陳利娜 薛輝 李好先

摘要[目的]摸索適合石榴花芽及胚珠結(jié)構(gòu)觀察的石蠟切片方法。[方法]以“突尼斯軟籽”石榴花芽及胚珠為試材，在傳統(tǒng)石蠟切片方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合石榴花芽鱗片厚、子房多室的特點(diǎn)，對(duì)樣品處理、軟化、透明、浸蠟、染色等重要制片環(huán)節(jié)進(jìn)行研究。[結(jié)果]不同樣品處理方式對(duì)比發(fā)現(xiàn)，將子房縱切4瓣進(jìn)行固定，切片效果較好。軟化結(jié)果表明，紗布包裹花芽浸入水中加熱至沸騰30 min，有助于提高制片效果。不同染色方式對(duì)比發(fā)現(xiàn)，愛(ài)氏蘇木精染色法更適合石榴胚珠切片觀察。[結(jié)論]通過(guò)優(yōu)化常規(guī)石蠟切片方法，得到了適合石榴花芽及胚珠結(jié)構(gòu)觀察的石蠟切片方法，該方法同樣適用于與石榴花芽及胚珠結(jié)構(gòu)類(lèi)似的其他結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞 石榴；花芽；胚珠；石蠟切片

中圖分類(lèi)號(hào) S665.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）02-0001-03

Abstract[Objective] To grope the suitable paraffin section method for pomegranate floral bud and ovule.[Method] The floral buds and ovules of Tunisiruanzi were used as experimental materials for paraffin sectioning to improve sample treatment.Given the character of pomegranate floral with thick bud scales and ovary of multicellular， the process of softening， clearing， waxing and staining were improved.[Result] To confirm the optimal fixation methods for different parts of ovary， we compared the different fixation methods and found that the best method is fixing after cutting the ovary into four parts using F.A.A..Softening results showed that if the floral bud was boiled for 30 minutes without stripping scales， the tissues would be complete.Paraffin section staining was performed with Ehrlich hematoxylin， which was the best material for staining for pomegranate floral bud and ovule.[Conclusion] A modified method of paraffin sectioning for pomegranate floral bud and ovule was recommended on the bases of the traditional method.

Key words Pomegranate；Floral bud；Ovule；Paraffin section

石榴（Punica granatum L.），為石榴科石榴屬果樹(shù)，在我國(guó)廣泛栽培，且栽培歷史悠久。石榴用途廣泛、形態(tài)美觀。石榴加工產(chǎn)品對(duì)癌癥、冠狀動(dòng)脈心臟疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、高膽固醇血癥、高脂血癥、高血壓、傳染性疾病等具有顯著療效[1]。石榴花期長(zhǎng)、花量大，但成花過(guò)程中發(fā)生嚴(yán)重的雌蕊敗育，形成大量敗育花，敗育花的比率與坐果率呈負(fù)相關(guān)，是落花落果、坐果率低的主要原因[2]。Wetzstein等[3]對(duì)石榴2種不同類(lèi)型花形態(tài)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)石榴敗育花的形成與其胚珠發(fā)育息息相關(guān)。因此，對(duì)石榴花芽及胚珠胚胎學(xué)進(jìn)行研究尤為重要。

