羅曉琴，韓深，萬宇平，王佩月，崔廷婷

(1. 北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2. 北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京 102206；3. 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，北京 100026)

紅霉素酶聯(lián)免疫試劑盒在環(huán)境水樣中的檢測效果評價

羅曉琴1,2，韓深3，萬宇平1,2，王佩月3，崔廷婷1,2

(1. 北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2. 北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京 102206；3. 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，北京 100026)

通過檢測酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測限、精密度、準備度、交叉反應率等各項技術(shù)參數(shù)，并將其精密度和準確度與HPLC法做對比，以評價ELISA方法對環(huán)境水樣中紅霉素殘留的檢測效果。結(jié)果表明：紅霉素ELISA試劑盒的檢測限為1μg/L；試劑盒工作范圍為0.2～16.2μg/L；精密度、準確度結(jié)果與HPLC法一致；且試劑盒使用方便、前處理簡單、檢測耗時短(55 min)、成本低，適用于現(xiàn)場篩查和水質(zhì)監(jiān)控，可滿足對環(huán)境水樣中紅霉素殘留的快速檢測。

紅霉素測定；酶聯(lián)免疫試劑盒；檢測效果；HPLC；環(huán)境水樣

紅霉素是由紅霉素鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯系的代表性抗菌素。作用機制在于其主要與核糖核蛋白體的50S亞單位相結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶，影響核糖核蛋白體的移位過程，妨礙肽鏈增長，抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，是抑菌劑。因此廣泛應用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細菌性疾病的治療和防治[1]。

由于紅霉素在動物體內(nèi)代謝時間較長，因此不可避免地在動物體內(nèi)產(chǎn)生殘留，給人畜帶來危害[2,3]。同時，紅霉素經(jīng)動物體代謝后大部分以母體化合物或代謝體的形式經(jīng)動物糞便和尿液排出體外，進入環(huán)境介質(zhì)。水中的沉積物是紅霉素的主要富集場所，水生動植物(如水草、斑馬魚等)也對紅霉素表現(xiàn)出一定的吸收富集能力[4]，通過食物鏈被人體吸收后蓄積在肝、腎中，給人類帶來毒副作用，如腹瀉、惡心、嘔吐、過敏反應等[5]。

雖然目前紅霉素在環(huán)境水樣中的最大殘留限量沒有明確規(guī)定，但我國農(nóng)業(yè)部235號公告[6]和歐盟EC1181/2002[7]規(guī)定紅霉素在動物組織中的最大殘留限量為 200 μg/kg，另外美國規(guī)定豬可食性組織中的紅霉素最高殘留限量為100 μg/kg，日本規(guī)定水生動物中紅霉素最高殘留限量為200μg/kg[8]。

目前，紅霉素殘留檢測主要應用高效液相色譜法(HPLC)[9-11]、薄層色譜法[12]、液相色譜-質(zhì)譜法[5,13,14]、微生物法[15,16]和酶聯(lián)免疫法(ELISA)[3,17]，檢測樣本一般包括蜂蜜、牛奶、畜禽組織、水產(chǎn)品(魚、蝦)等。對于環(huán)境中殘留抗生素的檢測主要采用液相色譜-質(zhì)譜法、分光光度法、離子液體體系萃取、雙水相體系萃取等[18-23]，但有關(guān)環(huán)境水樣中紅霉素殘留酶聯(lián)免疫檢測方法的研究未見報道。本文旨在對檢測環(huán)境水樣中紅霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測效果進行評價，以期實現(xiàn)紅霉素殘留的現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的定量篩查。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料和儀器

水樣；紅霉素、硫氫酸紅霉素、琥乙紅霉素、泰樂菌素、替米考星、螺旋霉素、北里卡星等標準品(中國藥品生物制品檢定所)；紅霉素殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(北京勤邦生物技術(shù)有限公司)。

