孫國龍, 馬子賓, 郝建華, 盛 軍, 孫 謐

(1. 大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 遼寧 大連116023; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東青島 266071)

樹脂固定化海洋脂肪酶ADM47601的研究

孫國龍1,2, 馬子賓2, 郝建華2, 盛 軍2, 孫 謐2

(1. 大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 遼寧 大連116023; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東青島 266071)

以海洋脂肪酶ADM47601為研究對象, 以樹脂為載體, 進行了固定化酶的研究。篩選了21種樹脂, 確定D316型陰離子交換樹脂為載體。通過正交試驗得到了固定化的最佳條件, 每克載體加脂肪酶10 000 U, pH7.5, 25℃, 150 r/min, 固定化時間3 h, 固定化酶活力回收率可達65.53%±1.06%。固定化脂肪酶最適作用pH為7.5, 在pH6.0～9.0的范圍內(nèi)能夠保持85%的活力。最適作用溫度40℃, 在50℃下貯存1 h后依然保持66%的活力。25℃保存半衰期為55 d, 操作8次仍然能維持60%以上的活性, 且在多種有機試劑中能夠穩(wěn)定的保持活性。固定化脂肪酶Km和Vmax值分別為4.86×10–5mol/L和1.31× 10–5mol/(L·min), 對底物親和性較好。

脂肪酶; 樹脂; 固定化; 酶學(xué)性質(zhì)

脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)又稱三酰基甘油水解酶, 是催化脂肪水解的一類特殊?；饷傅目偤稀Ｄ軌蛟谟退缑嫔洗呋ニ?、酯合成、酯交換、立體異構(gòu)體拆分等化學(xué)反應(yīng), 在食品加工、試劑、紡織、生物能源、制藥等方面有很大的應(yīng)用潛力[1-2], 是一種廣泛應(yīng)用的酶制劑。高活性的脂肪酶已經(jīng)有大量的報道[3-5], 但是游離的脂肪酶不易回收, 得不到重復(fù)利用, 因此其價值大打折扣, 限制了工業(yè)大規(guī)模的應(yīng)用。如果將高活性的脂肪酶固定在水不溶的載體上, 便可以重復(fù)利用, 并且改善其在有機試劑中的活性[6]。脂肪酶的固定化有廣泛報道[7-9], 固定化方法較為常見的有吸附法, 包埋法, 交聯(lián)法, 共價結(jié)合法[10-11]。其中吸附法是一種傳統(tǒng)且操作簡潔的方法, 這種方法固定化條件溫和, 成本低廉, 載體能再生, 操作簡單, 固定化酶活力高, 因此吸附法是固定化脂肪酶的一種重要方法。樹脂是一類表面疏水性載體, 理化性質(zhì)穩(wěn)定, 具有較大的孔徑和比表面積,可以通過氫鍵和疏水作用力與酶分子結(jié)合, 因此對酶的結(jié)構(gòu)影響小, 同時樹脂價格低廉, 故非常適合用于脂肪酶的固定化[12]。

本研究以海洋脂肪酶ADM47601為研究對象,該脂肪酶來源于海洋微生物菌株Bohaisea-9145, 是一種低溫海洋脂肪酶, 對于中長鏈的酯類底物有較強的水解作用, 在低溫環(huán)境中能夠保持較好的活性,同時作用pH和溫度范圍較廣, 顯示出良好的酶學(xué)特性及應(yīng)用潛力[13]。故本研究以工業(yè)常用陰離子交換樹脂D316為載體對脂肪酶ADM47601固定化, 并對固定化條件進行探索, 進而研究了固定化酶性質(zhì),為工業(yè)化經(jīng)濟高效地應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

海洋脂肪酶ADM47601, 由黃海水產(chǎn)研究所酶工程實驗室自行研制。乙醇, 丙酮, 氫氧化鈉, 鹽酸,氯化鈉, 磷酸氫二鈉, 磷酸二氫鈉, TritonX-100, 異丙醇, 均為分析純, 購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。對硝基苯基月桂酸酯(4-Nitrophenyl dodecanoate),分析純, 購自SIGMA公司。各類樹脂購自山東魯抗立科藥業(yè)有限公司。

SHIMADZU UV2550紫外可見光分光光度計,全溫搖床(太倉實驗設(shè)備廠), ORION Model 818 pH計, LKB2219恒溫水浴箱, 循環(huán)水式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司), 真空冷凍干燥機(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 載體樹脂及其預(yù)處理