石蠟切片是胚胎學(xué)研究中常用的一種技術(shù)，作為一種輔助研究技術(shù)，廣泛應(yīng)用于植物花芽分化等研究[4-12]。

石蠟切片雖應(yīng)用廣泛，但傳統(tǒng)制片方法并不完全適用于具有不同組織結(jié)構(gòu)的植物或同一植物上不同部位。因此，需要根據(jù)植物的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)摸索適合的制片方法。石榴花芽鱗片厚且硬，每個(gè)石榴包含2 000多個(gè)胚珠，且其著生方位不一[13]，使得制片過(guò)程中切片和染色存在問(wèn)題，利用傳統(tǒng)石蠟切片制片效果不夠理想。鑒于此，筆者以石榴花芽及胚珠為試驗(yàn)材料，在傳統(tǒng)石蠟切片方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合石榴花芽鱗片厚及子房多室的特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)固定、軟化、透明、浸蠟、染色環(huán)節(jié)進(jìn)行研究，探索了適合石榴花芽及胚珠石蠟切片制片的方法，以期為進(jìn)一步從胚胎學(xué)角度研究石榴胚珠發(fā)育微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為9年生“突尼斯軟籽”石榴，以株距2 m、行距3 m栽植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所干果資源圃。選擇新鮮完整的花芽、花蕾子房采樣，于FAA固定液（90 mL 70%乙醇+5 mL冰醋酸+5 mL福爾馬林）中固定 24 h以上。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)石蠟切片法。

按照陳延惠等[14]的方法，將固定好的石榴花芽經(jīng)30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100%乙醇逐級(jí)脫水，每級(jí)停留30 min；脫水處理后的材料從無(wú)水乙醇轉(zhuǎn)入二甲苯-無(wú)水乙醇混合液（1∶1，V/V）中停留30 min，再轉(zhuǎn)入二甲苯中2次，每次停留30 min，進(jìn)行透明處理；將石蠟與二甲苯分別按1∶2、1∶1、2∶1比例配成混合液，將透明后的材料依次放入各混合液中浸蠟30 min，再于純石蠟中浸蠟3次，每次停留20 min；將硬而光滑的牛皮紙折疊成紙盒，置于1塊玻片上，將融化的熔點(diǎn)56～58 ℃的石蠟倒入紙盒中，先將浸蠟后的材料倒入其中，然后用燒熱的鑷子將材料排列整齊；切片厚度調(diào)為8～12 μm后進(jìn)行切片，40 ℃恒溫板上展片，35 ℃恒溫箱中烘片2 d；二甲苯脫蠟20 min，隨后轉(zhuǎn)入二甲苯-無(wú)水乙醇混合液（1∶1，V/V）、無(wú)水乙醇、95%乙醇中各停留5 min；苯胺固綠染色40～50 s，95%、100%乙醇沖洗，然后轉(zhuǎn)入二甲苯-無(wú)水乙醇混合液（1∶1，V/V）中停留1～2 min，最后二甲苯透明10 min。

1.2.2 改良后的石蠟制片法。

整體試驗(yàn)流程與常規(guī)石蠟切片制片流程相似，包括固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片展片、染色、顯微鏡觀察。但改良后的石蠟切片不對(duì)花芽鱗片進(jìn)行剝除處理，而是對(duì)其進(jìn)行軟化處理，固定胚珠時(shí)將子房按照不同的切法進(jìn)行固定，同時(shí)對(duì)透明、浸蠟、染色過(guò)程進(jìn)行改良。

1.2.2.1

樣品處理。石榴花蕾體積大，若將整個(gè)花蕾放入固定液無(wú)法完全固定其胚珠，采用以下3種方式固定石榴子房：①將子房縱切成4瓣進(jìn)行固定；②沿石榴子房上、下兩心皮接合處橫切后下半部直接固定，上半部縱切3瓣進(jìn)行固定；③直接將子房投入固定液中進(jìn)行固定。

1.2.2.2

軟化?；ㄑ抗潭ㄇ安贿M(jìn)行鱗片剝除，參考帥煥麗等[15]對(duì)杏花芽石蠟制片方法的改良，對(duì)按照方式②固定后的花芽進(jìn)行軟化處理，同時(shí)以不作任何處理為對(duì)照，軟化處理方式為將花芽用紗布包裹起來(lái)浸入水中，加熱至沸騰后保持30 min。

1.2.2.3

透明。脫水處理后的材料從無(wú)水乙醇轉(zhuǎn)入二甲苯-無(wú)水乙醇混合液（1∶1，V/V）中停留1 h，再轉(zhuǎn)入二甲苯中2次，每次停留1 h。

