sp.）。其中，曲霉屬和毛霉屬真菌則可以促進蛋白質(zhì)分解為游離的氨基酸[17]，促進果蠅的生長發(fā)育。但青霉屬真菌以及櫻桃中產(chǎn)生的6種變形菌門的細菌均是致病菌[18-21]，對果蠅的生長以及櫻桃的保存均具有抑制作用，果蠅取食櫻桃的后期，微生物數(shù)量急劇下降，可能與大量青霉菌和致病細菌的產(chǎn)生有很大關(guān)系。同時，該研究中，斑翅果蠅取食過的櫻桃中真菌的種類相對較少，說明黑腹果蠅引起櫻桃腐爛的速度遠高于斑翅果蠅。但是微生物對斑翅果蠅生長發(fā)育產(chǎn)生影響的機制則需要進一步的研究和論證。

另外，該研究采用的方法為純培養(yǎng)的方式，櫻桃內(nèi)的微生物并不能完全被分離和培養(yǎng)出來，目前，宏基因組分類測序方法已經(jīng)應(yīng)用于部分昆蟲中[22-23]，該技術(shù)可以將不同樣品中微生物的多樣性及其差異進行系統(tǒng)分析，為微生物多樣性的研究提供了更精確的方法，因此，將該方法用于研究微生物、昆蟲與寄主之間的關(guān)系是必然趨勢。

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