郝祥瑜 毛增輝 任華

摘要 [目的]研究幾何形態(tài)學(xué)方法在研究蝶類(lèi)昆蟲(chóng)種內(nèi)居群間分化的可行性和有效性。[方法]以冰清絹蝶為研究對(duì)象，對(duì)我國(guó)冰清絹蝶主要地理分布區(qū)的10個(gè)地理居群共200個(gè)體翅脈脈相的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行研究，利用三維數(shù)碼顯微鏡共測(cè)量、分析前后翅共計(jì)17種脈相的幾何形態(tài)學(xué)性狀（包括翅脈長(zhǎng)度、翅脈兩點(diǎn)間線段長(zhǎng)度、中室面積等），再利用SPSS 21.0軟件對(duì)篩選出的有效性狀進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和聚類(lèi)分析。[結(jié)果]冰清絹蝶10個(gè)地理居群的形態(tài)分化和它們的地理分布之間存在明顯的相關(guān)性；安徽滁州瑯琊山的居群在聚類(lèi)樹(shù)上的位置較為特殊，沒(méi)能顯示出與其地理分布間的明顯關(guān)聯(lián)性。[結(jié)論]幾何形態(tài)學(xué)分析方法在蝶類(lèi)的種內(nèi)分化研究中是一種十分有效的輔助手段。

關(guān)鍵詞 冰清絹蝶；地理居群；翅脈特征；幾何形態(tài)學(xué)；系統(tǒng)分類(lèi)

中圖分類(lèi)號(hào) Q964 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）34-0084-05

Abstract [Objective] The aim is to investigate the feasibility and validity of the method of geometric morphology in the study of the differentiation among populations of butterflies. [Method]With Parnassius glacialis as study object， related index of 200 individual venation in 10 geographic populations in major geographic regions were studied.Geometric morphological characters （including length of the venation，length of the line between two venation，area of the discal cell，etc.） of a total of 17 kinds of venation of forewings and hindwings were analyzed through threedimensional digital microscope，and then SPSS 21.0 software was used to carry out statistical analysis and cluster analysis on the selected effective characters. [Result] There was a significant correlation between morphological differentiation and geographical distribution of the 10 geographic populations of the Parnassius glacialis；since the location of the cluster in the clustering tree on Langya Mountain in Chuzhou Anhui was special，thus there was not a clear correlation between the geographical distribution. [Conclusion]Method of geometric morphology analysis is a very effective auxiliary means in the study of intraspecific differentiation of butterflies.

Key words Parnassius glacialis；Geographic population；Vein characteristics；Geometric morphology；Systematic classification

在傳統(tǒng)昆蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)中，昆蟲(chóng)的翅脈特征（脈相）是一個(gè)非常重要的分類(lèi)學(xué)指標(biāo)。翅脈特征不僅對(duì)昆蟲(chóng)的分類(lèi)鑒定有重要意義，還可以應(yīng)用于對(duì)昆蟲(chóng)的物種多樣性、系統(tǒng)發(fā)生發(fā)育及昆蟲(chóng)在不良環(huán)境條件下所發(fā)生的變異程度的研究[1]。

