楊彩虹，曹旭東，史靜雪，姬祥，于璐，袁俐，吳長(zhǎng)新，陳創(chuàng)夫*

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002；3石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

結(jié)核分枝桿菌臨床分離株鏈霉素耐藥性的檢測(cè)及耐藥基因突變位點(diǎn)分析

楊彩虹1，曹旭東2，史靜雪1，姬祥3，于璐2，袁俐2，吳長(zhǎng)新2，陳創(chuàng)夫1*

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002；3石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

為檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素（streptomycin，SM）耐藥性，分析耐藥基因突變，探討DNA測(cè)序分析技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。采用方法：1、用傳統(tǒng)的比例法藥敏試驗(yàn)對(duì)49株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行鏈霉素耐藥性檢測(cè)。2、用DNA測(cè)序分析技術(shù)對(duì)49株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行鏈霉素耐藥相關(guān)基因Rpsl和rrs的突變位點(diǎn)分析，篩查耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)。3、探討DNA測(cè)序分析技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行鏈霉素耐藥性檢測(cè)的效率。結(jié)果：1、傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，49株實(shí)驗(yàn)菌株中16株為鏈霉素耐藥株，33株為鏈霉素敏感株。2、Rpsl基因DNA測(cè)序。結(jié)果顯示：Rpsl基因只存在一個(gè)突變位點(diǎn)，為第43位密碼子AAG的突變，突變形式為AAG→AGG，氨基酸由賴(lài)氨酸（Lys）變?yōu)榫彼幔ˋrg）。rrs基因DNA測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)：rrs基因共存在5個(gè)突變位點(diǎn)，分別為第513位堿基A突變?yōu)镚、第523位堿基A缺失、第598位堿基A突變?yōu)镚、第599位堿基A缺失、第612位堿基A缺失，其中第513位堿基突變只存在于鏈霉素耐藥株中，其余4個(gè)突變位點(diǎn)在耐藥株和敏感株中均存在。即初步認(rèn)為Rpsl基因第43位密碼子的突變及rrs基因第513位堿基的突變與結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性有關(guān)。3、分析Rpsl基因和rrs基因突變與結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性之間的關(guān)系，結(jié)果顯示：16株鏈霉素耐藥株中13株存在Rpsl基因第43位密碼子的突變，1株存在rrs基因第513位堿基的突變。以傳統(tǒng)的比例法藥敏結(jié)果為參照，以DNA測(cè)序分析Rpsl基因或rrs基因發(fā)現(xiàn)Ppsl基因發(fā)生第43位密碼子或rrs基因第513位堿基突變?yōu)榕袛嗑昴退幍臉?biāo)準(zhǔn)，DNA測(cè)序分析技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性檢測(cè)的敏感性為87.5%，特異性為96.97%。由此可知，初步認(rèn)為Rpsl基因第43位密碼子的突變及rrs基因第513位堿基的突變與結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性有關(guān)。用DNA測(cè)序分析結(jié)核分枝桿菌Rpsl基因和rrs基因鏈霉素耐藥相關(guān)突變，判斷結(jié)核桿菌鏈霉素耐藥性具有較好的靈敏度和特異性，耗時(shí)短，在鏈霉素耐藥結(jié)核病的快速診斷方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)核分枝桿菌；鏈霉素；DNA測(cè)序；耐藥性

結(jié)核病是當(dāng)今全球范圍內(nèi)最具威脅性的感染性疾病之一，是單一病菌致死率最高的傳染病。目前，我國(guó)結(jié)核病人數(shù)位居世界第二，僅次于印度，衛(wèi)生部將其列為全國(guó)重點(diǎn)控制的重大疾病之一。大量結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐藥菌株的出現(xiàn)及不斷擴(kuò)散使結(jié)核病的防控更加困難，給結(jié)核病的防治帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)，現(xiàn)已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題[1-2]。

因此快速準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)核桿菌的耐藥性，為指導(dǎo)早期用藥、提高結(jié)核病療效，防止耐藥菌的產(chǎn)生和傳播具有重要意義。

