許晴 穆梁麗 冀愛(ài)青

摘要[目的]建立有效的瀕危藥材金線蓮的再生體系，為其工廠化生產(chǎn)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。[方法]選取福建金線蓮的葉片、莖片、帶節(jié)莖段、不定芽為外植體，建立無(wú)菌體系，而后以愈傷組織的誘導(dǎo)率為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化不同外植體各階段（愈傷組織的誘導(dǎo)和分化）培養(yǎng)基中激素的種類及濃度。[結(jié)果]在試驗(yàn)的福建金線蓮4種外植體中，不定芽的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可達(dá)96.67%，其最適培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L BA+0.3 mg/L KT。在此培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)的愈傷組織在分化培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L BA和增殖培養(yǎng)基MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA上繼代形成了無(wú)根試管苗。[結(jié)論]該研究建立的無(wú)菌繁殖體系，解決了前人所指出的金線蓮愈傷組織誘導(dǎo)率極低的瓶頸問(wèn)題，組培成苗的效率有較大提高。

關(guān)鍵詞金線蓮；不定芽；愈傷組織；分化成苗

中圖分類號(hào)S567.23+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）14-0103-04

Abstract[Objective] The research aimed to establish an effective recycling system for Anoectochilus roxburghii， and lay the technical foundation for its industrial production. [Method] As explant of leaf， stem， stem segment with node and adventitious bud of Anoectochilus roxburghii， the aseptic system was established， and then the induction rate of callus was used as an index to optimize the type and concentration of hormones in the culture medium of different explants （callus induction and differentiation） by orthogonal design.[Result]In the test of Anoectochilus roxburghii， four explants， the callus induction rate of adventitious bud was the highest， up to 96.67%， the optimum medium formula was MS+0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L BA+0.3 mg/L KT. On the basis of the medium， the callus was subcultured on the differentiation medium（MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L BA） and the proliferation medium （MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA） to form a rootless test tube.[Conclusion]Asepsis reproductive system has been established， which solves the bottleneck problem that the predecessors pointed out that the callus induction rate of Anoectochilus roxburghii was very low，the efficiency of tissue culture seedlings have greatly improved.

Key wordsAnoectochilus roxburghii；Adventitious buds；Callus；Seeding differentiation

金線蓮[Anoectochilus roxburghii（Wall.） Lindl]，別名金絲線、金耳環(huán)等，蘭科開(kāi)唇蘭屬多年生草本植物。金線蓮是我國(guó)珍稀瀕危的名貴藥材，素有“藥中之王”之稱，其全草均可入藥，有清熱涼血、祛風(fēng)利濕、解毒、止痛、鎮(zhèn)咳等功效。近年來(lái)，金線蓮在治療高血壓、糖尿病及腫瘤等疑難病癥方面日益引起醫(yī)藥界的重視，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。金線蓮的種子不易萌發(fā)，用傳統(tǒng)的實(shí)生繁殖相當(dāng)困難，且其栽培對(duì)生態(tài)環(huán)境要求嚴(yán)格，加之自然環(huán)境遭受嚴(yán)重破壞，生長(zhǎng)極其緩慢，且蟲(chóng)鳥(niǎo)等動(dòng)物喜食，自然資源稀少，導(dǎo)致市場(chǎng)價(jià)格昂貴，高達(dá)3 000～5 000元/kg，不利于金線蓮的推廣。而植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種無(wú)性繁殖的手段，可在短期內(nèi)提供大量?jī)?yōu)質(zhì)的試管苗，使其大面積推廣成為可能。目前，金線蓮的快速繁殖主要通過(guò)原球莖和叢生芽進(jìn)行培養(yǎng)物的大量繁殖[1-6]，而對(duì)愈傷組織的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。因?yàn)榍o段受腋芽影響不能大量擴(kuò)增，并且外植體的數(shù)目也有限，光靠原球莖和叢生芽進(jìn)行組織快繁遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。利用愈傷組織來(lái)培養(yǎng)可以對(duì)植物進(jìn)行快速繁殖，同時(shí)，也對(duì)植物改良、種質(zhì)保存有很大作用，這樣使得金線蓮的繁殖速度得到了最大化的提升。該試驗(yàn)采用金線蓮的不同組織（葉片、莖片、莖段及不定芽）作為外植體材料，通過(guò)愈傷誘導(dǎo)、分化、繼代、生根4個(gè)階段培養(yǎng)，形成大量?jī)?yōu)良試管苗，為金線蓮的規(guī)?；a(chǎn)提供可靠的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1供試材料選擇生長(zhǎng)旺盛、無(wú)病蟲(chóng)害的健壯金線蓮植株，摘取葉片、莖作為供試外植體材料。

