蘇安梅， 余姝軼， 覃 秀， 沈彥伶， 鐘青梅， 王益林

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 廣西生物煉制重點實驗室， 廣西 南寧 530004)

基于碳量子點熒光恢復(fù)的三聚氰胺測定方法

蘇安梅， 余姝軼， 覃 秀， 沈彥伶， 鐘青梅， 王益林*

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 廣西生物煉制重點實驗室， 廣西 南寧 530004)

在碳量子點溶液中加入汞離子，量子點的熒光被猝滅，加入三聚氰胺后熒光恢復(fù)。據(jù)此，建立了基于碳量子點熒光恢復(fù)測定三聚氰胺的新方法并應(yīng)用于實際樣品的分析。研究結(jié)果表明，在汞離子和碳量子點濃度之比為15∶10000且碳量子點濃度為4.0 g/L、pH值為7.5的實驗條件下，方法的線性范圍為3.0～60.0 mg/L，檢出限(3σ/k)為2.2 mg/L。方法應(yīng)用于實際樣品測定時，其回收率為95%～103%。

碳量子點； 熒光恢復(fù)； 測定； 三聚氰胺

1 引 言

三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物。作為一種化工原料，最常見的用途是和甲醛作用生成耐高溫的樹脂材料[1]。但因含氮量高(66.6%)，白色無味，所以沒有簡單的檢測方法。在不法分子眼中，三聚氰胺是理想的食品和飼料中蛋白質(zhì)的冒充物。然而，三聚氰胺進(jìn)入體內(nèi)后不能被代謝，而是從尿液中排出。動物實驗也表明，長期食用三聚氰胺會產(chǎn)生以三聚氰胺為主要成分的腎結(jié)石和膀胱結(jié)石，因此，三聚氰胺對身體有害，不可用于食品添加物。自2008年以來，人們開始關(guān)注食品和動物飼料中三聚氰胺含量的檢測，其主要方法有氣質(zhì)聯(lián)用法[2]、酶聯(lián)免疫法[3]、拉曼光譜法[4]、電化學(xué)法[5]、紅外光譜法[6]和熒光光譜法[7]等。

碳量子點是一種新型熒光納米材料[8]，基于碳量子點的熒光猝滅分析法已應(yīng)用于無機(jī)金屬離子[9-14]和有機(jī)物[15-16]的定量測定。此外，碳量子點具有低的細(xì)胞毒性和良好的生物相容性，近年來，基于碳量子點熒光恢復(fù)的分析方法已應(yīng)用于葡萄糖[17]、抗壞血酸[18]、多巴胺[19]、半胱氨酸[20]、堿性磷酸酶[21]和去鐵鐵蛋白[22]等的分析檢測。本文以檸檬酸為碳源合成碳量子點，在合成的碳量子點中加入Hg2+使其熒光猝滅，再在體系中加入三聚氰胺溶液，碳量子點的熒光恢復(fù)，且三聚氰胺的濃度越高，熒光恢復(fù)程度越強(qiáng)。據(jù)此我們建立了一種基于碳量子點熒光恢復(fù)的三聚氰胺測定新方法。

2 實 驗

2.1 主要試劑與儀器

三聚氰胺(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯化高汞(分析純，貴州省銅仁汞礦化學(xué)試劑廠)；檸檬酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、三氯乙酸、乙腈(分析純，廣東光華科技股份有限公司)；氫氧化鈉(分析純，成都市科龍化工試劑廠)。

RF-5301熒光分光光度計(日本島津)；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；78-1磁力加熱攪拌器(金壇市雙捷實驗儀器廠)； H1850離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

2.2 實驗方法

2.2.1 碳量子點的制備

碳量子點的制備參照文獻(xiàn)[23]方法進(jìn)行：稱取4.0 g的檸檬酸于燒杯中，并放入已升溫至200 ℃的干燥箱中加熱20 min，取出后用1.0 mol/L NaOH溶液將其pH值調(diào)至7.0，然后轉(zhuǎn)移到200 mL容量瓶中并定容，得到20 g/L的碳量子點溶液(按檸檬酸計算)。