鏈霉素（streptomycin，SM）是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)與核糖體相互作用的抗生素。1944年，Selman Waksman發(fā)現(xiàn)SM可用于治療結(jié)核病[3]。早在1946年，就已經(jīng)有關(guān)于結(jié)核分枝桿菌對(duì)SM產(chǎn)生耐藥性的報(bào)道[4]。2000年第4次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查[5]與2010年第5次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查[6]比較顯示，經(jīng)我國(guó)結(jié)核分枝桿菌SM 耐藥率為有上升的趨勢(shì)，應(yīng)當(dāng)引起人們的高度關(guān)注。

本實(shí)驗(yàn)首先采用傳統(tǒng)的比例法藥敏試驗(yàn)對(duì)49株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)；再參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]及Rpsl基因和rrs基因序列，設(shè)計(jì)引物，對(duì)49株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行Rpsl基因和rrs基因的測(cè)序分析，以傳統(tǒng)的比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為參照，評(píng)價(jià)DNA測(cè)序分析技術(shù)檢測(cè)鏈霉素耐藥性的敏感性、特異性，探討DNA測(cè)序分析技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的應(yīng)用價(jià)值，為耐藥結(jié)核病的快速輔助診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

49株結(jié)核分枝桿菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

氨酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、檸檬酸鎂、丙三醇、天澤恩基因柱式分支桿菌DNAout試劑盒、高分辨率熔解曲線試劑盒（羅氏公司）、谷核酸染料及2×Taq PCR Master Mix購(gòu)與生工生物科技有限公司、引物均由上海祥音生物科技有限公司合成、DNA ladder購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

渦旋混合儀、恒溫培養(yǎng)箱、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LightCycler480，瑞士羅氏公司）。Nanodrop2000分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 比例法藥敏實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)至出現(xiàn)可見(jiàn)菌落的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)操作遵循《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》進(jìn)行，鏈霉素在含藥培養(yǎng)基中的濃度為4 μg/mL[7]。

1.2.2 結(jié)核分枝桿菌DNA的提取

在改良的羅氏培養(yǎng)基上挑取適量生長(zhǎng)良好的結(jié)核分枝桿菌加入磨菌瓶，磨菌瓶提前加入磨菌株高壓備用，使用時(shí)再加入5-6滴生理鹽水。每株菌磨3 min，靜止5 min，然后分裝到0.5 mL的滅菌管中，再將其放入滅活儀85℃，1 h。滅活后的菌液按照柱式分枝桿菌DNAout試劑盒說(shuō)明書(shū)提取，獲得的DNA溶液用分光光度計(jì)檢測(cè)濃度以備用。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥相關(guān)基因Rpsl和rrs的DNA測(cè)序分析

Rpsl（Rv0682）基因位于結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組的第 781560-781934，全長(zhǎng) 375 bp，Gene ID為888259，編碼核糖體蛋白S12。測(cè)序引物如表1所示，測(cè)序區(qū)從第2位密碼子-第103位密碼子之間，引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為306 bp。

rrs（Rvnr01）基因位于結(jié)核分枝桿菌標(biāo)H37Rv基因組的第 1471846-1473382，Gene ID為 2700429，全長(zhǎng)1537 bp，編碼16srRNA。測(cè)序區(qū)覆蓋rrs513-517和 rrs905-908及1400三個(gè)區(qū)域，從第456位堿基-第1449位堿基之間，引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為994 bp（表 1）。

表1 測(cè)序引物Tab.1 The primers of DNA sequencing

對(duì)49株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥相關(guān)基因 Rpsl和rrs測(cè)序區(qū)的PCR擴(kuò)增，PCR體系為25 μL，包括9.7 μL dd H2O、25 um上下游引物各 0.4 μL、模板 2 μL、Mix 12.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 5 min、94℃變性 40 s、59.5℃（59℃）退火30 s、72℃延伸40 s、重復(fù)30個(gè)循環(huán)、72℃再延伸10 min，4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)有條帶后送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GeneBank上公布的結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得每株菌在測(cè)序區(qū)對(duì)應(yīng)的突變信息，將獲得的突變信息與文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的突變位點(diǎn)進(jìn)行比較，分析二者之間的異同，并統(tǒng)計(jì)各突變位點(diǎn)在耐藥菌株里所占比例。

