王曉菲 薛一 劉長(zhǎng)莉

摘要 [目的]研究惡霉靈（3-羥基-5-甲基異惡唑）對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)，及其對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響。[方法]采用濾紙接觸法進(jìn)行不同濃度惡霧靈對(duì)蚯蚓的毒害作用試驗(yàn)，并測(cè)定蚯蚓體內(nèi)蛋白含量。[結(jié)果]蚯蚓在接觸農(nóng)藥時(shí)有明顯反應(yīng)，染毒48 h惡霉靈對(duì)蚯蚓半致死濃度（LC50）為2.455 g/L，不同濃度農(nóng)藥處理結(jié)果存在顯著差異（P<0.05）。 各種濃度的惡霉靈處理24 h后，蚯蚓體內(nèi)蛋白含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，處理48 h后呈現(xiàn)出升高、降低、再升高的變化。并且用同一個(gè)濃度處理24 、48 h后，其體內(nèi)蛋白質(zhì)含量也存在顯著差異（P<0.05）。[結(jié)論]惡霉靈對(duì)蚯蚓具有毒害作用，且受到的毒害程度隨濃度和培養(yǎng)時(shí)間的增加而加重。蚯蚓在染毒后體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量發(fā)生一定的變化。

關(guān)鍵詞 惡霉靈；蚯蚓；濾紙接觸法；毒性效應(yīng)

中圖分類號(hào) S171.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）34-0095-04

Abstract [Objective]The aim is to study the Hymexazol （3-hydroxy-5-methylisoxazole） toxicity effect on earthworms and its influence on the protein content of earthworms.[Method]Method of filter paper contact was used to study the toxicity effects of different concentrations of Hymexazol on earthworm ，and the protein content of earthworms was determined.[Result] Earthworms had a significant response to pesticide exposure，and the lethal concentration （LC50） of 48 hours against earthworms was 2.455 g/L.In addition，there were significant differences with different concentrations of Hymexazol treatment（P<0.05）.The total soluble protein content of earthworms increased first and then decreased after treating with various concentrations of Hymexazol for 24 hours.While they present increased，decreased and increased again after treating for 48 hours.There was also significant difference in protein content between 24 h and 48 h treated with the same concentration （P<0.05）.[Conclusion] Hymexazol has a toxic effect on earthworms，and the degree of poisoning rose with increasing concentration and incubation time.And the total soluble content of the protein in the earthworm has a certain change after exposuring.

Key words Hymexazol； Earthworms； Method of filter paper contact； Toxic effects

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，農(nóng)藥與化肥大量使用，帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也嚴(yán)重污染破壞了土壤環(huán)境。蚯蚓是土壤中常見(jiàn)的雜食性環(huán)節(jié)動(dòng)物之一，在生態(tài)環(huán)境保護(hù)中，蚯蚓能夠改善土壤成分，提高土壤肥力，分解固體廢物，調(diào)節(jié)土壤pH[1]。另外，土壤中有許多動(dòng)物都是以蚯蚓為食，一旦土壤中的污染物積累在蚯蚓體內(nèi)，這些污染物就會(huì)沿著食物鏈進(jìn)行傳遞和富集[1-2]，從而可能對(duì)食物鏈中更高級(jí)的生物產(chǎn)生威脅[3]。因此，根據(jù)其生物學(xué)特性，蚯蚓常被用作為測(cè)定土壤環(huán)境污染狀況的模式生物之一[4-6]。

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體細(xì)胞、組織的重要成分。在某些理化因素的作用下，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變性，并且多數(shù)蛋白質(zhì)的變性是不可逆的。研究表明，蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的變化可以作為土壤毒理診斷指標(biāo)之一[7]。惡霉靈是一種新型農(nóng)藥，其藥效作用獨(dú)特，在防治病害等方面具有高效、廣譜、內(nèi)吸性等特點(diǎn)，得到廣泛應(yīng)用，但目前關(guān)于惡霉靈是否對(duì)環(huán)境有害鮮有報(bào)道。為此，選取哈爾濱市周邊地區(qū)，研究惡霉靈對(duì)當(dāng)?shù)厥卟舜笈镏序球镜亩拘孕?yīng)及其蛋白質(zhì)含量的影響，為該地區(qū)農(nóng)藥污染的生態(tài)毒理檢測(cè)和農(nóng)業(yè)害蟲的生物學(xué)防治提供理論依據(jù)，同時(shí)也為科學(xué)的評(píng)價(jià)這種農(nóng)藥的生態(tài)安全性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蚯蚓