2.2.2 三聚氰胺的測定

在系列10 mL比色管中依次加入5.0 mL磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH=7.5)、2.0 mL碳量子點、48 μL Hg2+離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為1.25 g/L)和不同體積的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為3.0 g/L)，充分混勻后用去離子水定容至刻度，用RF-5301型熒光分光光度計測熒光強(qiáng)度(F)。同時做三聚氰胺試劑空白(F0)。測定時，激發(fā)波長選用370 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫都設(shè)置為5.0 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 測定原理

汞離子結(jié)合于碳量子點表面后，直接從光激發(fā)的碳量子點的導(dǎo)帶吸收電子，從而導(dǎo)致激發(fā)態(tài)電子不能有效回到價帶，即發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而使碳量子點熒光猝滅[12]。若能使汞離子脫離碳量子點表面，則導(dǎo)帶中的激發(fā)態(tài)電子能有效返回到價帶，其熒光即可恢復(fù)(圖1)。

圖1 測定原理示意圖

由軟硬酸堿理論可知，三聚氰胺分子中的氨基能與汞離子形成較強(qiáng)的配位鍵，可將結(jié)合于碳量子點表面的汞離子“拉”下來。圖2數(shù)據(jù)表明，在370 nm光的激發(fā)下，碳量子點在460 nm處有強(qiáng)熒光；加入汞離子后，量子點熒光發(fā)生猝滅；繼續(xù)加入三聚氰胺，碳量子點的熒光又恢復(fù)。據(jù)此，可以建立一種碳量子點熒光恢復(fù)測定三聚氰胺的分析方法。

圖2 碳量子點-汞離子-三聚氰胺體系的熒光光譜

3.2 測定條件的選擇

圖3是Hg2+離子濃度對碳量子點的熒光光譜的影響。在pH值為8.0的緩沖溶液中，在1.0 g/L的碳量子點溶液中加入Hg2+后，量子點的熒光發(fā)生猝滅，并且熒光猝滅程度隨Hg2+離子濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)Hg2+濃度為2.5 mg/L時，碳量子點的熒光猝滅程度為86.8%。進(jìn)一步研究表明，Hg2+濃度較高時，體系對三聚氰胺檢測的靈敏度較低，故本實驗選取猝滅程度為71.4%時的Hg2+濃度(1.5 mg/L)，即Hg2+濃度和碳量子點濃度之比為15∶10000為實驗條件。

圖3 碳量子點在不同濃度Hg2+溶液中(0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.2, 1.3, 1.5, 1.8, 2.5, 3.0 mg/L)的熒光光譜

Fig.3 Fluorescence emission spectra of the CQDs in aqueous solution upon addition of various concentrations of Hg2+(0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.2, 1.3, 1.5, 1.8, 2.5, 3.0 mg/L)

圖4是不同pH值條件下，碳量子點-Hg2+以及碳量子點-Hg2+-三聚氰胺體系的熒光強(qiáng)度，其中碳量子點濃度為1.0 g/L，Hg2+濃度為1.5 mg/L，三聚氰胺濃度為60.0 mg/L?？梢钥闯?，隨著pH值的升高，二者的熒光強(qiáng)度整體呈上升趨勢。當(dāng)pH為7.5時，二者的熒光響應(yīng)較強(qiáng)，且熒光恢復(fù)程度大。后續(xù)實驗選擇在pH=7.5的緩沖體系中進(jìn)行。

圖4 不同pH值下碳量子點的熒光強(qiáng)度

圖5是碳量子點濃度對熒光恢復(fù)的影響。在選定的Hg2+濃度和碳量子點濃度之比條件下，在pH=7.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中改變碳量子點的濃度，加入相同的濃度為16.0 mg/L的三聚氰胺。實驗表明，當(dāng)碳量子點濃度增加時，碳量子點-Hg2+、碳量子點-Hg2+-三聚氰胺體系的熒光均有所增強(qiáng)，且在碳量子點濃度為4.0 g/L時熒光恢復(fù)程度最大。故后續(xù)實驗選取碳量子點濃度為4.0 g/L。