最后分析耐藥株耐藥相關(guān)基因的突變位點(diǎn)及突變類(lèi)型、分析用DNA直接測(cè)序法對(duì)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性檢測(cè)的效率。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較傳統(tǒng)藥敏結(jié)果、DNA測(cè)序結(jié)果之間的符合率。用卡方檢測(cè)分析比例法藥敏結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果的差異性，P﹤0.05提示兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Kappa檢測(cè)分析兩種結(jié)果的一致性。1≥Kappa≥0.75時(shí)為高度一致性；0.75≥Kappa≥0.4時(shí)為中度一致性；Kappa＜0.4時(shí)為低度一致性。

2 結(jié)果

2.1 比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

發(fā)現(xiàn)49株實(shí)驗(yàn)菌株中有16株為鏈霉素耐藥株，33株為鏈霉素敏感株。

2.2 鏈霉素耐藥相關(guān)基因Rpsl和rrs DNA測(cè)序分析結(jié)果

2.2.1目的基因Rpsl和rrs的擴(kuò)增結(jié)果

用測(cè)序引物PCR分別擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)菌株的基因組DNA，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。49株結(jié)核分枝桿菌及1株H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株全部擴(kuò)增出Rpsl基因306 bp片段長(zhǎng)度（圖1）。rrs基因擴(kuò)增出994 bp片段長(zhǎng)度（圖 2）。

圖1 不同菌株 Rpsl基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of Rpsl gene

圖2 不同菌株 rrs基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Different strains of rrs gene amplification results

2.2.2 目的基因Rpsl和rrs的測(cè)序分析

將DNA測(cè)序結(jié)果分別與Genebank上公布的結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因Rpsl和rrs基因?qū)?yīng)序列進(jìn)行比較，49株結(jié)核分枝桿菌中鏈霉素耐藥相關(guān)基因Rpsl存在1個(gè)突變位點(diǎn)，為第43位密碼子 AAG突變?yōu)锳GG，氨基酸由賴(lài)氨酸（Lys）突變?yōu)榫彼幔ˋrg）（3a）。49株結(jié)核分枝桿菌中鏈霉素耐藥相關(guān)基因rrs存在5個(gè)突變位點(diǎn)（3b-f）。

圖3 DNA序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 DNA sequence alignment results

2.2.3 各菌株在鏈霉素耐藥相關(guān)基因Rpsl和rrs的測(cè)序區(qū)的突變位點(diǎn)分析

將每株菌的測(cè)序結(jié)果與GeneBank上公布的標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的Rpsl基因和rrs基因?qū)?yīng)序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同株菌在鏈霉素耐藥相關(guān)基因Rpsl和rrs基因的突變Tab.2 Streptomycin Resistance conferring mutation within rpsl and rrs in different Mycobacterium tuberculosis isolares

2.2.4 Rpsl基因和rrs基因各位點(diǎn)突變類(lèi)型及密碼子變化

通過(guò)對(duì)49株結(jié)核分枝桿菌Rpsl基因突變位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，16株鏈霉素耐藥株中出現(xiàn)了1種突變類(lèi)型，為第43位密碼子AAG→ AGG，氨基酸由賴(lài)氨酸（Lys）突變?yōu)榫彼幔ˋrg）；33株鏈霉素敏感株中出現(xiàn)了1種突變類(lèi)型，為第43位密碼子AAG→AGG，氨基酸由賴(lài)氨酸（Lys）突變?yōu)榫彼幔ˋrg）（表 3）。

表3 Rpsl基因分別在鏈霉素耐藥菌株和敏感菌株中的突變Tab.3 Rpsl mutations in Streptomycin Resistant strains and Streptomycin susceptible strains,respectively