MK3酶標儀(上海雷勃分析儀器有限公司)、渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、微量移液器(美國Thermo)、DHP-600生化培養(yǎng)箱 (天津市中環(huán)實驗電爐)、Milli-Q Reference 純水儀(美國Millipore公司)、高效液相色譜儀(美國Thermo)、電子天平(美國Setra)、振蕩器(上海躍進醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

取水樣100μL至2mL離心管中，加入400μL復溶工作液，用渦旋儀充分渦動，混勻；取50μL用于分析。

1.2.2 樣品檢測

將所有試劑與酶標板放實驗桌上回溫至室溫(20～25℃)；將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行；向包被有紅霉素抗原的酶標板微孔中加入50mL/孔的系列濃度標準品或樣本，然后加入酶標二抗50mL/孔，再加入抗體工作液50mL/孔，輕輕振蕩混勻后，置于37℃避光環(huán)境中反應40min；洗滌4～5次，每次間隔10s，倒掉洗滌液，用吸水紙拍干；加入底物液A液、B液各50mL/孔，振蕩搖勻后置于37℃避光環(huán)境中反應15min；加入終止液50mL/孔，振蕩搖勻，用酶標儀測定每孔的吸光度值(OD450)。

1.2.3 結(jié)果計算

標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的平均吸光度值除以第一個標準品(0標準)的平均吸光度值，再乘以100%；以各標準品百分吸光率為縱坐標，各標準品濃度的對數(shù)(lg[C])為橫坐標繪制標準曲線，從標準曲線中查出百分吸光率為50%時對應的紅霉素濃度，即為IC50。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中紅霉素的實際濃度[24]。

1.2.4 試劑盒技術(shù)參數(shù)評價

精密度和準確度測定。按2μg/L、5μg/L兩個濃度的紅霉素對環(huán)境水樣進行添加回收測定，以回收率作為準確度評價指標，重復測定某一濃度樣品的檢測結(jié)果相對標準偏差(RSD%)作為精密度評價指標。每個樣品做10個平行，用3批不同試劑進行測定，分別計算回收率及批內(nèi)、批間相對標準偏差。

特異性測定。選擇與紅霉素具有類似結(jié)構(gòu)的硫氰酸紅霉素、琥乙紅霉素、泰樂菌素、替米考星、螺旋霉素、北里卡星進行ELISA測定，通過各種藥物的標準曲線分別得到其50%抑制濃度(IC50)，根據(jù)公式：交叉反應率(%)=IC50(紅霉素)/IC50(類似物)×100%，計算試劑盒對其他藥物的交叉反應率，從而反映其特異性。

1.2.5 試劑盒與儀器方法比對

分別按照高效液相色譜和試劑盒檢測提供的方法，對空白水樣進行紅霉素添加回收試驗，比較兩種方法的回收率和變異系數(shù)(在試劑盒檢測方法中，隨機選取3塊酶標板，每塊板做4個平行)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

分別測定0 μg/L、0.2 μg/L、0.6 μg/L、1.8 μg/L、5.4 μg/L、16.2 μg/L濃度的標準品的吸光度值，以標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，百分吸光率為縱坐標，建立紅霉素標準曲線如圖1所示，同時建立雙對數(shù)直線擬合曲線如圖2所示。實驗表明，標準曲線的范圍為0.2～16.2μg/L，IC50為0.6 μg/L；線性方程為y=-2.374x-0.410，相關(guān)系數(shù)R2=0.994，說明ELISA試劑盒線性關(guān)系良好。

2.2 檢測限的測定

酶聯(lián)免疫試劑盒對20份空白水樣的測定結(jié)果見表1。由表1可以看出：本試劑盒對環(huán)境水樣的檢測限為1μg/L。

2.3 樣本精密度和準確度的測定

按2μg/L、5μg/L兩個濃度的紅霉素對環(huán)境水樣進行添加回收測定，平均回收率在70%～110%，說明該方法準確性較高；批內(nèi)、批間相對標準偏差均<10%，說明該試劑盒精密度良好。