圖5 碳量子點的濃度對熒光響應(yīng)的影響

Fig.5 Fluorescence intensity of CQDs with different concentrations

圖6是碳量子點-Hg2+以及碳量子點-Hg2+-三聚氰胺體系在不同時間的熒光強(qiáng)度，其中碳量子點的濃度為4.0 g/L，Hg2+濃度為6.0 mg/L，三聚氰胺濃度為16.0 mg/L，pH值為7.5。數(shù)據(jù)表明，在20～60 min內(nèi)，二者的熒光強(qiáng)度值保持穩(wěn)定。故后續(xù)實驗選擇在混勻20 min后進(jìn)行熒光測定，并在60 min內(nèi)完成全部測定。

圖6 反應(yīng)時間對熒光強(qiáng)度的影響

3.3 三聚氰胺的測定

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在選定的實驗條件下，改變?nèi)矍璋窐?biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，對碳量子點-Hg2+-三聚氰胺體系進(jìn)行熒光測定。結(jié)果表明，隨著三聚氰胺的加入，碳量子點的最大熒光發(fā)射波長不變，但熒光強(qiáng)度隨三聚氰胺濃度的增加而增大。進(jìn)一步研究表明，碳量子點的熒光恢復(fù)程度((F-F0)/F0)與三聚氰胺濃度在3.0～60.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖7)，線性回歸方程為(F-F0)/F0=0.0287C+0.0456 (C為三聚氰胺的濃度，單位：mg/L)，相關(guān)系數(shù)為0.994，方法檢出限(3σ/k)為2.2 mg/L。

圖7 碳量子點的熒光強(qiáng)度隨三聚氰胺濃度(0, 3.0, 6.0, 12.0, 15.0, 21.0, 27.0, 30.0, 36.0, 42.0, 60.0 mg/L)的變化。插圖：(F-F0)/F0與三聚氰胺的濃度在3.0～60.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

Fig.7 Dependence of FL intensity on the concentration of melamine(0, 3.0, 6.0, 12.0, 15.0, 21.0, 27.0, 30.0, 36.0, 42.0, 60.0 mg/L). Inset shows the linear relationship between (F-F0)/F0and melamine concentration within the range of 3.0-60.0 mg/L.

3.3.2 共存物的影響

實驗進(jìn)行了在實際樣品測定中可能出現(xiàn)的干擾物對三聚氰胺測定結(jié)果的影響。當(dāng)三聚氰胺的濃度為60.0 mg/L時，考察了10倍濃度的共存物對被測物分析結(jié)果的影響，這些共存物分別為：K+、Mg2+、Na+、Ca2+、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、葡萄糖(Glu)和乳糖(Lac)。圖8數(shù)據(jù)表明，在加入共存物后，碳量子點-Hg2+-三聚氰胺體系的熒光強(qiáng)度值沒有發(fā)生明顯的變化，測定結(jié)果相對誤差均在±5%的范圍內(nèi)，表明該方法的選擇性好。

圖8 以三聚氰胺體系熒光值作為對照，加入各干擾體系后熒光響應(yīng)的相應(yīng)柱狀圖。

Fig.8 Corresponding bar chart of the fluorescence responses of adding interference system obtained with the use of a sensor for melamine (control)

3.3.3 分析應(yīng)用

稱取2.50 g純牛奶4份，分別加入不同量的三聚氰胺(0, 5.0, 20.0, 50.0 mg)、15 mL三氯乙酸(10.0 g/L)及5 mL乙腈。然后，對樣品依次進(jìn)行如下處理：15 min的超聲、10 min的振蕩、10 min的離心(轉(zhuǎn)速：9 500 r/min)。將上清液透過0.45 μm的濾膜后，用NaOH溶液調(diào)其pH值至7.0，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中并定容。取2.00 mL定容后的溶液按實驗方法進(jìn)行測定。同時作工作曲線，根據(jù)工作曲線求得各試液中三聚氰胺的濃度，并進(jìn)一步計算回收率，具體數(shù)據(jù)見表1。結(jié)果表明，所測樣品中沒有檢測到三聚氰胺，加標(biāo)回收率在95%～103%范圍內(nèi)，說明該方法的準(zhǔn)確度較高，可應(yīng)用于實際樣品的測定。

表1 純牛奶中三聚氰胺的測定結(jié)果

4 結(jié) 論

以檸檬酸為碳源合成水溶性碳量子點。Hg2+離子結(jié)合于碳量子點表面后能猝滅其熒光，而三聚氰胺中氨基與Hg2+離子形成更穩(wěn)定的配位鍵，將Hg2+離子帶離碳量子點表面從而使熒光恢復(fù)。據(jù)此，建立了一種基于碳量子點熒光恢復(fù)測定三聚氰胺的分析方法，并應(yīng)用于實際樣品中的測定，方法的各項分析性能滿足微量分析的要求。

[1] WU Y S, LI Y, QIN L,etal.. Monodispersed or narrow-dispersed melamine-formaldehyde resin polymer colloidal spheres: preparation, size-control, modification, bioconjugation and particle formation mechanism [J].J.Mater.Chem. B, 2012, 1(2):204-212.