蚯蚓采集于哈爾濱周邊的蔬菜大棚，選取有明顯環(huán)帶、體重為300～500 mg、大小基本相同的健康成蚓進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 藥品

惡霉靈（批號(hào)為HNP37113-D4202），由威海韓孚生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。惡霉靈（hymexazol）又名綠亨一號(hào)、土菌消，為高效殺菌劑和土壤消毒劑，為白色可濕性粉劑。分子式為C4H5NO2；化學(xué)名稱為3-羥基-5-甲基異惡唑；結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

1.3 試劑

蛋白測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)； 考馬斯亮蘭貯備液，上海拜力生物科技有限公司生產(chǎn)；蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，北京雷根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.4 器材

電冰箱（BCD-215ADL）購(gòu)于海爾公司；離心機(jī)（DD-5M低速臺(tái)式離心機(jī)）購(gòu)于上海珂淮儀器有限公司；分光光度器（UV-9600）、玻璃比色皿、電子天平（CPA224S）購(gòu)于上海菁華科技科技儀器有限公司；移液槍（10～100、20～200 μL）購(gòu)于大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；玻璃培養(yǎng)皿（直徑15 cm，高2.5 cm）、中速濾紙（直徑15 cm）、量筒（10 mL）、燒杯（50、100 mL）、離心管（10 mL）購(gòu)于北京華興科諾生物技術(shù)有限公司。

1.5 方法

1.5.1 污染物試驗(yàn)濃度設(shè)計(jì)。

在正式試驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)對(duì)農(nóng)藥濃度范圍進(jìn)行選擇，確保所選污染物濃度染毒48 h對(duì)蚯蚓在最大致死濃度（LD100）和最小致死濃度（mLD）的范圍內(nèi)。然后在選取的濃度區(qū)間設(shè)置正式濃度梯度序列進(jìn)行正式試驗(yàn)。惡霉靈選取濃度分別為2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6 g/L。

1.5.2 蚯蚓急性毒性試驗(yàn)。進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，采用濾紙接觸法，找出濃度范圍，并在此濃度范圍內(nèi)設(shè)置

2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6 g/L 7個(gè)濃度梯度，進(jìn)行蚯蚓毒性試驗(yàn)。

挑選出體型大小基本一致，有明顯生殖環(huán)帶的蚯蚓，用清水洗去表面泥土后放入底部有一層濾紙的1 000 mL燒杯中，并且噴灑少量的水，以保證濕潤(rùn)，之后用保鮮膜將燒杯口封住，并用解剖針扎孔使燒杯內(nèi)部與外界保持空氣流通，清腸24 h[8]。

在直徑15 cm的玻璃培養(yǎng)皿中放入3張濾紙，使濾紙剛好遮住皿底。用注射器取10 mL各濃度惡霉靈水溶液按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度分別均勻注入墊有3張濾紙的培養(yǎng)皿中，使濾紙全部浸濕并標(biāo)好序號(hào)。每一濃度設(shè)置3組重復(fù)試驗(yàn)，并設(shè)置1個(gè)不含藥物的空白對(duì)照組。

取清腸24 h后的蚯蚓沖洗干凈，并用濾紙吸去表面水分。每個(gè)培養(yǎng)皿中放入10條蚯蚓，用保鮮薄膜封住，并用解剖針扎孔確保通氣。將培養(yǎng)皿置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在每個(gè)培養(yǎng)皿下鋪一層棉花，在染毒24和48 h各計(jì)數(shù)1次，觀察并記錄中毒癥狀和死亡數(shù)目，對(duì)其頭尾部機(jī)械刺激無(wú)反應(yīng)認(rèn)為死亡，48 h后結(jié)束試驗(yàn)[8-9]。

