劉佳+趙再迪+孫溪

摘 要：用共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)法將纖維素酶固定在水熱制備的殼聚糖碳材料上，并研究其酶活性。結(jié)果表明，游離酶、共價(jià)結(jié)合酶和交聯(lián)酶的Km值分別是10.92g/L、3.184g/L和0.3132g/L。游離酶和交聯(lián)酶的最適溫度為40℃，共價(jià)結(jié)合酶為50℃，且共價(jià)結(jié)合酶的最適反應(yīng)溫度顯著拓寬。相比游離酶，兩種固定酶都表現(xiàn)出更好的重復(fù)使用穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，其中共價(jià)結(jié)合酶最佳。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；殼聚糖；水熱法；固定化

中圖分類號(hào)：TQ016 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2017）19-0012-02

前言

纖維素酶是催化纖維素降解成葡萄糖的多酶復(fù)合體，化工原料、飼料、燃料、食物和藥物等可由葡萄糖發(fā)酵得到[1]。游離酶受熱易失活，難回收，工業(yè)上常將酶固定化利用。殼聚糖由幾丁質(zhì)去乙?；玫?，大量氨基、羥基等電負(fù)性基團(tuán)能與酶結(jié)合。但殼聚糖是陽(yáng)離子聚合物，溶于酸，易被多種非專一性酶降解。目前殼聚糖的改性方法大多通過加入多種化學(xué)試劑，不僅對(duì)酶有毒害，還使操作復(fù)雜化。

水熱法模擬自然界的成礦環(huán)境[2]，在密閉的反應(yīng)釜中，以水為溶劑，將常規(guī)條件下不易溶解的物質(zhì)在高溫高壓條件下溶解并重新結(jié)晶，再經(jīng)過分離得到產(chǎn)物，綠色環(huán)保，操作簡(jiǎn)單。水熱法制備的生物質(zhì)碳材料具有良好的的理化穩(wěn)定性，相對(duì)表面積增大，有大量生物親和基團(tuán)，做酶的固定化載體利于酶的結(jié)合、底物的擴(kuò)散[3]。

本文以水熱法制備的殼聚糖碳材料為載體，分別通過共價(jià)結(jié)合法和戊二醛交聯(lián)法固定纖維素酶，研究酶的米氏常數(shù)，最適溫度，重復(fù)使用穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

纖維素酶，東京仁成工業(yè)株式會(huì)社；殼聚糖，>95%；戊二醛，25%；纖維二糖，98%；pH=4.8的HAc/NaAc緩沖液；加熱攪拌控制儀；恒溫磁力攪拌器；水浴恒溫振蕩器；高速離心機(jī)；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵；Waters超高液相色譜；Bio-Rad傅里葉變換紅外光譜儀FTS6000；ASAP 2020 /Tristar3000綜合共價(jià)結(jié)合儀；Elementar元素分析儀Vario EL Cube

1.2 殼聚糖碳材料載體的制備及表征

10g殼聚糖、50mL蒸餾水、磁子放入反應(yīng)釜后密封，于1000rpm、180℃的加熱攪拌控制儀上反應(yīng)10h，冷卻，用無水乙醇和蒸餾水洗至澄清，抽濾，固體烘干備用。將原殼聚糖和該殼聚糖碳材料分別命名為1#CS，2#CS180，對(duì)其進(jìn)行比表面積、紅外光譜、元素分析。

1.3 固定纖維素酶

稱0.4g2#CS180，加20mL2g/L的酶液，磁力攪拌2h，水洗抽濾，固體即得共價(jià)結(jié)合酶；稱0.4g2#CS180，加20mL7%戊二醛，磁力攪拌3.5h，水洗抽濾，收集固體，加20mL2g/L的酶液，室溫下磁力攪拌2h，水洗抽濾，得交聯(lián)型固載酶。

1.4 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.4.1 米氏常數(shù)的測(cè)定

取5份1mL 2g/L酶液，5份固定酶各0.1g，分別與0.2-1.0g/L底物（纖維二糖HAc/NaAc緩沖液）反應(yīng)2h，測(cè)葡萄糖產(chǎn)量。

1.4.2 反應(yīng)溫度對(duì)酶的影響

取6份1mL 2g/L酶液，加3mL 2g/L底物，取0.1g兩種固定酶各6份，加3mL0.4g/L底物，30-80℃水浴反應(yīng)2h，測(cè)葡萄糖產(chǎn)量。

