劉佳+趙再迪+孫溪

摘 要：用共價結(jié)合法和交聯(lián)法將纖維素酶固定在水熱制備的殼聚糖碳材料上，并研究其酶活性。結(jié)果表明，游離酶、共價結(jié)合酶和交聯(lián)酶的Km值分別是10.92g/L、3.184g/L和0.3132g/L。游離酶和交聯(lián)酶的最適溫度為40℃，共價結(jié)合酶為50℃，且共價結(jié)合酶的最適反應(yīng)溫度顯著拓寬。相比游離酶，兩種固定酶都表現(xiàn)出更好的重復(fù)使用穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，其中共價結(jié)合酶最佳。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；殼聚糖；水熱法；固定化

中圖分類號：TQ016 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-2945（2017）19-0012-02

前言

纖維素酶是催化纖維素降解成葡萄糖的多酶復(fù)合體，化工原料、飼料、燃料、食物和藥物等可由葡萄糖發(fā)酵得到[1]。游離酶受熱易失活，難回收，工業(yè)上常將酶固定化利用。殼聚糖由幾丁質(zhì)去乙?；玫剑罅堪被⒘u基等電負(fù)性基團能與酶結(jié)合。但殼聚糖是陽離子聚合物，溶于酸，易被多種非專一性酶降解。目前殼聚糖的改性方法大多通過加入多種化學(xué)試劑，不僅對酶有毒害，還使操作復(fù)雜化。

水熱法模擬自然界的成礦環(huán)境[2]，在密閉的反應(yīng)釜中，以水為溶劑，將常規(guī)條件下不易溶解的物質(zhì)在高溫高壓條件下溶解并重新結(jié)晶，再經(jīng)過分離得到產(chǎn)物，綠色環(huán)保，操作簡單。水熱法制備的生物質(zhì)碳材料具有良好的的理化穩(wěn)定性，相對表面積增大，有大量生物親和基團，做酶的固定化載體利于酶的結(jié)合、底物的擴散[3]。

本文以水熱法制備的殼聚糖碳材料為載體，分別通過共價結(jié)合法和戊二醛交聯(lián)法固定纖維素酶，研究酶的米氏常數(shù)，最適溫度，重復(fù)使用穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。

1 實驗

1.1 材料與儀器

纖維素酶，東京仁成工業(yè)株式會社；殼聚糖，>95%；戊二醛，25%；纖維二糖，98%；pH=4.8的HAc/NaAc緩沖液；加熱攪拌控制儀；恒溫磁力攪拌器；水浴恒溫振蕩器；高速離心機；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵；Waters超高液相色譜；Bio-Rad傅里葉變換紅外光譜儀FTS6000；ASAP 2020 /Tristar3000綜合共價結(jié)合儀；Elementar元素分析儀Vario EL Cube

1.2 殼聚糖碳材料載體的制備及表征

10g殼聚糖、50mL蒸餾水、磁子放入反應(yīng)釜后密封，于1000rpm、180℃的加熱攪拌控制儀上反應(yīng)10h，冷卻，用無水乙醇和蒸餾水洗至澄清，抽濾，固體烘干備用。將原殼聚糖和該殼聚糖碳材料分別命名為1#CS，2#CS180，對其進行比表面積、紅外光譜、元素分析。

1.3 固定纖維素酶

稱0.4g2#CS180，加20mL2g/L的酶液，磁力攪拌2h，水洗抽濾，固體即得共價結(jié)合酶；稱0.4g2#CS180，加20mL7%戊二醛，磁力攪拌3.5h，水洗抽濾，收集固體，加20mL2g/L的酶液，室溫下磁力攪拌2h，水洗抽濾，得交聯(lián)型固載酶。

1.4 酶學(xué)性質(zhì)測定

1.4.1 米氏常數(shù)的測定

取5份1mL 2g/L酶液，5份固定酶各0.1g，分別與0.2-1.0g/L底物（纖維二糖HAc/NaAc緩沖液）反應(yīng)2h，測葡萄糖產(chǎn)量。

1.4.2 反應(yīng)溫度對酶的影響

取6份1mL 2g/L酶液，加3mL 2g/L底物，取0.1g兩種固定酶各6份，加3mL0.4g/L底物，30-80℃水浴反應(yīng)2h，測葡萄糖產(chǎn)量。