1.2.2.4

浸蠟。將材料從二甲苯中取出，放入石蠟-二甲苯混合液（1∶2，V/V）中停留2 h、石蠟-二甲苯混合液（1∶1，V/V）中過(guò)夜（40 ℃恒溫箱中操作），轉(zhuǎn)入56～60 ℃恒溫箱的石蠟-二甲苯混合液（2∶1，V/V）中停留2 h，純石蠟3次，每次停留2 h。

1.2.2.5

染色。對(duì)固定軟化后的材料分別進(jìn)行番紅-固綠二重染色及愛(ài)氏蘇木精染色，對(duì)比2種染色方式差異，對(duì)染色方法進(jìn)行改良。

（1）番紅-固綠二重染色。參照吳影[16]烏桕花發(fā)育形態(tài)觀察中染色方法，將軟化后的材料番紅染色3 d，脫水（與常規(guī)方法相同），透明與浸蠟按改良后的方法進(jìn)行；包埋、切片、烘片；將烘干的切片放入二甲苯以脫去切片上的石蠟。脫蠟結(jié)束后進(jìn)行番紅-固綠二重染色，具體步驟：二甲苯2次，每次停留20 min→二甲苯-無(wú)水乙醇混合液（1∶1，V/V）20 min→無(wú)水乙醇 2 min→95%乙醇2 min→85%乙醇2 min→固綠染液（無(wú)水乙醇配制）30 s→95%乙醇2 min→無(wú)水乙醇2 min→二甲苯-無(wú)水乙醇混合液（1∶1，V/V）2 min→二甲苯2次，每次停留2 min。

（2）愛(ài)氏蘇木精染色。參照崔娟[17]甜櫻桃花芽形態(tài)觀察染色技術(shù)，軟化后的材料脫水（與常規(guī)方法相同），透明與浸蠟按改良后的方法進(jìn)行；包埋、切片、烘片；將烘干后的切片放入二甲苯以脫去切片上的石蠟。脫蠟結(jié)束后進(jìn)行蘇木精染色，具體步驟：二甲苯20 min→二甲苯-無(wú)水乙醇混合液（1∶1，V/V）5 min→無(wú)水乙醇5 min→95%乙醇5 min→85%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min→50%乙醇5 min→30%乙醇5 min→蘇木精染色，通風(fēng)櫥中通風(fēng)20～30 min→蒸餾水沖洗1 min→30%乙醇 5 min→50%乙醇5 min→70%乙醇 5 min→80%乙醇 5 min→85%乙醇5 min→95%乙醇 5 min→無(wú)水乙醇5 min→二甲苯-無(wú)水乙醇混合液（1∶1，V/V）5 min→二甲苯20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固定方式及軟化對(duì)浸蠟和切片的影響

圖1-A、B樣品按照方式①、②處理固定后，用改良的方法進(jìn)行切片，材料浸蠟徹底，與蠟片貼合較好，胚珠結(jié)構(gòu)完整，縱切效果較好，但是方式②操作復(fù)雜，且仍存在部分破損現(xiàn)象；圖1-C按照方式③進(jìn)行處理后，用改良的石蠟切片方法

進(jìn)行切片，按照方式③進(jìn)行處理的切片效果不佳。該樣品處理方式下浸蠟不夠徹底，切片時(shí)組織周?chē)嬖诹押郏M織與蠟片分離，同時(shí)胚珠一部分被縱切一部分被橫切，部分胚珠破損。將花芽用紗布包裹煮沸30 min進(jìn)行軟化處理比直接固定結(jié)果表現(xiàn)良好，結(jié)果見(jiàn)圖1-D、E。這種軟化方式在一定程度上減輕了因?yàn)槭窕ㄑ亏[片厚固定不透造成的組織破損的現(xiàn)象。

2.2 不同染色方式對(duì)制片效果的影響

2.2.1 番紅-固綠二重染色效果。

番紅-固綠二重染色（圖2-A）中番紅染色采用整染的方式，即將花芽提前浸泡于番紅中染色72 h，然后進(jìn)行脫水、包埋、切片等一系列過(guò)程。采用番紅整染方式可使細(xì)胞核染色充分，細(xì)胞核清晰，但石榴花芽整體染色效果不佳，染色后細(xì)胞輪廓不夠明顯（圖2-B）。同時(shí)，番紅-固綠二重染色耗時(shí)73 h，較愛(ài)氏蘇木精染色耗時(shí)長(zhǎng)。