幾何形態(tài)學(xué)（Geometric morphometrics）是關(guān)于形態(tài)定量比較的科學(xué)計(jì)算工具，是用數(shù)學(xué)方法描述或分析一個(gè)圖像形狀結(jié)構(gòu)的方法。其研究方法多種多樣，但在技術(shù)路線上都需要先將形態(tài)數(shù)據(jù)數(shù)字化，再比對(duì)不同的樣本。通過(guò)比對(duì)可以計(jì)算出樣本之間的形狀和大小差距。這里的比對(duì)作用類(lèi)似分子系統(tǒng)學(xué)研究中分子序列比對(duì)，意在找到樣本之間的“同源信號(hào)”和“簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)”。通過(guò)比對(duì)篩選出有效生物學(xué)性狀，再用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法統(tǒng)計(jì)聚類(lèi)。在國(guó)外，幾何形態(tài)學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于探討生物的個(gè)體發(fā)育、種群分化、系統(tǒng)進(jìn)化等多個(gè)方面，研究對(duì)象以大動(dòng)物居多。在國(guó)內(nèi)，僅用于昆蟲(chóng)的分類(lèi)鑒定及遠(yuǎn)程自動(dòng)識(shí)別研究中。目前，國(guó)內(nèi)隨著計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)的不斷發(fā)展，以昆蟲(chóng)翅脈特征提取為核心技術(shù)的軟件也日趨完善，圖像數(shù)字化處理技術(shù)與傳統(tǒng)昆蟲(chóng)形態(tài)學(xué)結(jié)合已經(jīng)充分應(yīng)用到昆蟲(chóng)種間的分類(lèi)鑒定中[1-5]，但是運(yùn)用幾何形態(tài)學(xué)方法研究蝶類(lèi)昆蟲(chóng)種內(nèi)居群間分化國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。

絹蝶屬（Parnassius）是絹蝶亞科（Parnassidae）絹蝶族中的一個(gè)屬，物種繁多，廣泛分布于古北界及新北界溫帶的高山地區(qū)，從巴基斯坦到中亞和中國(guó)，部分物種擴(kuò)至到歐洲、日本及北美洲，因物種分布廣，各地理因素如山脈、海洋、河流等導(dǎo)致物種隔離，繼而演化出許多亞種[6]。我國(guó)絹蝶資源豐富，據(jù)周堯《中國(guó)蝶類(lèi)志》記載：全世界絹蝶有38種，僅我國(guó)就有35種124亞種。主要產(chǎn)于高山上，耐寒力強(qiáng)，僅少數(shù)種類(lèi)分布在低海拔，寄主植物是景天科及紫堇、延胡索等。冰清絹蝶（Parnassius glacialis Butler）是分布在低海拔地區(qū)的絹蝶，也是我國(guó)江南分布的唯一一種絹蝶，這可能是第四紀(jì)冰期的遺留物[7]，主要分布在河南、山東、陜西、湖北、安徽、浙江、江蘇、甘肅等地。寄主植物單一（寡食性），主食罌粟科紫堇屬（Corydalis edulis Maxim）的延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）和小藥八旦子（Corydalis caudata）[6，8-9]。其形態(tài)學(xué)特征：體黑色，披有黃色長(zhǎng)毛，頸部有1輪黃色毛叢。翅色白而稍呈蠟黃，翅質(zhì)薄而半透明，溫潤(rùn)如絲絹，翅脈灰黑褐色。前翅亞外緣有1條褐色帶紋。中室內(nèi)和中室端各有1個(gè)黑褐色斑紋；后翅內(nèi)緣的黑帶較寬，上披黃色長(zhǎng)毛（圖1）[7，10]。

生物地理學(xué)是生物學(xué)和地理學(xué)間的邊緣學(xué)科，主要研究生物在時(shí)間和空間上的分布，并嘗試分析和解釋物種的地理分布為何呈現(xiàn)如今所見(jiàn)的格局。該研究嘗試通過(guò)對(duì)不同地理居群冰清絹蝶翅脈特征的幾何形態(tài)學(xué)計(jì)量，推測(cè)冰清絹蝶現(xiàn)有分布格局的形成機(jī)制，旨為相關(guān)領(lǐng)域研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取冰清絹蝶10個(gè)地理居群的標(biāo)本（每一居群隨機(jī)抽樣20個(gè)體），涵括了冰清絹蝶的大部分分布區(qū)，具體的采樣點(diǎn)信息如表1所示。野外采集的蝶類(lèi)標(biāo)本立即投入無(wú)水乙醇中（無(wú)錫市展望化工試劑有限公司）保存，所取標(biāo)本均來(lái)源于安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子系統(tǒng)學(xué)與進(jìn)化研究室（-80 ℃）樣品庫(kù)內(nèi)。