1.4.3 固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性

固定酶各0.1g，加3mL0.4g/L底物，40℃水浴反應(yīng)2h，測(cè)葡萄糖產(chǎn)量。剩余固體水洗離心3次后，重復(fù)以上操作4次。

1.4.4 熱穩(wěn)定性

取5份1mL2g/L游離酶和固定酶0.1g，于70℃水浴保溫，隔1h取出一份，加入各自底物，40℃水浴反應(yīng)2h，測(cè)葡萄糖產(chǎn)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖材料的表征結(jié)果

2.1.1 紅外光譜分析

如圖1，1# CS和2# CS-180在1635cm-1N-H2特征峰處的峰強(qiáng)基本一致，表明180℃水熱反應(yīng)未對(duì)氨基造成損失。

2.1.2 元素分析與比表面積分析

見表1，殼聚糖水熱反應(yīng)后氫含量顯著增加，利于結(jié)合酶。比表面積增大將暴露出更多的酶的親和基團(tuán)，利于酶的結(jié)合和底物的擴(kuò)散。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

2.2.1 米氏常數(shù)

如表2，本實(shí)驗(yàn)條件下，固定化纖維素酶的表觀米氏常數(shù)均低于游離纖維素酶，其中交聯(lián)酶的Km值最小，為游離酶的2.868%。

固定酶對(duì)底物的親和力更好，是因?yàn)闅ぞ厶撬鶐У恼姾梢欢ǔ潭壬鲜沟孜锔喔斓匾葡蛎傅幕钚灾行模龠M(jìn)了底物與酶的有效接觸。戊二醛在殼聚糖和酶蛋白之間發(fā)生Schiff反應(yīng)，改變了酶的結(jié)構(gòu)，減小了底物傳遞的空間位阻[4]。

2.2.2 溫度對(duì)酶的影響

由圖2知，游離酶和交聯(lián)酶的最適催化溫度是40℃，交聯(lián)酶的酶活力在40℃后直線下降，而共價(jià)結(jié)合酶是50℃，且在40-60℃間活力都較高。

蛋白質(zhì)靠疏水效應(yīng)維持其結(jié)構(gòu)和功能，非水溶性的殼聚糖通過疏水作用與酶的疏水基團(tuán)聚集能穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)。酶的活性可調(diào)節(jié)和底物專一性要求酶的活性中心具有一定的柔性，當(dāng)酶固定化后，最適溫度的升高能恢復(fù)其柔性。反應(yīng)溫度超過40℃后，交聯(lián)酶迅速失活，說明戊二醛對(duì)殼聚糖和纖維素酶的疏水基團(tuán)造成了破壞。

2.2.3 固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性

如圖3，交聯(lián)酶活力低且下降快，共價(jià)結(jié)合酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性較好。這可能是回收利用過程中，頻繁的升溫降溫使酶部分失活，并且多次高速離心使酶與載體的結(jié)合越來越松散。

2.2.4 熱穩(wěn)定性

如圖4，游離酶保溫1h就基本失活，交聯(lián)酶1h后活力僅剩30%，隨著保溫時(shí)間延長(zhǎng)而完全喪失活力，共價(jià)結(jié)合酶4h后仍有90%以上的活力。游離酶易熱變性，當(dāng)被強(qiáng)耐熱性的載體固定化后，熱能使活性中心恢復(fù)柔性以適應(yīng)底物，從而減弱熱對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的破壞。戊二醛交聯(lián)過程可能破壞了殼聚糖和纖維素酶的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

殼聚糖碳材料具有良好的理化穩(wěn)定性，相對(duì)表面積大，同時(shí)含大量生物親和基團(tuán)，適合作載體。用該殼聚糖碳材料固定的纖維素酶米氏常數(shù)都減小了，且共價(jià)結(jié)合酶的最適反應(yīng)溫度比游離酶和交聯(lián)酶高10℃，熱穩(wěn)定性良好，適合多次使用。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳實(shí)公.固定化纖維素酶的制備及其性質(zhì)研究[D].合肥工業(yè)大學(xué)，2006.

[2]張文龍，馬儒超，周志偉，等.殼聚糖水熱交聯(lián)炭材料研究[J].江西化工，2014（01）：232-236.

[3]魯愛華，袁興中，佟婧怡，等.凍干殼聚糖微球固定化纖維素酶的研究[J].四川環(huán)境，2009，28（6）：9-14.

[4]郭銳.固定化纖維素酶的制備及其性質(zhì)研究[D].天津大學(xué)，2009.