劉洋 金順義 常娟

摘要 [目的]為了提高中草藥的有效成分含量及生物學(xué)效價。[方法]以復(fù)合益生菌（干酪乳桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母）固態(tài)發(fā)酵復(fù)方中草藥（王不留行和益母草），分別測定總黃酮、總生物堿、粗多糖和總皂苷的含量，研究復(fù)合益生菌發(fā)酵前后中草藥成分的變化。[結(jié)果]中草藥經(jīng)微生物發(fā)酵后，可溶性總黃酮、總生物堿、粗多糖和總皂苷含量分別比未發(fā)酵組提高了55.14%、127.28%、55.42%和49.21%。[結(jié)論]復(fù)方中草藥經(jīng)過復(fù)合微生物發(fā)酵后其可溶性活性成分得到了顯著提高，為中草藥的深加工提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞 復(fù)合益生菌；微生物發(fā)酵；中草藥；活性成分

中圖分類號 R284 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0123-03

Abstract [Objective]In order to increase the effective components and biological value of Chinese herbs.[Methods]The compound probiotics such as Lactobacillus casei，Enterococcus faecalis and Candida utilis were used to ferment Chinese herbs （Semen vaccariae and Leonurus artemisia），the contents of total flavonoids，total alkaloids，crude polysaccharides and total saponins were determined，and the changes of Chinese herbal medicine components before and after fermentation were studied.[Result] The contents of soluble total flavonoids，total alkaloid，crude polysaccharide and total saponin in the fermented Chinese herbs were significantly increased by 55.14%，127.28%，55.42% and 49.21%，compared with the natural herbs.[Conclusion] The effective components of Chinese herbs are improved after probiotic fermentation，which can help the further processing and application of herbs.

Key words Compound probiotics；Microbial fermentation； Chinese herbs；Active ingredients

微生物發(fā)酵中草藥集合了中草藥、酶制劑、益生素3種物質(zhì)優(yōu)點，具有天然無毒、無副作用、無殘留、安全和清潔的優(yōu)勢[1-2]。中草藥的有效藥用成分十分復(fù)雜，主要包括生物堿、皂苷類、揮發(fā)油、黃酮類、多糖類、有機酸以及礦物元素和維生素，這些活性成分有助于增強機體免疫功能、抗應(yīng)激功能和抗菌等作用[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，王不留行的主要成分黃酮苷類具有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖與分泌的功能[6]；通過優(yōu)化超聲法提取王不留行多糖后發(fā)現(xiàn)，王不留行多糖具有較強的抗氧化活性[7]。益母草所含的糖類、揮發(fā)油和生物堿類等有效成分，具有調(diào)經(jīng)活血及利尿消腫之功效，對于興奮子宮、降低血液黏度、改善腎臟功能等具有明顯作用[8]。益生菌可在其代謝過程中，對中藥中某些活性成分如有機酸、多糖類等進(jìn)行分解，產(chǎn)生的分解產(chǎn)物可促進(jìn)自身的繁殖[9-10]。很多中草藥物由于自身結(jié)構(gòu)不能被機體有效直接吸收利用，而是作為前體物，經(jīng)腸道菌群的處理后，才能發(fā)揮藥效[11-12]。研究表明，含苷類物質(zhì)的中草藥需要經(jīng)微生物分泌的豐富酶類分解，成為具有藥物活性的苷元后，才能發(fā)揮其藥效[12]。為提高中草藥中的活性成分，增加中草藥的利用率，該試驗采用產(chǎn)朊假絲酵母、糞腸球菌、干酪乳桿菌3種復(fù)合益生菌發(fā)酵益母草和王不留行，分別測定總黃酮、總生物堿、粗多糖和總皂苷的含量，進(jìn)一步確定復(fù)合益生菌發(fā)酵前后中草藥成分的變化，為中草藥的深加工和實際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材

1.1.1 中草藥。王不留行和益母草，由河南德鄰生物制品有限公司提供，粉碎后過60目篩，裝入密封袋備用。

1.1.2 試驗菌種。產(chǎn)朊假絲酵母、干酪乳桿菌和糞腸球菌，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，由河南德鄰生物制品有限公司保存和擴(kuò)繁。

1.2 培養(yǎng)基的制備及微生物培養(yǎng)

1.2.1 MRS液體培養(yǎng)基。胰蛋白胨15 g、葡萄糖20 g、酵母浸粉10 g、吐溫-80 1 mL、硫酸鎂0.2 g、乙酸鈉2 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸鈉2 g、硫酸錳0.05 g，攪拌均勻后用蒸餾水定容至1 L，固體培養(yǎng)基可另外加入20 g 瓊脂。在121 ℃、0.15 MPa高壓蒸汽滅菌20 min后備用。干酪乳桿菌和糞腸球菌分別經(jīng)過MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選純化之后，分別接種至MRS液體培養(yǎng)基對其進(jìn)行擴(kuò)繁，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，得到干酪乳桿菌和糞腸球菌的菌液，調(diào)整有效活菌數(shù)為1.0×109 cfu/mL。