49株分枝桿菌臨床分離株的Rpsl基因測(cè)序區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，有14株存在第43位密碼子的突變，其中13株為鏈霉素耐藥株，占鏈霉素耐藥株的81.25%。1株出現(xiàn)在鏈霉素敏感株中，在鏈霉素敏感株中占3.03%。綜上所述，Rpsl基因第43位密碼子的突變?cè)阪溍顾啬退幹曛姓驾^高比率，因此，初步認(rèn)為該位點(diǎn)的突變與鏈霉素耐藥性存在密切關(guān)系，可作為檢測(cè)菌株鏈霉素耐藥性的靶點(diǎn)之一（圖4）。

對(duì)49株結(jié)核分枝桿菌rrs基因進(jìn)行突變位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，16株鏈霉素耐藥株中9株不存在突變位點(diǎn)；7株發(fā)現(xiàn)存在突變情況，其中1株存在513 A→C、3株存在598 A→G、1株存在523 A堿基缺失及612 A→G、1株存在 599A堿基缺失、1株存在 523及599位點(diǎn)A堿基缺失。

圖4 Rpsl各突變位點(diǎn)在敏感株及耐藥株中所占比例Fig.4 The mutations proportion of Rpsl in sensitive strains and resistant strains

33株鏈霉素敏感株中22株不存在突變位點(diǎn)；11株發(fā)現(xiàn)存在突變情況，其中4株存在598 A→G的突變、1株存在599A缺失、1株存在523A缺失及598 A→G的突變、1株存在 523，599，612 位點(diǎn) A堿基缺失、1株存在598 A→G的突變及612位點(diǎn)A堿基缺失、3株存在523及599位點(diǎn)A堿基缺失（表 4）。

表4 rrs基因分別在鏈霉素耐藥菌株和敏感菌株中的突變Tab.4 rrs mutations in Streptomycin Resistant strains and Streptomycin susceptible strains,respectively

rrs基因的 DNA 測(cè)序結(jié)果顯示，523、598、599、612位點(diǎn)突變不僅在鏈霉素耐藥株中出現(xiàn)，在鏈霉素敏感株中同樣也出現(xiàn)，在耐藥株中各突變位點(diǎn)所占比例依次為 12.5%、18.75%、12.5%、6.25；在敏感株中各突變位點(diǎn)所占比例依次為15.15%、18.18%、15.15%、6.06%。因此，初步認(rèn)為 523、598、599、612位點(diǎn)的突變與鏈霉素耐藥無(wú)關(guān)。而513位點(diǎn)的突變只在鏈霉素耐藥株中存在，初步認(rèn)為該位點(diǎn)的突變與鏈霉素耐藥性存在一定關(guān)系，可作為檢測(cè)菌株鏈霉素耐藥性的靶點(diǎn)之一，本實(shí)驗(yàn)中該位點(diǎn)的突變占鏈霉素耐藥株的6.25%（圖5）。

圖5 rrs基因各突變位點(diǎn)在敏感株及耐藥株中所占比例Fig.5 The mutations proportion of rrs in in sensitive strains and resistant strains

2.3 評(píng)價(jià)DNA測(cè)序分析技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的應(yīng)用價(jià)值

2.3.1 以DNA測(cè)序檢測(cè)到耐藥突變?yōu)榕袛嗑昴退幮缘臉?biāo)準(zhǔn)

將傳統(tǒng)比例法藥敏結(jié)果與基因突變結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，16株鏈霉素耐藥株中13株存在Rpsl基因的第43位密碼子的突變，1株存在rrs基因的第513位堿基的突變，2株不存在Rpsl基因和rrs基因中任何一個(gè)基因的突變。若以比例法藥敏結(jié)果為參照，以DNA測(cè)序檢測(cè)到耐藥突變?yōu)榕袛嗑昴退幮缘臉?biāo)準(zhǔn)，在鏈霉素耐藥株中，耐藥突變的菌株占87.5%，耐藥未突變的菌株占12.5%。即通過(guò)DNA測(cè)序分析方法檢測(cè)結(jié)核桿菌鏈霉素耐藥性的敏感性為87.5%、特異性為 96.97%（表 5）。