表1 紅霉素試劑盒檢測限試驗

2.4 特異性的測定

選擇與紅霉素具有類似結(jié)構(gòu)的硫氰酸紅霉素、琥乙紅霉素、泰樂菌素、替米考星、螺旋霉素、北里卡星進行ELISA測定，測得各種藥物的IC50及交叉反應率見表2。

表2 紅霉素抗體與其他類似結(jié)構(gòu)藥物交叉反應率實驗

由表2可知，由于硫氰酸紅霉素、琥乙紅霉素、紅霉素均屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，而硫氰酸紅霉素是紅霉素的硫氰酸鹽，是合成紅霉素的初始原料，琥乙紅霉素是紅霉素的琥珀酸乙酯，因此，硫氰酸紅霉素、琥乙紅霉素的交叉反應率較高，分別為114%、67.4%；而泰樂菌素、替米考星、螺旋霉素、北里卡星的交叉反應率均低于0.1%，說明試劑盒與其他類似結(jié)構(gòu)藥物無交叉反應，特異性較強。

2.5 試劑盒與儀器方法比對

以100μg/L濃度對空白水樣進行紅霉素添加回收試驗，儀器檢測方法和試劑盒檢測方法測得的回收率和變異系數(shù)見表3。

表3 ELISA試劑盒與儀器方法精密度和準確度比較結(jié)果

由表3可知，儀器檢測方法的回收率為82.2%～95.7%，平均回收率為91.1%，變異系數(shù)為6.7%；同樣添加濃度，試劑盒所測得的回收率為79.8%～100.5%，平均回收率為92.4%，變異系數(shù)為5.5%，說明ELISA法與儀器檢測結(jié)果基本一致，該方法可用于環(huán)境水樣中紅霉素的殘留檢測。

3 討論

本研究通過檢測酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測限、精密度、準備度、交叉反應率等各項技術(shù)參數(shù)，并將其精密度和準確度與HPLC法做對比，以評價ELISA方法對環(huán)境水樣中紅霉素殘留的檢測效果。結(jié)果表明：紅霉素ELISA試劑盒的檢測限為1μg/L；試劑盒工作范圍為0.2～16.2μg/L；精密度、準確度結(jié)果與HPLC法一致；且本試劑盒使用方便、前處理簡單、檢測耗時短(55min)、成本低，適用于現(xiàn)場篩查和水質(zhì)監(jiān)控，可滿足對環(huán)境水樣中紅霉素殘留的快速檢測。

[1]于慧娟, 蔡友瓊, 惠蕓華, 等. 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中紅霉素的殘留[J]. 分析化學, 2009, 37(1): 91-94.

[2] Horie M, Saito K, Ishii R, et al. Simultaneous determination of five macrolide antibiotics in meat by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 1998, 812(1-2): 295-302.

[3]何方洋, 郗日沫, 萬宇平, 等. 紅霉素藥物殘留檢測技術(shù)的研究進展[J]. 四川畜牧獸醫(yī), 2010, 37(3): 31-33.

[4]伍銀愛, 楊琛, 唐婷, 等. 紅霉素在模擬水生生態(tài)系統(tǒng)中的分布特征[J]. 環(huán)境科學學報, 2015, 35(3): 897-902.

[5]于慧娟, 馬兵, 惠蕓華, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中紅霉素的殘留[J]. 分析試驗室, 2009, 28(3): 51-54.

[6]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部公告第235號動物性食品中獸藥最高殘留限量[S]. 2002.

[7]Official Journal of the European Communities Com-mission Regulation[S]. No.1181/2002.

[8]McGlinchey T A, Rafter P A, Regan F, et al. A review of analytical methods for the determination of aminoglycoside and macrolide residues in food matrices[J]. Analytica Chimica Acta, 2008, 624(1): 1-15.

[9]惠蕓華, 于慧娟, 蔡友瓊, 等. 羅非魚中紅霉素殘留量的高效液相色譜法的測定[J]. 海洋漁業(yè), 2006, 28(4): 321-325.