1.2.2 YPD液體培養(yǎng)基。酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水定容至1 L，固體培養(yǎng)基可另外加入20 g 瓊脂。在121 ℃、0.15 MPa高壓蒸汽滅菌20 min備用。產(chǎn)朊假絲酵母菌經(jīng)過YPD固體培養(yǎng)篩選純化后，接種至YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件為28 ℃和200 r/min，得到產(chǎn)朊假絲酵母菌的菌液，調(diào)整有效活菌數(shù)為1.0×109 cfu/mL。

1.3 復(fù)合益生菌濕態(tài)發(fā)酵中草藥 復(fù)合益生菌發(fā)酵中藥配方如表1，各組分?jǐn)嚢杈鶆蚝笤?7 ℃條件下發(fā)酵72 h，然后在濕態(tài)條件下取樣分析。對照組不接種微生物，只加入相應(yīng)比例的無菌培養(yǎng)基，其他配方和處理條件與試驗組相同。

1.4 總黃酮的測定 首先利用已報道的試驗方法及操作流程制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]，然后進(jìn)行黃酮含量的測定。具體方法如下：準(zhǔn)確稱取待測樣品3.00 g，置于200 mL索氏抽提三角瓶中，加入90 mL 70%乙醇，65 ℃恒溫浸提3 h，重復(fù)提取1次，定容于100 mL容量瓶作為樣品液。取2 mL樣品液，放入25 mL的比色管中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min；加入1.0 mL 5%硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min；加入10.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，用30%乙醇溶液定容至25 mL，搖勻后放置15 min，在510 nm處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品液中總黃酮濃度，再進(jìn)一步計算原料中總黃酮提取率?？傸S酮含量（mg/g）=C×12.5/樣品重量（g），其中，C為測試液中黃酮濃度（mg/mL），12.5為稀釋倍數(shù)。

1.5 總生物堿的測定 樣品中總生物堿含量的計算可參照付君葉等[14]的試驗方法。生物堿的純品不易單獨分離得到，雷氏鹽可以在酸性介質(zhì)中與生物堿結(jié)合生成絡(luò)合物沉淀，而沉淀在溶于丙酮后所形成的紫紅色溶液在波長525 nm處有最大吸光度?？偵飰A含量的計算公式為：W=A×M×V/ε，式中，W為總生物堿含量（mg/g），M=179.63為水蘇堿鹽酸鹽相對分子質(zhì)量，ε為雷氏鹽在丙酮中的克分子吸收系數(shù)為106.5（單鹽），V為所取丙酮的體積，A為525 nm處測得的吸光度。

1.6 粗多糖的測定 采用苯酚法-硫氨法進(jìn)行粗多糖提取[15-16]。吸取提取液2 mL置于25 mL比色管中，取雙餾水2 mL置于另一比色管中，分別加入新配置5%苯酚試劑1 mL，再迅速滴加5 mL濃硫酸，搖勻后室溫放30 min。以雙餾水作為空白對照組，于485 nm處測定吸光值。粗多糖濃度的計算方法為：W=（C×V1×n）/（V2×M×108.16），式中，W為可溶性粗多糖含量（%），C為標(biāo)準(zhǔn)方程求得的糖量，V1為提取液量，n為稀釋倍數(shù)，V2為吸取樣品液體積，M為樣品重量，108.16為葡萄糖分子質(zhì)量。

1.7 總皂苷的測定 參照洪奎等[17]方法進(jìn)行總皂苷提取。吸取供試品溶液各1 mL，置于10 mL比色管中，70 ℃水浴蒸干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，搖勻后置于70 ℃水浴中15 min，取出后流水冷卻，加冰醋酸至5 mL，采用紫外分光光度計于540 nm測定吸光度。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總皂苷含量?？傇碥諠舛龋╩g/g）=C2×A2/W，其中，C2為測試液中皂苷濃度（mg/mL），A2為稀釋倍數(shù)，W為樣品重量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行ANOVA方差統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

從表2可以看出，發(fā)酵后中草藥中的可溶性總黃酮、總生物堿、粗多糖和總皂苷含量分別較未發(fā)酵中藥提高55.14%（P<0.05）、127.28%（P<0.05）、55.42%（P<0.05）、49.21%（P<0.05）。由此可知，中草藥經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵后，顯著提高了可溶性有效活性成分的含量。