1.4.3 固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性

固定酶各0.1g，加3mL0.4g/L底物，40℃水浴反應(yīng)2h，測葡萄糖產(chǎn)量。剩余固體水洗離心3次后，重復(fù)以上操作4次。

1.4.4 熱穩(wěn)定性

取5份1mL2g/L游離酶和固定酶0.1g，于70℃水浴保溫，隔1h取出一份，加入各自底物，40℃水浴反應(yīng)2h，測葡萄糖產(chǎn)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖材料的表征結(jié)果

2.1.1 紅外光譜分析

如圖1，1# CS和2# CS-180在1635cm-1N-H2特征峰處的峰強基本一致，表明180℃水熱反應(yīng)未對氨基造成損失。

2.1.2 元素分析與比表面積分析

見表1，殼聚糖水熱反應(yīng)后氫含量顯著增加，利于結(jié)合酶。比表面積增大將暴露出更多的酶的親和基團，利于酶的結(jié)合和底物的擴散。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)測定結(jié)果

2.2.1 米氏常數(shù)

如表2，本實驗條件下，固定化纖維素酶的表觀米氏常數(shù)均低于游離纖維素酶，其中交聯(lián)酶的Km值最小，為游離酶的2.868%。

固定酶對底物的親和力更好，是因為殼聚糖所帶的正電荷一定程度上使底物更多更快地移向酶的活性中心，促進了底物與酶的有效接觸。戊二醛在殼聚糖和酶蛋白之間發(fā)生Schiff反應(yīng)，改變了酶的結(jié)構(gòu)，減小了底物傳遞的空間位阻[4]。

2.2.2 溫度對酶的影響

由圖2知，游離酶和交聯(lián)酶的最適催化溫度是40℃，交聯(lián)酶的酶活力在40℃后直線下降，而共價結(jié)合酶是50℃，且在40-60℃間活力都較高。

蛋白質(zhì)靠疏水效應(yīng)維持其結(jié)構(gòu)和功能，非水溶性的殼聚糖通過疏水作用與酶的疏水基團聚集能穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)。酶的活性可調(diào)節(jié)和底物專一性要求酶的活性中心具有一定的柔性，當(dāng)酶固定化后，最適溫度的升高能恢復(fù)其柔性。反應(yīng)溫度超過40℃后，交聯(lián)酶迅速失活，說明戊二醛對殼聚糖和纖維素酶的疏水基團造成了破壞。

2.2.3 固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性

如圖3，交聯(lián)酶活力低且下降快，共價結(jié)合酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性較好。這可能是回收利用過程中，頻繁的升溫降溫使酶部分失活，并且多次高速離心使酶與載體的結(jié)合越來越松散。

2.2.4 熱穩(wěn)定性

如圖4，游離酶保溫1h就基本失活，交聯(lián)酶1h后活力僅剩30%，隨著保溫時間延長而完全喪失活力，共價結(jié)合酶4h后仍有90%以上的活力。游離酶易熱變性，當(dāng)被強耐熱性的載體固定化后，熱能使活性中心恢復(fù)柔性以適應(yīng)底物，從而減弱熱對其結(jié)構(gòu)和功能的破壞。戊二醛交聯(lián)過程可能破壞了殼聚糖和纖維素酶的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

殼聚糖碳材料具有良好的理化穩(wěn)定性，相對表面積大，同時含大量生物親和基團，適合作載體。用該殼聚糖碳材料固定的纖維素酶米氏常數(shù)都減小了，且共價結(jié)合酶的最適反應(yīng)溫度比游離酶和交聯(lián)酶高10℃，熱穩(wěn)定性良好，適合多次使用。

參考文獻：

[1]陳實公.固定化纖維素酶的制備及其性質(zhì)研究[D].合肥工業(yè)大學(xué)，2006.

[2]張文龍，馬儒超，周志偉，等.殼聚糖水熱交聯(lián)炭材料研究[J].江西化工，2014（01）：232-236.

[3]魯愛華，袁興中，佟婧怡，等.凍干殼聚糖微球固定化纖維素酶的研究[J].四川環(huán)境，2009，28（6）：9-14.

[4]郭銳.固定化纖維素酶的制備及其性質(zhì)研究[D].天津大學(xué)，2009.