選擇21種工業(yè)應(yīng)用廣泛的樹脂, 陰離子交換樹脂: D380、D316、D345、D941、D900、WDA, 陽離子交換樹脂: DK110、D113、110、D152、001×7、SPJ、LKC150, 大孔吸附樹脂: D3520、NKA、CAD-40、DM18、DM1180、CD-180、AB-8、S-8。

陰離子交換樹脂: 將樹脂用70%乙醇浸泡24 h后抽濾, 水洗至流出清水, 用5%鹽酸浸泡6 h后抽濾, 水洗至pH7.0, 再用5%NaOH浸泡6 h后抽濾,水洗至pH7.0, 備用; 陽離子交換樹脂: 將樹脂用70%乙醇浸泡24 h后抽濾, 水洗至流出清水, 用5%NaOH浸泡6 h后抽濾, 水洗至pH7.0, 再用5%鹽酸浸泡6 h后抽濾, 水洗至pH7.0, 備用; 大孔吸附樹脂: 采用乙醇、丙酮、去離子水交替處理3 h后抽濾, 水洗至pH7.0, 備用[14]。

1.2.2 脂肪酶的固定化

首先采用單因素對比實驗法, 分別進行載體樹脂選擇, 加酶量, 溫度, 時間, pH的優(yōu)化實驗。稱取一定量的脂肪酶ADM47601溶解于10 mL一定pH值的磷酸緩沖液中, 并倒入100 mL三角瓶中, 加入一定量的載體樹脂, 于10～50℃, 震蕩1～8 h。抽濾分離上清液和固定化酶, 同種緩沖液清洗固定化酶后,真空冷凍干燥8 h, 4℃密封保存?zhèn)溆?。然后根?jù)單因素實驗結(jié)果進行正交試驗和方差分析, 確定最佳固定化條件。

1.2.3 酶學(xué)性質(zhì)測定方法

固定化酶酶學(xué)性質(zhì)測定以對硝基苯基月桂酸酯為底物, 通過改變反應(yīng)體系的某一條件(pH、溫度等),來測定不同條件對固定化酶水解底物的影響, 同時其他的反應(yīng)條件不變。穩(wěn)定性測定時, 將固定化酶置于不同的環(huán)境中1 h, 再測定其活性。催化反應(yīng)動力學(xué),運用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk), 以1/[S]為橫坐標, 1/V為縱坐標作圖, 計算可得Km和Vmax值。

1.3 分析方法

1.3.1 脂肪酶活力測定

pNPP法[15], 游離酶的測定按照Hatzinikolaou的方法略作修改。將3 mL含0.25%TritonX-100的磷酸鈉鹽緩沖液(pH8.0)與0.2 mL含0.6 mmol的對硝基苯基月桂酸酯-異丙醇溶液混勻預(yù)熱后, 加入0.2 mL脂肪酶液, 35℃反應(yīng)6 min, 加入4 mL乙醇終止反應(yīng),在410 nm下測定其吸光值。使用等量煮沸滅活的酶液作為空白對照。將1 min內(nèi)催化底物水解生成1 μmol脂肪酸所需的酶用量定義為1單位酶活力(U)。

脂肪酶在適宜的條件下, 可以將底物對硝基苯基月桂酸酯等摩爾水解為呈黃色物質(zhì)對硝基酚, 對硝基酚在410 nm處有特定吸收, 故通過測定產(chǎn)物對硝基酚的含量即可得到標準曲線: Y=0.0146X+0.0237, R2=0.9982, 其中Y為樣品410 nm吸光度, X為對硝基酚的含量。

固定化酶活力測定, 稱取一定量干燥的固定化酶代替游離酶加入反應(yīng)體系, 其余按照游離酶測定方法測定, 以固定化載體作為空白對照。將1 min內(nèi)催化底物水解生成1 μmol脂肪酸所需的酶用量定義為1個酶活力單位(U)。

式中X: 產(chǎn)物對硝基酚的含量(g/L); V: 反應(yīng)體積(mL); N: 稀釋倍數(shù); M: 對硝基酚的摩爾質(zhì)量; t: 反應(yīng)時間(min)。

1.3.2 脂肪酶活力回收率

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化載體的選擇

不同固定化載體的物理化學(xué)性質(zhì)是影響酶催化能力的重要因素, 在相同的固定化條件下(載體3 g,脂肪酶30 000 U, 20℃, 100 r/min, pH7.0, 5 h)各樹脂載體固定化效果見表1。