1.2 標(biāo)本處理

取出浸泡在無(wú)水乙醇中的蝴蝶，用鑷子夾取蝴蝶翅膀的基部，使其完整地脫落，待乙醇揮發(fā)完全，在蝶翅下方置墊一小方塊白紙，便于與黑色翅脈形成反差；其上蓋上一載玻片，將蝶翅壓平，放入基恩士VHX-5000三維數(shù)碼顯微鏡（日本）中觀察測(cè)量（分辨率2400DPI）。

1.3 圖像獲取 利用基恩士VHX-5000三維數(shù)碼顯微鏡的圖像拼接技術(shù)對(duì)圖像進(jìn)行采集，形成一張完整的蝴蝶全翅圖片，在該數(shù)碼顯微鏡的測(cè)量工具中，利用鼠標(biāo)多點(diǎn)連線或兩點(diǎn)間連線描摹出翅脈的紋路并且勾勒出所需測(cè)量的翅脈長(zhǎng)度和面積，即可進(jìn)行測(cè)量。前翅共測(cè)得13組數(shù)據(jù)，后翅共測(cè)得4組數(shù)據(jù)（精度為1 μm或1 μm2），保存拍攝圖片以及測(cè)量結(jié)果生成擴(kuò)展名為.csv的文件，利用VHX Measurement Data Tabulation Tool軟件將數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Excel表格中。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在Excel表格中，整理和統(tǒng)計(jì)10個(gè)居群共200個(gè)絹蝶所測(cè)得的翅脈長(zhǎng)度和面積，并求出均值，對(duì)翅脈長(zhǎng)度、蝶翅中室面積、全翅面積等性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用SPSS 21.0軟件分別對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行初步系統(tǒng)聚類(lèi)，篩選出聚類(lèi)結(jié)果相同的一些性狀，舍棄部分不適合聚類(lèi)分析的性狀，最后對(duì)篩選出的性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 10個(gè)冰清絹蝶地理居群的翅脈形態(tài)學(xué)特征平均值

分別取10個(gè)地理居群各20個(gè)體冰清絹蝶，測(cè)量前翅11組長(zhǎng)度數(shù)據(jù)、2組面積數(shù)據(jù)；測(cè)量后翅2組長(zhǎng)度數(shù)據(jù)、2組面積數(shù)據(jù)（圖2）。求得前后翅翅脈形態(tài)學(xué)特征平均值（表2、表3），表2為前翅翅脈數(shù)據(jù)，表3為后翅翅脈數(shù)據(jù)。根據(jù)Excel文檔求出P值結(jié)果小于0.05，表示各特征值的不同均由不同居群的冰清絹蝶的形態(tài)差異引起。

從表2可以看出，南京、連云港、天堂寨、天目山的冰清絹蝶蝶翅面積較大，各翅脈長(zhǎng)度相對(duì)較長(zhǎng)。利用SPSS 21.0對(duì)前后翅共計(jì)17組數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，并一一比對(duì)，選出聚類(lèi)分析較為相似的數(shù)據(jù)共10組，即為有效性狀。

2.2 10個(gè)冰清絹蝶地理居群的聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

利用SPSS 21.0再將10組有效性狀（前翅分別為ab、R1、R5、M1、Cu2、2A、af、中室面積；后翅分別為ab、中室面積）進(jìn)行聚類(lèi)分析，繪制出樹(shù)狀圖，從樹(shù)狀圖得出結(jié)論：冰清絹蝶的演化劃分為兩支，共聚為兩大類(lèi)，一類(lèi)分為天堂寨、天目山、南京、連云港4個(gè)地理居群，另一類(lèi)分為泰山、嵩山、瑯琊山、天水、黃柏塬、神農(nóng)架6個(gè)地理居群。即天堂寨、天目山、南京、連云港這4個(gè)地理居群的冰清絹蝶親緣關(guān)系較近，而泰山、嵩山、瑯琊山、天水、黃柏塬、神農(nóng)架6個(gè)地理居群的冰清絹蝶親緣關(guān)系較近（圖3）。