2.2.2 愛(ài)氏蘇木精染色效果。

愛(ài)氏蘇木精染色（圖2-C）不需要提前將組織整染，只需直接脫水、切片、染色，能很大程度上縮短染色時(shí)間，同時(shí)組織染色均勻，圖片清晰。染色后細(xì)胞輪廓清晰（圖2-D），但細(xì)胞核染色不如番紅-固綠二重染色明顯。但是在蒸餾水沖洗返藍(lán)過(guò)程中易導(dǎo)致沖水過(guò)量組織脫落，結(jié)構(gòu)破損或顏色變淡的情況。因此，愛(ài)氏蘇木精染色方法適合石榴花芽及胚珠切片染色，但應(yīng)注意染色過(guò)程中不要過(guò)度水沖洗，應(yīng)嚴(yán)格把握染色時(shí)間。

圖2-D樣品按照表 1中改良后石蠟切片方法得到的圖片，制片效果良好。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，利用改良后的石蠟切片方法觀察石榴花芽及胚珠組織結(jié)構(gòu)完整，染色效果良好，該方法同樣適用于與石榴花芽及胚珠結(jié)構(gòu)相似的其他材料。

石榴花芽外面包裹多層角質(zhì)化的鱗片，如果不采取任何處理很難得到理想的切片效果。傳統(tǒng)石蠟切片是剝除鱗片的辦法，但石榴花芽小[18]，特別是未分化期，鱗片結(jié)合緊密。因此，剝除鱗片操作繁瑣，且易破壞花芽組織結(jié)構(gòu)，改良后的制片方法增加軟化步驟，能夠避免剝除鱗片的復(fù)雜過(guò)程，同時(shí)能夠改良其浸蠟效果。該研究表明，軟化后的材料在不剝除鱗片的同時(shí)使得石蠟更容易浸入組織內(nèi)部，從而獲得良好的制片效果。

另一方面，石榴萼片厚，花蕾大，子房多室，每個(gè)石榴花子房包含2 000多個(gè)胚珠，若將石榴整個(gè)子房固定于固定液中不能很好地固定胚珠，同時(shí)浸蠟效果也不佳。選擇合適的切塊固定及切片方位是石榴胚珠制片成功的關(guān)鍵因素。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)：采用縱切成4瓣進(jìn)行固定或沿石榴上、下兩心皮接合處橫切后下半部直接固定，上半部縱切3瓣進(jìn)行固定能獲得良好的胚珠縱切圖片，但按照后者方式操作復(fù)雜且操作過(guò)程中易破損胚珠結(jié)構(gòu)。

傳統(tǒng)石榴花芽制片方法采用苯胺番紅整染后固綠復(fù)染[19]，苯胺具有高毒性，該研究采用改良后的石蠟切片方法，避免使用苯胺，同時(shí)改良染色效果，縮短染色時(shí)間。對(duì)比番紅-固綠二重染色及愛(ài)氏蘇木精2種染色方法發(fā)現(xiàn)，愛(ài)氏蘇木精染色更適合石榴花芽染色，但一方面需注意溶液配制的注意事項(xiàng)[20]，另一方面要注意染色過(guò)程中水沖洗的程度及操作時(shí)間的把握。

制片結(jié)果中經(jīng)常出現(xiàn)組織圖片中帶有黑色斑點(diǎn)現(xiàn)象，有可能是載玻片或蓋玻片上帶有灰塵造成的。為避免灰塵影響制片效果，

應(yīng)注意清洗蓋玻片和載玻片。載玻片清洗：1%～2%鹽酸酒精（95%乙醇配制）浸泡6～12 h，0.1%～0.2%氨酒精（80%乙醇配制）浸泡1 h；蓋玻片利用95%乙醇清洗12～24 h。

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