張鶴+趙飛+高廣慧

摘 要：本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測南瓜子中泛酸含量的方法，并進行了方法學驗證。樣品經(jīng)а-淀粉酶酶解后，調(diào)節(jié)提取液的pH值，沉淀蛋白后，經(jīng)石油醚除油后，采用ACQUITY UPLC C18（50mm×2.1mm，1.7μm）色譜柱梯度洗脫分離，用超高效液相色譜電噴霧離子源串聯(lián)四級桿質(zhì)譜檢測，可在2.5 min內(nèi)完成一批次待測液的檢測。泛酸在0.05-5 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性，相關(guān)系數(shù)大于0.999，回收率在97.8 %～107 %之間，相對標準偏差為2.5 %～6.0 %。研究結(jié)果表明，該方法簡便、快速、準確，可快速檢測南瓜子中泛酸的含量。

關(guān)鍵詞：泛酸；超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜；南瓜子

中圖分類號：D919 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）11-0041-03

隨著科學技術(shù)的不斷進步和經(jīng)濟的不斷發(fā)展，人們的飲食文化也呈現(xiàn)多樣化發(fā)展的趨勢，對于食品的攝入不僅要求健康安全，同時要求食物帶來更多的營養(yǎng)補充。維生素是人體必須的營養(yǎng)成分，因此全面建立食品中維生素的檢測方法顯得尤為重要。

泛酸又稱“遍多酸”，是維生素B族的一種。它廣泛存在于多種干果食品中。目前泛酸的檢測方法主要有高效液相色譜法、微生物法。國家標準中對保健食品、嬰幼兒配方食品和乳粉中泛酸的檢測采用高效液相色譜法，其余食品中泛酸的檢測采用GB/T 5009.210-2008微生物法，沒有理化檢測方法，因此本研究中以南瓜子為例，建立了南瓜子中泛酸的檢測方法，意在為食品加工和生產(chǎn)領(lǐng)域選擇原材料及優(yōu)化加工流程提供支持；同時可為檢驗機構(gòu)進行干果及其制品中泛酸檢測做參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC-Xevo TQD型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、BEH C18 1.7μm 2.3×50mm色譜柱 美國WATERS公司；高速冷凍離心機美國Thermo公司；渦旋混合儀 德國IKA公司；分析天平德國Sartorius公司。

標準物質(zhì)：泛酸鈣（純度>98.0%）美國SUPELCO公司；

甲酸（色譜純）美國Sigma公司；乙腈（色譜純）美國Fisher公司；а-淀粉酶（生物試劑）AOBOX公司活度3.7U/mg；鹽酸（分析純） 北京化學試劑研究所；硫酸鋅（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；石油醚（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水均為一級水。

1.2 標準溶液的配制

精密稱取泛酸鈣標準物質(zhì)適量，用水溶解并定容至10mL，配制成1.0mg/mL標準溶液。

1.3 樣品前處理

分別準備未經(jīng)加工處理和經(jīng)加工處理的南瓜子若干。未經(jīng)加工處理的南瓜子是由超級市場購買的南瓜中取出南瓜子，并經(jīng)洗凈、晾干、去皮處理，經(jīng)加工的南瓜子購于超級市場，并經(jīng)去皮處理，并于粉碎機中粉碎均勻。

稱取粉碎均勻的南瓜子樣品5g（精確至0.0001g）于50mL離心管中，向離心管中依次加入0.2gа-淀粉酶、20mL40-50℃溫水，渦旋半分鐘后，置于50-60℃水浴中震蕩酶解40min，待酶解完成放至室溫，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)酶解液的pH值至4.5±0.1，向其中再加入5mL硫酸鋅溶液，靜置30min，5000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管，用水定容至30mL。向離心管中加入10mL石油醚（沸程為30-60℃），渦旋半分鐘，靜置分層，棄去上層，下層重復上述操作兩次，下層清液稀釋10倍后，經(jīng)0.22μm濾膜過濾至棕色進樣瓶中待測。