2.3 冰清絹蝶演化路徑推測(cè)圖

根據(jù)聚類(lèi)樹(shù)狀圖繪制成冰清絹蝶演化路徑的推測(cè)圖（圖4）。地質(zhì)學(xué)資料顯示，大約6 000萬(wàn)年以前，印度板塊和亞歐板塊碰撞導(dǎo)致的造山運(yùn)動(dòng)逐漸形成了青藏高原，包括喜馬拉雅山脈[11]。同時(shí)，相關(guān)的分子系統(tǒng)學(xué)和分子鐘研究推測(cè)，距今2 000萬(wàn)～3 000萬(wàn)年前，絹蝶屬物種的祖先在我國(guó)西南地區(qū)（現(xiàn)今藏東南的橫斷山脈一帶）開(kāi)始形成[8]，其時(shí)，它們已產(chǎn)生了一些適應(yīng)高海拔環(huán)境的特性，如翅膀被毛、耐寒冷、耐低氧等等，隨著絹蝶屬的分化和物種之間的競(jìng)爭(zhēng)，以及中新世以后，特別是第四紀(jì)期間全球氣候變化的影響，冰清絹蝶開(kāi)始向華中、華北、華東地區(qū)遷移，形成2支演化路徑：第一支由喜馬拉雅山脈經(jīng)過(guò)唐古拉山、巴顏喀拉山，到達(dá)位于秦嶺的天水、黃柏塬一帶，再分為三小支，途經(jīng)華北平原分別向泰山、嵩山、瑯琊山3個(gè)方向遷移；第二支由喜馬拉雅山脈發(fā)源，向東遷移經(jīng)過(guò)秦嶺、四川盆地到達(dá)天堂寨、南京、天目山等地，最后沿海岸線擴(kuò)散至連云港一帶。成為我國(guó)唯一一種分布到長(zhǎng)江以南，生活在較低海拔地區(qū)的絹蝶，且對(duì)生活環(huán)境的要求極為苛刻[7，12-13]。

3 結(jié)論與討論

安徽天堂寨位于大別山區(qū)，是南北水系的分水嶺，屬大別山系，地質(zhì)基礎(chǔ)為前震旦紀(jì)的秦嶺褶皺帶，后期受燕山期造山運(yùn)動(dòng)的顯著影響；浙江天目山和江蘇南京紫金山總體上屬于寧鎮(zhèn)山脈，是侏羅紀(jì)末至白堊紀(jì)初期，通過(guò)寧鎮(zhèn)山脈造山運(yùn)動(dòng)形成的一條向北突出的弧形皺；江蘇連云港云臺(tái)山的地質(zhì)基礎(chǔ)則屬于華北古陸構(gòu)架。這些古地質(zhì)事件形成的山脈后來(lái)都經(jīng)過(guò)頻繁的地質(zhì)變化過(guò)程，最終形成了現(xiàn)在的地質(zhì)地貌。

甘肅天水屬小隴山系，為秦嶺的西北緣；陜西黃柏塬地為秦嶺腹地；湖北神農(nóng)架屬大巴山系，河南嵩山屬伏牛山系，它們都是秦嶺造山帶的余脈；山東泰山構(gòu)造基礎(chǔ)為古華北地帶，后來(lái)經(jīng)漫長(zhǎng)而又復(fù)雜的演化過(guò)程才形成今天的地貌；安徽瑯琊山為江淮之間的低山丘陵地帶，系大別山系向東延伸而成的余脈。