表5 傳統(tǒng)耐藥與基因測(cè)序結(jié)果比較分析Tab.5 Comparison of traditional drug resistance and gene sequencing results

3 討論

鏈霉素（SM）是1945年發(fā)明的一種氨基環(huán)醇糖苷類(lèi)抗生素，是第一種有效的抗結(jié)核藥物[8]。鏈霉素的抗菌活性主要是通過(guò)與結(jié)核分枝桿菌中核糖核酸蛋白體亞單位結(jié)合，干擾細(xì)菌的翻譯，進(jìn)而干擾蛋白質(zhì)的合成[5]。對(duì)于結(jié)核桿菌鏈霉素耐藥性的檢測(cè)，目前應(yīng)用比較普遍的是傳統(tǒng)的藥物敏感性檢測(cè)（DST），該方法包括實(shí)驗(yàn)室常用的耐藥診斷金標(biāo)法——羅氏培養(yǎng)基（L-J）比例法、快速診斷耐藥結(jié)核病的 Bactec MGIT 960檢測(cè)系統(tǒng)以及檢測(cè)細(xì)菌最低抑菌濃度值（MIC）的微孔板 Alamar Blue顯色法（MABA 法）。羅氏培養(yǎng)基（L-J）比例法是目前運(yùn)用最廣泛的藥敏檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究報(bào)道均用比例法藥敏結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)[9-10]。雖然該方法具有較高的準(zhǔn)確性，但耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測(cè)至少需要1個(gè)月，不能及時(shí)有效的指導(dǎo)臨床用藥，患者可能因此耽誤最佳的治療時(shí)機(jī)，在藥敏結(jié)果出來(lái)前已死亡。因此快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性有利于指導(dǎo)臨床醫(yī)生在病程早期正確用藥，加快結(jié)核病的治愈，降低病人的費(fèi)用，抑制耐多藥結(jié)核分枝桿菌的傳播，具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

目前普遍認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制包括細(xì)胞壁通透性改變、泵蛋白的調(diào)控、酶失活、靶基因的突變等因素，其中引起結(jié)核分枝桿菌耐藥的主要原因之一是基因突變。經(jīng)多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌Rpsl和rrs基因突變與鏈霉素耐藥有關(guān)[11]，約 80%的耐鏈霉素結(jié)核桿菌臨床分離株可見(jiàn)rpsL和 rrs基因突變[12]。其中約52%-59%的SM耐藥菌株可見(jiàn)rpsL基因發(fā)生突變，突變位點(diǎn)主要集中在第43位和第 88位氨基酸 ，二者密碼子均由 AAG突變?yōu)锳GG，氨基酸由賴(lài)氨酸（Lys)突變?yōu)榫彼?Arg)[13]，且rpsL基因70%以上的突變發(fā)生在Rpsl43位點(diǎn)[14]。還有 8%-21%的SM耐藥菌株rrs基因發(fā)生突變，突變主要集中在530環(huán)區(qū)和904位堿基[15]。由此可見(jiàn)，Rpsl基因和rrs基因的突變與結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性有密切關(guān)系，因此，可通過(guò)分析這兩個(gè)基因的突變檢測(cè)大部分結(jié)核分枝桿菌對(duì)鏈霉素的耐藥性?；诮Y(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性主要是耐藥相關(guān)基因的突變引起的，許多研究者建立了以檢測(cè)耐藥基因突變?yōu)榛A(chǔ)的耐藥檢測(cè)方法。因此，基因診斷技術(shù)近年來(lái)在結(jié)核病的快速診斷中取得了重大突破。

本實(shí)驗(yàn)使用的方法是DNA測(cè)序分析技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)結(jié)果直觀可靠，排除了人為因素造成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠性，且可在一周內(nèi)得到結(jié)果。不足之處是對(duì)每一分離株來(lái)說(shuō)，全部檢測(cè)所有位點(diǎn)需要多次反應(yīng)，操作較為復(fù)雜[16]。