[10]于慧娟, 沈曉盛, 李慶, 等. 高效液相色譜-熒光法測定對蝦組織中紅霉素的殘留量[J]. 分析試驗室, 2006, 25(4): 82-85.

[11]Hanada E, Ohtani H, Kotaki H, et al. Determination of erythromycin concentrations in rat plasma and liver by high-performance liquid chromatography with amperometric detection[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1997, 692(2): 478-482.

[12]韓南銀, 周婷. 蜂蜜中紅霉素殘留量的檢測[J]. 食品科學, 2003, 24(2): 118-120.

[13]Dubois M, Fluchard D, Sior E, et al. Identification and quantification of five macrolide antibiotics in several tissues, eggs and milk by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 2001, 753(2): 189-202.

[14]Benetti C, Piro R, Binato G, et al. Simultaneous determination of lincomycin and five macrolide antibiotic residues in honey by liquid chromatography coupled to electrospray ionization mass spectrometry (LC-MS/MS)[J]. Food Additives and Contaminants, 2006, 23(11): 1099-1108.

[15]趙靜, 李熠.蜂產(chǎn)品檢測實用技術(shù)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2005: 230-233.

[16]劉功良, 趙曉娟, 陳藝琦, 等. 微生物抑制法快速檢測鮮牛乳中紅霉素殘留[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報, 2014, 5(6): 1751-1756.

[17]崔廷婷, 鐘建三, 張瑜, 等. 動物源性食品中紅霉素殘留的ELISA檢測[J]. 四川畜牧獸醫(yī), 2015, 42(1): 29-31.

[18]李曉娟. 固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對杭州市不同水環(huán)境中13種痕量藥物殘留狀況的檢測及分析[D]. 杭州：浙江大學, 2011.

[19]賈云宏, 李華侃, 李東輝. 茜素紅的荷移反應測定紅霉素[J]. 數(shù)理醫(yī)藥學雜志, 2003, 16(1): 69-70.

[20]王良, 閻永勝, 朱文帥, 等. 離子液體溶劑浮選-光度法測定水中痕量四環(huán)素類抗生素[J]. 分析化學, 2009, 37(1): 72-76.

[21]茹靜. 離子液體萃取分離、分析環(huán)境中殘留紅霉素的實驗研究[D]. 西安：長安大學, 2010.

[22]劉慶芬, 胡雪生, 王玉紅, 等. 離子液體雙水相萃取分離青霉素[J]. 科學通報, 2005, 50(8): 756-759.

[23]劉培元, 王國平. 離子液體/鹽雙水相萃取技術(shù)的研究進展[J]. 化學工程與裝備, 2008 (3): 113-118.

[24]楊利國, 胡少昶, 魏平華, 等. 酶聯(lián)免疫技術(shù)[M]. 江蘇: 南京大學出版社, 1998.

Evaluation on the Detection Effect of Erythromycin Enzyme-linked ImmunosorbentAssay Kit in Environmental Water

LUO Xiao-qin1,2, HAN Shen3, WAN Yu-ping1,2, WANG Pei-yue3, CUI Ting-ting1,2

(1. Beijing Kwinbon Biotechnology Co. Ltd., Beijing 102206, China)

New type of flue-cured tobacco chamber combines air-source heat pump water heater and solar energy heater. The comparative tests were done between new type chamber and old style of auto adding charcoal chamber. The results showed that using new type chamber would save 48.2% of energy. Meanwhile, the economic benefits would be 115 Yuan, which was higher than the old style chamber. Some constructive suggestions were put forward in order to popularize the new technology, Such as controlling the cost and popularizing it region by region on purpose of constructing the infrastructure.

flue-cured tobacco; flue-cured; new energy; energy saving; the South of Anhui

2017-02-16

北京市科技計劃課題(Z151100002115059)。

羅曉琴(1984-)，女，副高級工程師，本科，主要從事食品安全快速檢測工作。

萬宇平。

X832

A

1673-9655(2017)04-0072-04