[2] SHANG B R, CHEN Y Q, WANG Z Y,etal.. Development and validation of a gas chromatography-mass spectrometry method for the simultaneous determination of melamine and cyromazine in animal feeds [J].J.Anim.Vet.Adv., 2011, 10(1):73-80.

[3] ZHOU Y, LI C Y, LI Y S,etal.. Monoclonal antibody based inhibition ELISA as a new tool for the analysis of melamine in milk and pet food samples [J].FoodChem., 2012, 135(4):2681-2686.

[4] ZHUANG H J, ZHU W F, YAO Z Y,etal.. SERS-based sensing technique for trace melamine detection—a new method exploring [J].Talanta, 2016, 153:186-190.

[5] CAO Q, ZHAO H, HE Y J,etal.. Electrochemical sensing of melamine with 3,4-dihydroxyphenylacetic acid as recognition element [J].Anal.Chim.Acta, 2010, 675(1):24-28.

[6] 楊延榮, 楊仁杰, 張志勇, 等. 基于參量化二維相關(guān)紅外譜和最小二乘支持向量機(jī)判別摻雜牛奶 [J]. 光子學(xué)報, 2013, 42(9):1123-1128. YANG Y R, YANG R J, ZHANG Z Y,etal.. Discrimination of adulterated milk using least square support vector machines combined with two-dimensional correlation infrared spectroscopy [J].ActaPhoton.Sinica, 2013, 42(9):1123-1128. (in Chinese)

[7] LI X F, LI J, KUANG H Y,etal.. An ultrasensitive method for the determination of melamine using cadmium telluride quantum dots as fluorescence probes [J].Anal.Chim.Acta, 2013, 802:82-88.

[8] 婁慶, 曲松楠. 基于超級碳點的水致熒光“納米炸彈” [J]. 中國光學(xué), 2015, 8(1):91-98. LOU Q, QU S N. Water triggered luminescent “nano-bombs” based on supra-carbon-nanodots [J].Chin.Opt., 2015, 8(1):91-98. (in Chinese)

[9] ZHANG C F, CUI Y Y, SONG L,etal.. Microwave assisted one-pot synthesis of graphene quantum dots as highly sensitive fluorescent probes for detection of iron ions and pH value [J].Talanta, 2016, 150:54-60.

[10] WANG Y, WU W T, WU M B,etal.. Yellow-visual fluorescent carbon quantum dots from petroleum coke for the efficient detection of Cu2+ions [J].NewCarbonMater., 2015, 30(6):550-559.

[11] AMJADI M, SHOKRI R, HALLAJ T. A new turn-off fluorescence probe based on graphene quantum dots for detection of Au(Ⅲ) ion [J].Spectrochim.ActaA:Mol.Biomol.Spectrosc., 2016, 153:619-624.

[12] CAYUELA A, SORIANO M L, KENNEDY S R,etal.. Fluorescent carbon quantum dot hydrogels for direct determination of silver ions [J].Talanta, 2016, 151:100-105.

[13] NIU W J, SHAN D, ZHU R H,etal.. Dumbbell-shaped carbon quantum dots/AuNCs nanohybrid as an efficient ratiometric fluorescent probe for sensing cadmium (Ⅱ) ions and L-ascorbic acid [J].Carbon, 2016, 96:1034-1042.

[14] ZHANG R Z, CHEN W. Nitrogen-doped carbon quantum dots: facile synthesis and application as a “turn-off” fluorescent probe for detection of Hg2+ions [J].Biosens.Bioelectron., 2014, 55:83-90.