1.5.3 蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

分別用24、48 h后蚯蚓的存活樣品進(jìn)行蛋白測(cè)定，首先準(zhǔn)確稱取存活樣品的質(zhì)量，按質(zhì)量∶體積（mL）=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，然后冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液用生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿，混勻，靜置10 min，按試劑盒說(shuō)明方法用蒸餾水在595 nm處、1 cm光徑調(diào)零，取3支試管，分別添加0.05 mL蒸餾水（空自管）、0.05 mL 0.563 g/L標(biāo)準(zhǔn)液（標(biāo)準(zhǔn)管）、0.05 mL樣品（測(cè)定管），均加入然后依次測(cè)定各管吸光光度值（OD值），根據(jù)測(cè)定值計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，具體計(jì)算公式如下：

1.6 數(shù)據(jù)處理

在計(jì)算機(jī)中輸入染毒24和48 h蚯蚓的死亡數(shù)目和測(cè)定的蛋白質(zhì)含量，應(yīng)用簡(jiǎn)明統(tǒng)計(jì)10.35 （Concise Statistics，CS10.35）和Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 惡霉靈對(duì)蚯蚓毒理試驗(yàn)的結(jié)果

經(jīng)試驗(yàn)表明，蚯蚓與惡霉靈剛接觸就表現(xiàn)出中毒現(xiàn)象：蚯蚓翻滾身體并發(fā)生卷曲身體，對(duì)接觸敏感，部分爬到濾紙下面。24 h后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)蚯蚓活動(dòng)逐漸減弱，身體變?nèi)彳?，顏色變深，體液分泌量增加，有的抱成一團(tuán)，高濃度下的蚯蚓出現(xiàn)個(gè)別環(huán)節(jié)腫大，個(gè)別蚯蚓出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；48 h后觀察時(shí)，個(gè)別蚯蚓身體出現(xiàn)斷節(jié)，生殖環(huán)輕有滲血現(xiàn)象，并有黃色液體滲出（圖2），而且死亡率隨農(nóng)藥濃度的增大而升高。對(duì)照組蚯蚓正常，無(wú)中毒或死亡現(xiàn)象。

由表1可以看出，染毒24 h后在惡霉靈濃度為2.0～2.2 g/L，其對(duì)蚯蚓不產(chǎn)生致死效應(yīng)，濃度為2.3～2.6 g/L蚯蚓出現(xiàn)個(gè)別死亡；當(dāng)染毒48 h，惡霉靈對(duì)蚯蚓有明顯的致死效應(yīng)，且死亡率隨著農(nóng)藥濃度的增大而不斷增加，當(dāng)達(dá)到試驗(yàn)設(shè)計(jì)的最大濃度時(shí)，蚯蚓的死亡率達(dá)到76.7%。

對(duì)表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以惡霉靈的濃度為橫坐標(biāo)，蚯蚓染毒48 h的死亡率為縱坐標(biāo)（圖3）進(jìn)行擬合，得到回歸方程如下：

D=126.32X-260.07 （r2=0.931 4，n=7，P<0.05）（2）

式（2）中，D為蚯蚓死亡率（%），X為惡霉靈濃度（g/L），P為顯著性水平，r為相關(guān)系數(shù)，n為試驗(yàn)處理數(shù)。根據(jù)方程計(jì)算出惡霉靈的半致死濃度（LC50）為2.455 g/L。

2.2 惡霉靈對(duì)蚯蚓蛋白質(zhì)含量的影響

利用722分光光度計(jì)在595 nm下測(cè)出吸光值，根據(jù)蛋白質(zhì)計(jì)算公式計(jì)算出各濃度的樣本中蛋白質(zhì)的含量，如表2所示。用Microsoft Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所得結(jié)果均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，并用回歸方程檢驗(yàn)藥品濃度與蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性。

從圖4和圖5可以看出，處理24 h后，農(nóng)藥濃度為2.6 g/L時(shí)蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量最小，為0.205 9 g/L；其中最大值為0.318 7 g/L，所對(duì)應(yīng)的濃度為2.4 g/L，惡霉靈濃度由低到高對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)；處理48 h后，濃度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)含量最小值和最大值含量分別為0.191 2、0.288 3 g/L，其對(duì)應(yīng)的濃度分別為2.3、2.1 g/L，蛋白質(zhì)含量呈升高、降低、再升高的趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