3 討論與結(jié)論

發(fā)酵技術(shù)是中藥材的傳統(tǒng)炮制方法，其起源可追溯至古老的釀酒技術(shù)，在我國有悠久的歷史。發(fā)酵中藥在民間的應(yīng)用極其廣泛，對于多種疾病具有良好的預(yù)防與治療作用。現(xiàn)代微生物發(fā)酵研究表明，微生物及其所分泌的多種酶類，可解除植物細(xì)胞壁對中藥有效成分釋放的抑制作用，使釋放出活性成分的含量得到大幅度提高，同時發(fā)酵過程中還能產(chǎn)生新的生物活性成分。據(jù)報道，中藥制劑經(jīng)微生物發(fā)酵后，通過HPLC法檢測分析，一些成分含量增加1～4倍，而且有新的特征峰產(chǎn)生[18]。黃芪經(jīng)M-9菌株發(fā)酵后多糖含量及得率分別提高84.92%和59.34%[19]。宗凱等[20]采用根霉、枯草芽孢桿菌、黑曲霉等發(fā)酵蒲公英，測得發(fā)酵后提取液中總黃酮濃度為0.097 mg/mL，約為蒲公英發(fā)酵前水提液中總黃酮濃度（0.025 mg/mL）的4倍。另據(jù)報道，經(jīng)白腐菌和纖維素分解菌發(fā)酵的甘草渣，發(fā)酵后黃酮得率分別為0.89%和0.87%，分別比發(fā)酵前提高了34.85%和31.82%[21]；人參經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，產(chǎn)物中總皂苷含量提高了32%[22]。此外，杜晨暉等[23]利用釀酒酵母ATCC9763和釀酒酵母GIM2.9對葛根芩連湯進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明發(fā)酵后總生物堿含量分別提高24.91%和30.89%。該研究利用復(fù)合益生菌發(fā)酵復(fù)方中草藥，提高了中草藥中總黃酮、生物堿、粗多糖和總皂苷等生物活性物質(zhì)的有效含量，取得了與前人研究相似的結(jié)果，為中草藥功效的提高奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳娟娟.發(fā)酵中草藥在動物生產(chǎn)方面的應(yīng)用展望[J].山西農(nóng)業(yè)（畜牧獸醫(yī)），2007，13（8）：12-14.

[2] 蘭時樂，李立恒，胡超，等.中草藥飼料添加劑發(fā)酵菌種的篩選與發(fā)酵條件研究[J].中國飼料，2010（15）：13-17.

[3] 吳德峰，陳佳銘，黃南華，等.中草藥免疫增強劑的藥效學(xué)和毒理學(xué)試驗研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報，2009，30（6）：129-134.

[4] 黃健暉.中草藥添加劑對奶?？篃釕?yīng)激和提高產(chǎn)奶量的影響[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009：9-15.

[5] 夏繼橋，姜海龍，何忠梅，等.中草藥替代抗生素對育肥豬生長性能和抗生素殘留量的影響[J].中國畜牧雜志，2013，49（23）：68-70.

[6] LEONOUDAKIS D，SINGH M，MOHAJER R，et al.Dystroglycan controls signaling of multiple hormones through modulation of STAT5 activity[J].Journal of cell science，2010，123（21）：3683-3692.

[7] 李蕓達(dá)，顏祖弟，黃濤，等.王不留行多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015（3）：446-450.

[8] 蔡曉菡，車鎮(zhèn)濤，吳斌，等.益母草的化學(xué)成分[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2006，23（1）：13-14.

[9] 劉靖.博落回生物堿對黃羽肉雞生長的影響[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：8-16.

[10] 黃恩福，黃柳梅，阮記明，等.腸道菌群與中草藥有效成分代謝的相互影響的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2016，36（9）：1619-1623.

[11] KOIZUMI M，SHIMIZU M，KOBASHI K.Enzymatic sulfation of quercetin by arylsulfotransferase from a human intestinal bacterium[J].Chemical & pharmaceutical bulletin，1990，38（3）：794-796.

[12] XU M M，WANG J F，XU C，et al.Microbial transformation of glycosides in traditional Chinese medicine：Mechanism and application[J].World science and technology，2006，8（2）：24-27.

[13] 王麗敏，鄭燦龍，高貴良，等.月見草葉中總黃酮提取工藝條件研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2013，19（2）：49-53.

[14] 付君葉，宋秋華.利用超聲法從益母草中提取總生物堿的研究[J].江西理工大學(xué)學(xué)報，2012，33（1）：18-20.

[15] 蔡文燕，吳水金，蔡欣.益母草多糖提取工藝的研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，28（6）：39-42.

[16] 李青，潘再良，吳潔，等.王不留行多糖提取工藝研究及其含量測定[J].食品工業(yè)科技，2014，35（12）：299-302.

[17] 洪奎，陳小鳳，馮磊，等.王不留行總皂苷提取工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（7）：27-30.

[18] 韓春楊，劉翠艷，牛鐘相.中藥制劑發(fā)酵前后成分的變化及對肉雞部分免疫指標(biāo)和生長的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2005，36（11）：1223-1227.

[19] 秦哲.黃芪發(fā)酵后主要有效成分變化分析及多糖對大鼠實驗性肝纖維化影響[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012：19-26.

[20] 宗凱，劉國慶，張黎利，等.蒲公英發(fā)酵及對其粗提物中黃酮類物質(zhì)含量的影響[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（創(chuàng)新版），2010，25（2）：38-41.

[21] 李艷賓，張琴，陶呈宇，等.微生物發(fā)酵提高甘草渣中黃酮類物質(zhì)提取率的研究[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（9）：156-159.

[22] 陳旸，王義，孫亮，等.植物乳桿菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷的研究[J].中國中藥雜志，2014， 39（8）：1435-1440.

[23] 杜晨暉，閆艷，馮前進(jìn)，等.葛根芩連湯發(fā)酵前后總黃酮和總生物堿含量變化研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（11）：4850-4853.