總體而言，上述地質(zhì)過(guò)程，包括較晚近的燕山運(yùn)動(dòng)時(shí)期（在地史上主要屬于侏羅紀(jì)末到古近紀(jì)初這段時(shí)期，距今2億1千萬(wàn)年左右開(kāi)始至6 500萬(wàn)年前為止）相對(duì)于絹蝶種群的分化時(shí)期而言（據(jù)分子鐘推測(cè)為350萬(wàn)前至30萬(wàn)年前），是一個(gè)十分古老的時(shí)期，因而，這些地質(zhì)因素對(duì)冰清絹蝶的擴(kuò)散無(wú)關(guān)。

綜合多方面證據(jù)分析，筆者推測(cè)，冰清絹蝶不同居群間的擴(kuò)散路徑與其地理分布（相關(guān)山脈分布、走向及地理隔離等）之間有明顯的相關(guān)性，即地質(zhì)歷史上，第四紀(jì)開(kāi)始至今的地質(zhì)、生物環(huán)境和氣候變化因素對(duì)冰清絹蝶的擴(kuò)散路徑和現(xiàn)代地理分布產(chǎn)生了重要影響[8，11]。譬如，第一進(jìn)化支（天堂寨、天目山、南京、連云港4個(gè)地理居群）各居群的生態(tài)環(huán)境極為相似，均位于華北平原與長(zhǎng)江中下游平原地帶，海拔較低，降水豐富，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候與溫帶季風(fēng)氣候交界處；而第二進(jìn)化支（黃柏塬、神農(nóng)架、天水、嵩山、泰山5個(gè)地理居群）的生態(tài)環(huán)境類(lèi)似，海拔相對(duì)較高，氣溫也相對(duì)較低，地處內(nèi)陸，降水相對(duì)較少。至于安徽瑯琊山的居群，單從地理因素考慮，理論上應(yīng)屬于第一進(jìn)化支，從而支持安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子系統(tǒng)學(xué)與進(jìn)化研究室利用分子手段分析的結(jié)果。但從形態(tài)上看，瑯琊山居群確實(shí)很特殊（如后翅基部較大范圍明顯的黑色斑塊，體毛為灰白色），且和嵩山或泰山等高緯度地區(qū)的居群極為相似。推測(cè)這有可能受其寄主植物及采蝶時(shí)（2013年4月29日）當(dāng)年的氣候影響，因?yàn)椴煌瑲夂颍ㄈ珀幱?、干旱、季?jié)變化等）、寄主植物均影響蝶類(lèi)個(gè)體發(fā)生和發(fā)育[12，14-17]。

研究冰清絹蝶寄主植物和氣象的相關(guān)資料，結(jié)果表明，延胡索是瑯琊山冰清絹蝶的唯一寄主植物，且大都分布在瑯琊山寺附近高海拔地區(qū)（海拔200～300 m），蝶類(lèi)對(duì)寄主植物專(zhuān)一性較強(qiáng)，雖然它們有一定的遷飛能力，但其分布仍然以寄主為中心[12-13，18-19]。據(jù)文獻(xiàn)記載，延胡索瑯琊山居群的6種主要異喹啉生物堿含量在河南、安徽、浙江、江蘇、江西等12個(gè)居群中大都高于其他居群，尤其是紫堇堿含量最高（0.44%），比含量最低的江西宜興大灘嶺居群（0.024%）高達(dá)近20倍，又因延胡索對(duì)環(huán)境要求很?chē)?yán)，對(duì)于低洼易積水及水分較少的干旱地段均不適合延胡索的生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)期僅有3個(gè)月，一般分布在海拔200～800 m的丘陵山區(qū)的半陰坡，系早春植物[20]；同時(shí)，安徽滁州氣象站提供氣象資料和中央氣象局?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)顯示，瑯琊山地區(qū)2013年3、4月降水量均為18.4 mm，與近30年同期均值相比，偏少7成；日照均為240 h，與常年相比偏多4成，整體氣候近為春旱，冰清絹蝶與其寄主植物休戚相關(guān)。所以，瑯琊山居群獨(dú)特的翅脈形態(tài)特征可能與其寄主植物和當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件等都有密切關(guān)系。

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