[15] 馬紅燕, 王艷妮. 石墨烯量子點熒光探針測定腎上腺色腙 [J]. 發(fā)光學(xué)報, 2016, 37(2):230-236. MA H Y, WANG Y N. Detection of carbazochrome by graphene quantum dot fluorescence probe [J].Chin.J.Lumin., 2016, 37(2):230-236. (in Chinese)

[16] YUAN Y S, ZHAO X, QIAO M,etal.. Determination of sunset yellow in soft drinks based on fluorescence quenching of carbon dots [J].Spectrochim.ActaA:Mol.Biomol.Spectrosc., 2016, 167:106-110.

[17] FENG L H, WANG Y, LIANG F,etal.. Detection of glucose based on reversible “on-off” fluorescence systems in aqueous solution [J].Sens.ActuatorsB:Chem., 2011, 156(1):499-503.

[18] LIU J J, CHEN Z T, TANG D S,etal.. Graphene quantum dots-based fluorescent probe for turn-on sensing of ascorbic acid [J].Sens.ActuatorsB:Chem., 2015, 212:214-219.

[19] ZHAO J J, ZHAO L M, LAN C Q,etal.. Graphene quantum dots as effective probes for label-free fluorescence detection of dopamine [J].Sens.ActuatorsB:Chem., 2016, 223:246-251.

[20] LI Z, WANG Y, NI Y N,etal.. A rapid and label-free dual detection of Hg (Ⅱ) and cysteine with the use of fluorescence switching of graphene quantum dots [J].Sens.ActuatorsB:Chem., 2015, 207:490-497.

[21] HUANG H, WANG B D, CHEN M,etal.. Fluorescence turn-on sensing of ascorbic acid and alkaline phosphatase activity based on graphene quantum dots [J].Sens.ActuatorsB:Chem., 2016, 235: 356-361.

[22] HAN C P, WANG R, WANG K Y,etal.. Highly fluorescent carbon dots as selective and sensitive “on-off-on” probes for iron(Ⅲ) ion and apoferritin detection and imaging in living cells [J].Biosens.Bioelectron., 2016, 83:229-236.

[23] DONG Y Q, SHAO J W, CHEN C Q,etal.. Blue luminescent graphene quantum dots and graphene oxide prepared by tuning the carbonization degree of citric acid [J].Carbon, 2012, 50(12):4738-4743.

蘇安梅(1992-)，女，廣西百色人，碩士研究生，2015年于廣西大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，主要從事量子點熒光材料的合成與應(yīng)用的研究。

E-mail: 962240842@qq.com

王益林(1968-)，男，湖南邵陽人，博士，副教授，2010年于廣西大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事量子點熒光材料的合成與應(yīng)用的研究。

E-mail: theanalyst@163.com

Determination of Melamine Based on Fluorescence Recovery of Carbon Quantum Dots

SU An-mei, YU Shu-yi, QIN Xiu, SHEN Yan-ling, ZHONG Qing-mei, WANG Yi-lin*

(Guangxi Key Laboratory of Biorefinery, School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China)

*Corresponding Author, E-mail: theanalyst@163.com

We report a method for determination of melamine based on fluorescence recovery of carbon quantum dots (CQDs). It was found that the fluorescence intensity of CQDs can be efficiently quenched by Hg2+. And a turn-on fluorescence signal can be observed if melamine was added. The results showed when the concentration ratio of mercury ions to carbon quantum dots was 15∶10000, the concentration of carbon quantum dots was 4.0 g/L and the pH value was 7.5, the response was linearly proportional to the concentration of melamine within the range of 3.0-60 mg/L, the limit of detection (3σ/k) was 2.2 mg/L. The method was successfully applied to the determination of melamine in real sample with satisfactory recoveries (95%-103%)

carbon quantum dots; fluorescence recovery; determination; melamine

1000-7032(2017)07-0967-06

2016-12-13；

2017-02-10

廣西自然科學(xué)基金(2014GXNSFAA118328)； 廣西生物煉制重點實驗室開放基金(GXKLB-2)； 廣西大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201610593162)資助項目 Supported by Natural Science Foundation of Guangxi(2014GXNSFAA118328); Opening Project of Guangxi Key Laboratory of Biorefinery(GXKLB-2); Foundation of College Student Experimental Skills and Innovation Ability Training of Guangxi University(201610593162)

O611.4

A

10.3788/fgxb20173807.0967