由表可見離子交換型樹脂比大孔吸附型樹脂效果好, 而陰離子交換樹脂的固定化效果優(yōu)于陽離子交換樹脂。D316為弱堿性陰離子交換樹脂, 結(jié)構(gòu)骨架為丙烯酸系。D316型樹脂作為載體, 固定化的效果最好, 可能原因是D316型樹脂表面的弱極性使脂肪酶與非極性的底物油脂分子存在較強作用力, 酶蛋白進行催化時酶分子與底物的相互作用得以增強。另外其樹脂顆粒細小, 從而使比表面積增大, 單位面積內(nèi)能夠與底物有更大的作用面積。因此, 選取D316型樹脂作為脂肪酶的固定化載體。

表1 不同樹脂載體的固定化效果Tab.1 The effect of different resins on immobilization

2.2 固定化條件優(yōu)化

2.2.1 加酶量對固定化影響

相同固定化條件下(載體3 g, 20℃, 100 r/min, pH7.0, 5 h), 不同加酶量(10 000, 20 000, 30 000, 40 000, 50 000 U)固定化效果見圖1。在加酶量為30 000 U時, 隨著加酶量的增加, 固定化酶活力基本不再提升, 顯然此時已經(jīng)達到最大載酶量, 因此加酶量選擇30 000 U。

圖1 加酶量對固定化效果的影響Fig. 1 The effect of enzyme amount on immobilization

2.2.2 溫度對固定化影響

在相同的固定化條件下(載體3 g, 脂肪酶30 000 U, 100 r/min, pH7.0, 5 h), 不同溫度(10, 20, 30, 40, 50℃)固定化效果見圖2。在20℃和30℃時結(jié)果比較接近, 因此加入25℃的情況。在20～30℃范圍內(nèi)固定化效果較好。

圖2 溫度對固定化效果的影響Fig. 2 The effect of temperature on immobilization

2.2.3 時間對固定化影響

在相同的固定化條件下(載體3 g, 脂肪酶30 000 U, 25℃, 100 r/min, pH7.0), 不同時間(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 h)固定化效果見圖3?？梢钥闯? 3 h后固定化酶活力不再增加, 因此將固定化時間定為3 h。

圖3 時間對固定化效果的影響Fig. 3 The effect of time on immobilization

2.2.4 轉(zhuǎn)速對固定化影響

在相同的固定化條件下(載體3 g, 脂肪酶30 000 U, 25℃, pH7.0, 3 h), 不同轉(zhuǎn)速(50, 100, 150, 200, 250 r/min)固定化效果見圖4。在高于100 r/min后轉(zhuǎn)速對固定化效果影響不大, 高于200 r/min后可能轉(zhuǎn)速太大, 導(dǎo)致樹脂小球不同程度的破損, 使固定化酶活力下降。

2.2.5 pH對固定化影響

在相同的固定化條件下(載體3 g, 脂肪酶30000 U, 25℃, 100 r/min, 3 h), 不同pH(6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0)固定化效果見圖5。在中性偏堿的條件下固定化酶活力較高。

圖4 轉(zhuǎn)速對固定化效果的影響Fig. 4 The effect of rotation speed on immobilization

圖5 pH對固定化效果的影響Fig. 5 The effect of pH on immobilization

2.2.6 正交實驗與分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果可知, 影響固定化效果的條件有pH、溫度、轉(zhuǎn)速、時間及加酶量等因素, 其中時間和加酶量對固定化的影響清晰明了, 對實驗結(jié)果的影響穩(wěn)定, 故不帶入正交試驗, 因此選定主要影響因素為pH(A)、溫度(B)和轉(zhuǎn)速(C), 其他操作參數(shù)固定不變, 選擇L9(34)正交表安排正交試驗, 結(jié)果見表2。

由正交試驗結(jié)果和方差分析(表3)可知, 9組正交試驗的最優(yōu)條件為A2B2C3, 即pH為7.5, 溫度25℃, 轉(zhuǎn)速150 r/min。各因素對結(jié)果的影響次序為: C＞A＞B, 即轉(zhuǎn)速為固定化的主要影響因素, pH次之,溫度對固定化影響最小。按照最優(yōu)條件進行驗證實驗, 酶活力回收率為65.53%±1.06%, 證明正交試驗得出的結(jié)果合理可行。

2.3 固定化酶的性質(zhì)

