陳志春 王英豪 張理平 蘭明金

摘要：目的 解析祛斑中藥組方干預黑素合成的主效應中藥。方法 采用3×2析因設計，以山楂、當歸、山萸肉為考察因素，各設2水平，分別測定酪氨酸酶活性抑制率、多巴色素自動氧化生成黑素量、多巴自動氧化抑制率，并運用SPSS16.0軟件輔助解析祛斑組方對干預黑素合成不同途徑的主效應中藥。結(jié)果 組方中山萸肉對酪氨酸酶活性具有顯著抑制作用（P<0.05），山萸肉、當歸對多巴色素自動氧化生成的黑素量具有極顯著抑制作用（P<0.01），山萸肉、當歸對多巴自動氧化具有顯著抑制作用（P<0.05），山萸肉在組方中貢獻最大。結(jié)論 山萸肉為組方中抑制酪氨酸酶活性、多巴色素自動氧化生成黑素量、多巴自動氧化的主效應中藥。

關鍵詞：析因設計；酪氨酸酶；黑色素；祛斑中藥復方；效應中藥

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.020

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）07-0086-04

Abstract： Objective To investigate the major effective Chinese materia medica in Quban Prescription for intervention in melanin synthesis. Methods 3×2 factorial design was used. The factors of investigation were Crataegi Fructus， Angelicae Sinensis Radix and Corni Fructus. Tyrosinase activity， melanin generation and auto-oxidation of dopa were determinated respectively； and the major effective Chinese materia medica of Quban Prescription for intervention in melanin synthesis was analyzed by SPSS16.0 software. Results Tyrosinase activity was remarkably inhibited by Corni Fructus （P<0.05）. Melanin generation was remarkably inhibited by Corni Fructus and Angelicae Sinensis Radix （P<0.01）. Auto-oxidation of dopa was remarkably inhibited by Corni Fructus and Angelicae Sinensis Radix （P<0.05）. Corni Fructus was in an absolute leading position. Conclusion Corni Fructus is the major effective Chinese materia medica in inhibiting tyrosinase activity， melanin generation and auto-oxidation of dopa in the prescription.

Key words： factorial design； tyrosinase； melanin； Quban Prescription； effective Chinese materia medica

中藥復方多途徑、多環(huán)節(jié)作用是其綜合治療復雜性疾病的特色和優(yōu)勢所在，如何剖析復方中不同作用途徑或環(huán)節(jié)的主要中藥或主要物質(zhì)基礎，揭示中藥復方藥效與其物質(zhì)基礎的相關性，是目前復方研究的關鍵科學問題之一。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，祛斑中藥組方（山楂、當歸、山萸肉等中藥組成）治療色素增多性皮膚病的療效確切，作用呈現(xiàn)出多途徑、多靶點的特點[1-4]。為此，本研究進一步運用數(shù)學模型“析因設計法”[5]，進行祛斑中藥組方的析因設計，以酪氨酸酶活性、多巴色素自動氧化生成黑素量、多

巴自動氧化反應為切入點，深入剖析不同作用環(huán)節(jié)的主效應中藥，為進一步開發(fā)利用祛斑中藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

紫外-可見分光光度計（UV-9100，北京瑞利分析儀器公司），電子分析天平（FA20004N，上海精密科學儀器有限公司），數(shù)顯水浴鍋（HH.S，上海錦屏儀表有限公司），離心機（Anke TDL80-2B，廠家上海安亭科學儀器廠），微量移液器（PIPETTOR，WKY型，100～500 ?L，上海求精生化試劑儀器有限公司），超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）。

山楂（批號20140505）、當歸（批號20141118）、山萸肉（批號20141023）購于福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定，分別為薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實、傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根、山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。酪氨酸酶（SIGMA，CAS9002-10-2，EC232-653-4，USA，MSDS）；左旋多巴（L-Dopa，西安潤澤生物技術有限公司，批號060108）；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、乙醇等試劑均為分析純。

2 方法

2.1 析因試驗設計

參考前期研究結(jié)果[1-4]，本試驗選用3×2析因設計表，以山楂、當歸、山萸肉為考察因素，每個因素設2個水平，進行組方設計（見表1），得到析因設計試驗方案（見表2），其中1行為1種組方，按表中各行數(shù)值取相應藥味混合即得，共8組。

2.2 組方制備

將組方（山楂、當歸、山萸肉等）飲片分別粉碎成粗粉（40目），分別稱取適量粉末于具塞三角瓶中，加入適量乙醇，混勻，浸泡0.5 h，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）1 h，提取2次，分別過濾，減壓回收乙醇，制得濃度為250 g/L的藥液，備用。

2.3 酪氨酸酶活性測定

參考文獻[6]方法，采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測酪氨酸酶活性，反應混合物與體積見表3，計算酪氨酸酶抑制率。酪氨酸酶抑制率（%）=