3.1 惡霉靈對(duì)蚯蚓毒性的影響

采用濾紙分析法可以讓蚯蚓與農(nóng)藥直接接觸，成本低廉，操作簡(jiǎn)便，更直觀的體現(xiàn)農(nóng)藥對(duì)土壤動(dòng)物的毒性及危害[10]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用濾紙接觸法試驗(yàn)24、48 h時(shí)，根據(jù)回歸方程得出惡霉靈單一毒性試驗(yàn)蚯蚓的半致死濃度（LC50）為2.455 g/L，且對(duì)蚯蚓的毒害隨著濃度的增加而上升。

同時(shí)蚯蚓對(duì)惡霉靈有一定的耐受限度，當(dāng)農(nóng)藥濃度超過(guò)其耐受限度時(shí)，就會(huì)危害蚯蚓的健康和生存。惡霉靈對(duì)蚯蚓的作用機(jī)理是接觸和內(nèi)吸性多重作用，在試驗(yàn)中既可以通過(guò)接觸由皮膚滲入蚯蚓體內(nèi)使其對(duì)藥品進(jìn)行吸收，也可以通過(guò)食入途徑進(jìn)入到體內(nèi)產(chǎn)生胃毒作用。而惡霉靈還是一種含氮雜環(huán)類殺菌劑，使蚯蚓不能正常生存生長(zhǎng)甚至產(chǎn)生畸變，具體的影響還有待于進(jìn)一步探索研究。

3.2 惡霉靈對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響

用不同濃度惡霉靈對(duì)蚯蚓處理24、48 h后，根據(jù)其體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果，惡霉靈能使蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量增加，且不同濃度處理的結(jié)果有顯著差異（P<0.05）。而且在同一個(gè)濃度處理24、48 h后的蚯蚓的體內(nèi)蛋白質(zhì)含量也存在顯著差異（P<0.05）。在對(duì)蚯蚓染毒24 h時(shí)，蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量濃度呈現(xiàn)先升高再降低的變化，但總體蛋白質(zhì)含量均比對(duì)照組有所增加，在濃度為2.4 g/L時(shí)出現(xiàn)最大值。對(duì)于這種現(xiàn)象，有研究表明，當(dāng)生物體受到不利因素迫害時(shí)，機(jī)體內(nèi)多種功能受損，內(nèi)環(huán)境失衡，新陳代謝活動(dòng)出現(xiàn)異常，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)某些血漿蛋白含量改變，同時(shí)機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)產(chǎn)生一些急性應(yīng)急蛋白，從而使體內(nèi)蛋白質(zhì)含量有所升高[11-12]。隨著農(nóng)藥濃度的增大以及染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，可能因蚯蚓機(jī)體受到傷害的加重，機(jī)體多種功能高度受損，蛋白質(zhì)的合成來(lái)源遭到破壞，因而影響蛋白質(zhì)的合成[13]。在染毒48 h后，蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量濃度總體出現(xiàn)先升高后降低再升高的變化，在2.1 g/L時(shí)出現(xiàn)最大值。根據(jù)此變化曲線可看出，當(dāng)濃度大于2.3 g/L時(shí)，蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量又出現(xiàn)隨污染濃度的升高而增大的趨勢(shì)，可能是蚯蚓機(jī)體在受到高濃度和長(zhǎng)時(shí)間的污染后，自身功能受到損傷，內(nèi)環(huán)境紊亂，代謝活動(dòng)失調(diào)，同時(shí)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，使總蛋白質(zhì)含量隨濃度的升高而增大[14]。

蚯蚓機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量增大或下降，均表示機(jī)體內(nèi)系統(tǒng)功能紊亂。而生物體內(nèi)蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的變化往往是動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，將蚯蚓作為污染暴露的生物標(biāo)志物時(shí)還需要考慮多種其他因素的影響，惡霉靈對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)影響比較復(fù)雜，可以進(jìn)行土壤檢測(cè)，并采用其他生物標(biāo)志物進(jìn)行綜合分析[15]，這都需要在今后的工作中繼續(xù)研究和完善。

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