1.2材料處理軟毛刷刷凈葉片、莖段、不定芽材料表面，放入小燒杯中罩上紗布后，流水沖洗30 min左右，置于超凈工作臺(tái)上，在75%酒精中浸泡30 s后，倒去酒精，再用0.1%HgCl2滅菌8 min，無(wú)菌水沖洗5～7次。將葉片切成0.5 cm2左右小塊，莖段切成1 cm左右小段和2 mm左右厚度的薄片，不定芽切下即可，無(wú)菌條件下接入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每瓶接4～6個(gè)外植體。

1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法以MS為基本培養(yǎng)基，以蔗糖30 g/L為碳源，用瓊脂4.2 g/L固化，pH調(diào)至5.8附加不同濃度水平的植物激素。分裝后，在121 ℃下濕熱滅菌20 min，放入無(wú)菌操作室。用SPSS軟件對(duì)6-BA、NAA、KT 3個(gè)因素多個(gè)濃度水平進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，并計(jì)算出誘導(dǎo)率：愈傷組織誘導(dǎo)率= 誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.4培養(yǎng)條件溫度22～26 ℃，光照時(shí)數(shù)12 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx。

2結(jié)果與分析

2.1金線蓮葉片誘導(dǎo)愈傷組織從表1可以看出，正交設(shè)計(jì)的三因素三水平的9個(gè)處理均未誘導(dǎo)出愈傷組織。

2.2金線蓮莖片誘導(dǎo)愈傷組織從表2可以看出，正交設(shè)計(jì)的三因素三水平的9個(gè)處理愈傷組織誘導(dǎo)率不同，其中處理5誘導(dǎo)率最高，達(dá)13.33%。根據(jù)極差分析得知，影響金線蓮莖片誘導(dǎo)愈傷組織最重要的激素為NAA，且最適配比為NAA（2）+BA（3）+KT（3），即0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。

2.3金線蓮莖段誘導(dǎo)愈傷組織從表3可以看出，正交設(shè)計(jì)的三因素三水平的9個(gè)處理愈傷組織誘導(dǎo)率明顯不同，其中處理5誘導(dǎo)率最高，達(dá)54.44%。根據(jù)極差分析得知，影響金線蓮莖段誘導(dǎo)愈傷組織最重要的激素為NAA，且最適配比為NAA（2）+BA（3）+KT（3），即0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。

2.4金線蓮不定芽誘導(dǎo)愈傷組織從表4可以看出，正交設(shè)計(jì)的三因素三水平的9個(gè)處理愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異，其中處理5誘導(dǎo)率最高，達(dá)96.67%。根據(jù)極差分析得知，影響金線蓮不定芽誘導(dǎo)愈傷組織最重要的激素為NAA，且最適配比為NAA（2）+BA（2）+KT（3），即0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。由圖1可知，不定芽接種在最適培養(yǎng)基中13 d，不定芽開(kāi)始膨脹擴(kuò)張，出現(xiàn)瘤狀結(jié)構(gòu)的小突起，呈奶黃色，有光澤；不定芽接種在最適培養(yǎng)基25 d，瘤狀突起不斷擴(kuò)大增加，形成大塊的愈傷組織，顏色呈青綠色，其頂部可見(jiàn)的球狀的乳白色突起；經(jīng)過(guò)反復(fù)繼代后，愈傷組織逐漸變小，4～5代后愈傷組織質(zhì)地松散，透明。

2.5金線蓮不定芽愈傷組織分化成苗將不定芽愈傷組織切塊接到不同的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，一段時(shí)間后觀察發(fā)現(xiàn)愈傷組織切塊邊緣出現(xiàn)不同數(shù)量的棕紅色芽點(diǎn)，第16天芽點(diǎn)地方長(zhǎng)成小芽（圖2a），小芽繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育形成小苗（圖2b），然后將無(wú)根試管苗在增殖培養(yǎng)基MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA上繼代移栽（圖3）。

3結(jié)論與討論

采用葉片、莖段、莖片及不定芽4種不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)不定芽的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可達(dá)96.67%，其次為莖段和莖片，最高誘導(dǎo)率分別達(dá)54.44%和13.33%；而葉片并未誘導(dǎo)出愈傷組織。其不定芽、莖段、莖片誘導(dǎo)愈傷組織較適的培養(yǎng)基分別為MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA、0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT和0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。

在以往的關(guān)于金線蓮組織培養(yǎng)的研究中，原球莖及叢生芽誘導(dǎo)的報(bào)道較多，但以不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織則鮮見(jiàn)報(bào)道。該試驗(yàn)得出采用不定芽作為外植體比葉片、莖段、莖片3種外植體的誘導(dǎo)率高，究其原因可能與不定芽在4種外植體中的分生能力最強(qiáng)有關(guān)，這與王雅英等[3]的研究結(jié)果一致。該試驗(yàn)中，葉片并未誘導(dǎo)出愈傷組織，且研究?jī)H限于愈傷組織的誘導(dǎo)、分化方面，在植株生根及愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)化等方面還有待進(jìn)一步研究。

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