分析本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DNA測(cè)序分析方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的結(jié)果顯示，其敏感性為87.5%、特異性為96.97%，雖然具有較好的敏感性和特異性。但仍有2株耐藥株未檢測(cè)到Rpsl基因或rrs基因發(fā)生突變，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，分析其原因，可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)DNA測(cè)序分析方法檢測(cè)結(jié)核桿菌鏈霉素耐藥性時(shí)，設(shè)計(jì)的檢測(cè)范圍未能覆蓋所有的耐藥相關(guān)基因或耐藥突變位點(diǎn)、也可能是結(jié)核桿菌鏈霉素耐藥性存在其他一些耐藥機(jī)制，這些耐藥機(jī)制并不是基因突變導(dǎo)致的耐藥，可能與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)，所以部分耐藥菌株未能檢測(cè)到基因突變。

總的來(lái)說(shuō)，DNA測(cè)序分析方法與傳統(tǒng)的藥敏實(shí)驗(yàn)相比，在結(jié)核桿菌鏈霉素耐藥性檢測(cè)中可作為較好的快速輔助診斷，可盡快為耐藥結(jié)核病的臨床治療方案提供依據(jù)。

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Streptomycin resistance testing and analysis of resistance gene mutations of Mycobacterium tuberculosisin clinical isolates

Yang Caihong1,Cao Xudong2,Shi Jingxue1,Ji Xiang3,Yu lu2,Yuan Li2,Wu Changxin2,Chen Chuangfu1*
(1 Collage of Animal Science and Technology,Shehezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China;3 Collage of Life Science,Shehezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

To analysis the drug resistance and gene mutation inMycobacterium tuberculosis,and to investigate the clinical application value of DNA sequence analysis detecting ofMycobacterium tuberculosisisolates streptomyci-resistance.First,traditional drug susceptibility test(DST)was used to analysis streptomycin-resistance for 49 strainsMycobacterium tuberculosis.Then,analysis assay for detection of mutation in two drug resistance associated genes of 49 strainsMycobacterium tuberculosis clinical isolates (rpsl,rrs)by DNA sequencing,and screening for mutations.According to the mutations of genes,the design of primersof DNA Sequenceanalysisfordetection of streptomycin resistance.DST resultsshowed that16 strainswere Streptomycin-resistant strains,33 strains were streptomycin-sensitive strains.Sequencing results showed that there was only a mutations of rpsl,for the 43rd codon mutation of AAG,mutation forms for AAG-AGG,amino acid from lysine (Lys)into arginine (Arg).There were five site mutations of rrs gene,513 A to G,523,599,612 of lack of A,598A to G,respectively.The 513th base mutations existed only in the streptomycin resistant strains,the remaining four mutations in resistant strains and sensitive strains existed.The preliminary think the 43rd codon Rpsl gene mutation and rrs 513th of base mutations associated with streptomycin resistance Mycobacterium tuberculosis.Culture-based phenotypic drug susceptibility testing and DNA sequencing to analyze the level of rpsl gene,rrs gene mutation,the results showed 1 strain existed 513th base mutations of rrs genes,13 strains existed 43th codon mutations of rpsl gene in 16 strains of streptomycin resistant strains.With culture-based phenotypic drug susceptibility testing as the gold standard,the DNA sequencing detected rpsl gene 43th codes or rrs gene 513th base mutations for strains resistant,DNA sequencing results showed that the sensitivity and specificity was 87.5%and 96.97%.It can beconcluded that DNA sequencing analysistechnology hasgood sensitivity and specificity to detect streptomycin resistance ofMycobacterium tuberculosisclinical isolates,which is short time-consuming and in early diagnosis of streptomycin drug-resistant TB.

Mycobacterium tuberculosis;streptomycin;DNAsequencing;drug-resistance

S855.2

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.007

1007-7383(2017)02-0169-07

2016-10-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060333)，新疆兵團(tuán)重大科技專(zhuān)項(xiàng)（2014AA001）

楊彩虹（1990-），女，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)椋盒笄莶≡肿由飳W(xué)。

*通信作者：陳創(chuàng)夫（1962-），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事分子病理學(xué)和免疫學(xué)研究，e-mail:ccf-xb@163.com。