[（A475a-A475b）-（A475c-A475d）]/（A475a-A475b）×100%。式中，a為未加中藥的加酶混合液，b為未加中藥和酶的混合液，c為加中藥和酶的混合液，d為加中藥而未加酶的混合液。

2.4 多巴色素自動氧化生成黑素量測定

將酪氨酸酶試液（135 U/mL）0.5 mL在25 ℃溫育10 min，加入多巴溶液（0.03%）0.5 mL，一起溫育5 min，然后分別加入PBS溶解的受試物0.5 mL（500、200、50 μg/mL）并溫育60 min，加入1 mol/L鹽酸2 mL終止反應，將該混合物于3000 r/min離心15 min，沉淀物分別用6 mol/L鹽酸1 mL洗1次、雙蒸水洗2次，然后用1 mol/L NaOH溶液2 mL充分溶解離心團塊，用分光光度計在400 nm處測定吸光度（OD值）。以黑素量為橫坐標，OD值為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=5.1X+0.47（r=0.999 9）。結(jié)果表明黑素量在0～160 μg/mL范圍內(nèi)OD值與黑素量呈良好的線性關系。通過黑素標準曲線計算各組方黑素生成量。

2.5 多巴自動氧化反應測定

將3 mL多巴溶液（0.03%）和3 mL PBS稀釋過的受試物（50、10、2 mg/mL）混合，在空氣中（25 ℃）暴露4 d，然后用分光光度計在475 nm處測定OD值，以PBS代替受試物作為空白對照，計算各組方對多巴自動氧化反應的抑制作用。

2.6 解析組方中主效應中藥

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，指標測定結(jié)果以—x±s表示，析因分析采用F檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，分別解析祛斑中藥中抑制酪氨酸酶活性、多巴色素自動氧化生成黑素量、抗多巴自動氧化反應的主效應、交互效應、單獨效應。

3 結(jié)果

3.1 各組方對黑素合成的影響

各組方干預黑素合成各指標測定結(jié)果見表4。

3.2 酪氨酸酶活性抑制率析因分析

各組方酪氨酸酶活性抑制率析因分析結(jié)果顯示，A、B、C因素兩兩交互效應中2條直線均相互平行，說明因素間不存在交互作用，即組方對酪氨酸酶的抑制不存在交互效應，故只需考慮各因素的主效應作用。由F檢驗結(jié)果（見表5）可知，F(xiàn)C>FB>FA，其中C因素有統(tǒng)計學意義（P<0.05），B、C因素無統(tǒng)計學意義（P>0.05）?？梢?，C因素（山萸肉）的貢獻遠大于A因素（山楂）、B因素（當歸），處于絕對主導地位，尤以山萸肉水平2對酪氨酸酶活性具有顯著抑制作用，是復方中酪氨酸酶活性抑制的主效應中藥。

3.3 多巴色素自動氧化生成黑素含量析因分析

多巴色素自動氧化生成黑素含量析因分析結(jié)果顯示，A、B、C因素兩兩交互效應中2條直線均相互平行，說明因素間不存在交互作用，即組方抑制多巴色素自動氧化生成黑素量不存在交互效應，故只需考慮各因素的主效應作用。由F檢驗結(jié)果（見表6）可知，F(xiàn)B>FC>FA，其中B、C因素有統(tǒng)計學意義（P<0.05），A因素無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。B因素（當歸）、C因素（山萸肉）的貢獻遠大于A因素（山楂），處于絕對主導地位，其中當歸水平1、山萸肉水平2對多巴色素自動氧化生成黑素量的抑制明顯，是復方中抑制多巴色素自動氧化生成黑素量的主效應中藥。

3.4 抗多巴自動氧化反應析因分析

多巴自動氧化反應抑制試驗析因分析結(jié)果顯示，A、B、C因素兩兩交互效應中AC因素、BC因素2條直線相互不平行，說明兩因素可能存在交互作用，即組方對多巴自動氧化的抑制存在交互效應，故需考慮交互作用。由F檢驗結(jié)果（見表7）可知，F(xiàn)B>FC>FA×C>FA>FB×C，其中B、C因素有統(tǒng)計學意義（P<0.05），A、A×C、B×C因素無統(tǒng)計學意義（P>0.05）?？梢?，C因素與A、B因素存在交互作用，但無顯著影響，故主要分析主效應中藥。C因素（山萸肉）、B因素（當歸）的貢獻遠大于A因素（山楂），處于絕對主導地位，尤以當歸水平2、山萸肉水平1對多巴自動氧化具有顯著抑制作用，是復方中抗多巴自動氧化反應的主效應中藥。