2.3.1 固定化酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

在pH5.0～9.0的條件下, 測定固定化脂肪酶和游離酶的活性, 固定化最適pH實驗中設(shè)定最適pH活力為100%, 計算其他pH條件下的相對酶活。圖6顯示固定化酶的最適pH為7.5, 相較于游離酶減小了0.5。在pH穩(wěn)定性實驗中, 設(shè)定pH8.0的酶活力為100%, 計算其他pH條件下的相對酶活。如圖7所示, 固定化酶和游離酶在貯存1 h后, 均在pH為8時穩(wěn)定性最高。同時可以看出在不同pH時, 固定化酶的耐受性都比游離酶好。固定化酶在pH6.0～9.0內(nèi)其活力均保持在85%以上, 游離酶只在pH7.0～9.0內(nèi)能夠保持85%以上。

表2 固定化正交試驗結(jié)果Tab. 2 Results of orthogonal test for immobilization

表3 方差分析Tab. 3 Analysis of variance

圖6 固定化酶的最適pHFig. 6 The optimal pH of immobilized enzyme

圖7 固定化酶的pH穩(wěn)定性Fig. 7 The pH stability of immobilized enzyme

2.3.2 固定化酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在20, 30, 35, 40, 45, 50, 55℃的條件下, 測定固定化酶和游離酶的活性, 固定化最適溫度實驗中設(shè)定其對應(yīng)的酶活力為100%, 計算其他溫度條件下的相對酶活。圖8顯示固定化酶的最適溫度為40℃, 而游離酶為35℃。在溫度穩(wěn)定性實驗中, 設(shè)定20℃對應(yīng)的酶活力為100%, 計算其他溫度條件下的相對酶活。如圖9所示, 固定化酶和游離酶在不同溫度貯存1 h后, 固定化酶的活力都要比游離酶高。由此可見,固定化脂肪酶在低溫下有較高的活性, 且可以保持較高的穩(wěn)定性。

圖8 固定化酶的最適溫度Fig. 8 The optimal temperature of immobilized enzyme

圖9 固定化酶的溫度穩(wěn)定性Fig. 9 The temperature stability of immobilized enzyme

2.3.3 固定化酶的貯藏穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性

將D316型樹脂固定化脂肪酶和游離酶分別于25℃的環(huán)境中貯存, 每隔5 d取樣測定活力。從圖10中發(fā)現(xiàn), 固定化酶在貯藏25 d后依舊能夠保持73%的活性, 游離酶25 d后可以保持60%的活性。按照半衰期計算公式可知, 固定化酶貯藏半衰期為55 d,游離酶為34 d。

以對硝基苯基月桂酸酯為底物, 重復(fù)測定固定化酶的活力, 結(jié)果如圖11所示, 按照半衰期計算公式可以得到固定化酶操作半衰期為11次。

2.3.4 常用有機試劑對固定化酶的影響

圖10 固定化酶的貯藏穩(wěn)定性Fig. 10 The storage stability of immobilized enzyme

圖11 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig. 11 The operational stability of immobilized enzyme

將固定化脂肪酶在水、甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇、叔丁醇、正己烷、正丁醇中貯存1 h后分別測定其活力。圖12表明, 固定化酶在正己烷中活力最高為95%, 在叔丁醇中能夠保持92%以上的活力。游離酶在叔丁醇中活力最高為84%, 在正己烷中也能夠保持79%的活力。在不同有機試劑中, 固定化酶的活力均比游離酶的高。

圖12 有機試劑對固定化酶的影響Fig. 12 The effect of organic reagents on immobilized enzyme

2.3.5 固定化脂肪酶催化反應(yīng)動力學(xué)

根據(jù)圖13得到的回歸方程, 經(jīng)過計算可知固定化脂肪酶Km和Vmax值分別為4.86×10–5mol/L和1.31×10–5mol/(L·min), 同樣方法測的游離酶的Km和Vmax值分別為3.75×10–5mol/L和1.39×10–5mol/(L·min)。從結(jié)果看, 固定化后脂肪酶在底物親和力上相對游離酶有所下降, 可能由于固定化處理后, 酶蛋白與載體結(jié)合, 對酶的活性中心產(chǎn)生部分影響, 在立體空間上形成位阻, 影響酶活性中心的擴散和作用,使酶的催化速率產(chǎn)生降低的情況。