1.4 UPLC色譜條件

色譜柱：C18 1.7μm 2.1×50mm；柱溫：30℃；樣品室溫度：10℃；進樣量：5μL；流動相：A相：乙腈、B相：0.1%甲酸溶液，梯度洗脫條件見表1。

1.5 MS/MS質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子模式；多反應監(jiān)測；毛細管電壓2.0KV；離子源溫度150℃；脫溶劑氣溫度500℃；錐孔氣流量50L/h；脫溶劑氣流量800L/h。泛酸的定量和定性離子對、錐孔電壓和碰撞能量參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)

實驗結(jié)果表明泛酸濃度在0.05-5μg/mL范圍內(nèi)與其定量離子對的峰面積響應值具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=42552x+1796.3，相關(guān)系數(shù)為0.9991。

2.2 方法精密度與樣品溶液穩(wěn)定性

取回收率試驗一點每日連續(xù)進樣6次，檢測3次，測得結(jié)果見表3，結(jié)果符合分析要求，方法精密度良好，處理后的樣品溶液在室溫避光放置4天對測定結(jié)果無影響。

2.3 回收率

取已知含量的南瓜子樣品，進行三個標準添加水平（分別向樣品中添加相當于泛酸0.3、0.6、0.9mg的標準溶液）的回收率實驗，每個回收率添加水平平行進行6份，分別計算加標回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表4。泛酸的三個水平加標回收率在97.8-107%，相對標準偏差在2.5-6.0%，滿足實際樣品分析需求。

2.4 實際樣品檢測

分別將粉碎均勻的經(jīng)加工和未經(jīng)加工的南瓜子按照本文建立的方法進行預處理并且測定，計算結(jié)果見表5。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理的優(yōu)化

南瓜子樣品含有大量蛋白質(zhì)、脂肪，同時含有淀粉，為使處理得到的待測液雜志含量較低、干擾較少，本文中針對不同的雜質(zhì)采用了不同的除雜方法。先后加入了淀粉酶、硫酸鋅溶液、調(diào)節(jié)待測液pH值、石油醚，分別分解樣品中的淀粉、除蛋白質(zhì)、除脂肪，效果較好。

3.2 色譜條件優(yōu)化

分別采用乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相，檢測同一濃度標準溶液，結(jié)果顯示加入甲酸的流動相因甲酸的存在使得待測液中泛酸的離子化效率更高，響應更好，因此選擇后者作為流動相。同時調(diào)整了流動相梯度洗脫程序，獲得較好的峰形和響應值。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本方法采用質(zhì)譜直接進樣，查找定性定量離子對的方式，分別優(yōu)化了錐孔電壓、碰撞電壓、脫溶劑氣流量、錐孔氣流量等條件，最終確定條件見表。

4 取得成果及創(chuàng)新點

通過研究建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測南瓜子中泛酸含量的方法，并用該方法檢測了經(jīng)加工和未經(jīng)加工的南瓜子中泛酸的含量。該法準確度高，精密度好，為食品中泛酸含量的檢測提供了技術(shù)支持。本研究的創(chuàng)新點及取得的成果主要有以下幾方面：

（1）建立了南瓜子中泛酸檢測的樣品前處理方法，通過查閱文獻資料，我們發(fā)現(xiàn)食品中泛酸的檢測除嬰幼兒食品和乳品可采用微生物法和高效液相色譜法外，其余均使用微生物法。而本研究建立的方法采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，多反應離子監(jiān)測方式大大提高了選擇性和靈敏度，該法重現(xiàn)性好，處理操作簡單。

（2）本研究采用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測南瓜子中泛酸的含量，通過定性離子與定量離子的豐度比對檢出成分進行定性確證，再通過定量離子的響應強度對樣品中泛酸的含量進行定量分析。此法較液相色譜法通過保留時間進行定性更為準確可靠，選擇性更高；同時采用多反應離子監(jiān)測，使得靈敏度更高。

參考文獻

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