4 討論

色素增多性皮膚病臨床最常見的有黃褐斑、老年斑、雀斑等，屬中醫(yī)學“黧黑斑”“面塵”“面黑皯”等范疇。目前中西醫(yī)尚無具有確切療效的良藥。“氣血失和，不能榮于面部皮膚而生色斑”（《本草綱目》），臨床選藥當辨證論治。祛斑中藥組方是本課題組治療色素增多性皮膚病的常用驗方，方中當歸、山楂、山萸肉等滋補肝腎、養(yǎng)血活血，臨床治療黃褐斑療效確切，前期研究亦證實山楂、當歸、山萸肉等藥（“斑白”搽劑主成分）高、中、低3個不同濃度對酪氨酸酶活性均有很強的抑制作用[1-3]。因而，本研究根據(jù)中醫(yī)理論及前期研究結(jié)果，繼續(xù)采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測酪氨酸酶活性，并運用數(shù)學模型“析因設計法”剖析方中具有抑制酪氨酸酶活性的主效應中藥，結(jié)果表明各藥的酪氨酸酶活性抑制率依次為F山萸肉>F當歸>F山楂，山萸肉的貢獻處于絕對主導地位，對酪氨酸酶活性具有顯著抑制作用（P<0.05），是方中酪氨酸酶活性抑制的主效應中藥。

祛斑中藥組方臨床治療色素增多性皮膚病的優(yōu)勢為其作用的多途徑、多環(huán)節(jié)，不能單靠酪氨酸酶活性抑制模型來篩選脫色劑，還應根據(jù)色素生成的許多環(huán)節(jié)進行綜合評價[7-8]。黑素生成過程是一個較為復雜的過程，該過程除與酪氨酸酶相關外，還與多巴色素自動氧化、多巴自動氧化等因素密切相關。因此，本研究進行了多巴色素自動氧化生成黑素、多巴自動氧化試驗的研究，以深入剖析祛斑中藥干預黑素合成的主效應中藥。結(jié)果顯示，各藥對多巴色素自動氧化生成黑素的抑制作用依次為F當歸>F山萸肉>F山楂，當歸、山萸肉的貢獻處于絕對主導地位，對多巴色素自動氧化生成黑素具有明顯抑制作用（P<0.01），是方中抑制多巴色素自動氧化生成黑素的主效應中藥；各藥對多巴自動氧化反應的抑制依次為F當歸>F山萸肉>F山楂×山萸肉>F山楂>F當歸×山萸肉，當歸、山萸肉的貢獻處于絕對主導地位，對多巴自動氧化的抑制明顯（P<0.05），是方中抑制多巴自動氧化的主效應中藥。

中藥復方的效果是多靶點、多途徑、多系統(tǒng)藥理效應的綜合表現(xiàn)。本研究在前期實驗基礎上采用析因設計與藥效相結(jié)合的方法，進一步明確了祛斑中藥在治療色素增多性皮膚病方面的主效應中藥或組合，研究結(jié)果從某種程度上印證了這一理論。正是由于中藥復方具有多靶點、多途徑、多系統(tǒng)的作用特點，必然存在不同作用途徑的主要中藥，圍繞這一思路，采用析因設計法逐步明晰中藥復方綜合作用的物質(zhì)基礎，對于中藥復方配伍的現(xiàn)代詮釋具有重要意義。

參考文獻：

[1] 張理平，張海燕，李孝棟，等.28味中藥酸性成分提取物影響黑素合成的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（11）：1443-1445.

[2] 陳志春，王英豪.地骨皮總黃酮的提取及酪氨酸酶活性抑制研究[J].福建中醫(yī)藥，2012，43（4）：54-56.

[3] 張理平.“斑白”搽劑中微量元素與氨基酸的含量及祛斑機理[J].光明中醫(yī)，2004，19（6）：57-58.

[4] 張理平，陳麗，胡筱，等.外用中藥斑白搽劑對黑色素產(chǎn)生過程中酪氨酸酶的抑制作用[J].中國臨床康復，2005，9（10）：168-169.

[5] 胡良平，郭辰儀.用SAS軟件實現(xiàn)析因設計定量資料的統(tǒng)計分析[J].藥學服務與研究，2011，11（3）：170-173.

[6] 王英豪，陳志春，張理平，等.響應面法優(yōu)化桑椹黃酮超聲輔助提取工藝及對酪氨酸酶活性抑制研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（2）：93-97.

[7] 張海霞，梁乃龍.黃褐斑與酪氨酸酶活性的相關性研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2010，12（9）：99-100.

[8] 鄒宏超，付香蓮.黃褐斑病因及發(fā)病機制研究進展[J].皮膚病與性病， 2010，32（4）：27-29.

（收稿日期：2016-11-16）

（修回日期：2016-12-09；編輯：陳靜）