圖13 固定化酶的Km和Vmax值。Fig. 13 The Kmand Vmaxvalues of immobilized lipase

3 討論與結(jié)語

經(jīng)過固定化處理的脂肪酶最大的特點是能夠多次利用, 增加利用的效率, 同時其他的性質(zhì)也會發(fā)生相應(yīng)的變化, 例如作用溫度、作用pH、對金屬離子及有機試劑的敏感度等, 這些表觀的性質(zhì)變化原因來自于脂肪酶分子與載體(如樹脂)顆粒的相互作用。有些酶分子會與載體通過共價鍵結(jié)合, 這種結(jié)合比較緊密, 但酶活性相抵; 有些酶分子能夠通過氫鍵或疏水作用力與載體吸附, 這種情況固定化酶的活力得到保證, 但酶分子與載體聯(lián)系不緊密, 重復(fù)利用性不如共價結(jié)合的方式。無論哪種方法通常情況下, 一般相較于游離酶, 固定化酶的Vmax值會減小、Km值會增大, 這是由于酶分子的活性中心若被部分掩埋于載體中, 結(jié)果必然使活性下降、酶與作用底物的親合力降低。因此, 保證固定化酶的低活力損失是固定化處理的關(guān)鍵, 在此基礎(chǔ)上提高其重復(fù)使用次數(shù)和不同環(huán)境下固定化酶的穩(wěn)定性決定了固定化效果的好壞。

本研究針對實驗室前期研究得到海洋脂肪酶ADM47601[13,16-17], 篩選了6種陰離子交換樹脂、7種陽離子交換樹脂、8種大孔吸附樹脂共21種樹脂對脂肪酶進行了固定化, 選擇效果最好的D316陰離子交換樹脂, 通過正交實驗進一步研究了D316型樹脂固定化的最佳條件為每克載體加酶量10 000 U, pH7.5, 25℃, 150 r/min, 固定化3 h。此時固定化酶活力回收率最高, 達到65.53%±1.06%。且研究了固定化脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì), 其最適作用pH為7.5, 在pH6.0～9.0的范圍內(nèi)能夠保持85%的活力。最適作用溫度為40℃, 在50℃下貯存1 h后依然保持66%的活力。室溫保存半衰期為55 d, 操作8次仍然能維持60%的活性, 且在多種有機試劑中能夠穩(wěn)定的保持活性。固定化脂肪酶Km和Vmax值分別為4.86×10–5mol/L和1.31×10–5mol/(L·min), 對底物親和性較好。得到的固定化脂肪酶相比游離酶有著廣泛的pH和溫度適應(yīng)性, 且具有較高的有機溶劑適應(yīng)性, 為工業(yè)擴大化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Research on immobilization of lipase ADM47601 from marine microorganisms by resin

SUN Guo-long1,2, MA Zi-bin2, HAO Jian-hua2, SHENG Jun2, SUN Mi2
(1. College of food science and engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Qingdao 266071, China)

Jul.17, 2016

Lipase; Resin; Immobilization; Enzymatic property

The effect of different resins on immobilizing lipase ADM47601 was investigated in this study. A total of 21 types of resins were screened, and the anion-exchange resin D316 demonstrated the best immobilization. After the orthogonal test, the recovery ratio of enzyme activity reached up to 65.53% ± 1.06% under optimal conditions: 10000U lipase per 1g resin, pH7.5, 25℃, 150r/min and 3 h for immobilization. The optimal pH of immobilized lipase was 7.5, and it exhibited 85% of the maximum activity in the range of pH6.0–9.0. The optimal temperature was 40℃, and the activity was maintained at 66% after 1 h of storage at 50℃. At 25℃, the half-life was 55 days and the residual activity was still higher than 60% after utilizing the lipase 8 times. The immobilized lipase can maintain activity in various organic reagents, and its Kmand Vmaxvalues were 4.86 × 10?5mol/L and 1.31 × 10?5mol/(L·min), respectively, indicating high affinity to the substrate.

Q814

A

1000-3096(2017)04-0057-08

10.11759/hykx20160717001

(本文編輯: 康亦兼)

2016-07-17;

2016-09-14

國家自然科學(xué)基金-聯(lián)合基金(U1406402-5); 國際科技合作與交流專項(2014DFG30890); 國家實驗室-鰲山科技計劃(2015ASKJ02-06) [Foundation: National Science Foundation-Shandong province Joint Fund (U1406402-5); International Science and Technology Cooperation and Exchanges (2014DFG30890); The Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02)]

孫國龍(1988-), 男, 山東濰坊人, 碩士研究生, 主要從事海洋微生物酶工程研究, E-mail: lee29001@sina.com; 孫謐, 通信作者, 研究員, 博士生導(dǎo)師, E-mail: sunmi@ysfri.ac.cn