董 偉 張 舒 陳源漢 李志蓮 李銳釗 史 偉 王蔚東 李春凌 梁馨苓,

?

活性氧自由基在腎小管上皮細胞necroptosis中的作用

董 偉1張 舒1陳源漢2李志蓮2李銳釗2史 偉2王蔚東3李春凌3梁馨苓1,2

目的：探討活性氧自由基(ROS)在腎小管上皮細胞necroptosis中的作用。 方法：構(gòu)建腎小管上皮細胞HK-2細胞necroptosis模型，檢測其ROS升高程度。并使用NADPH酶抑制劑Apocynin 抑制HK-2細胞necroptosis模型中ROS的生成，通過流式細胞計數(shù)及檢測necroptosis的關(guān)鍵蛋白觀察HK-2細胞necroptosis的變化。 結(jié)果：使用腫瘤壞死因子α、芐氧羰酰-纈氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮及抗霉素A成功建立了HK-2細胞necroptosis模型，并觀察到HK-2細胞發(fā)生necroptosis時ROS顯著升高(43.29±2.49vs25.90±1.27,P<0.001)，而使用necrostatin-1抑制necroptosis后ROS生成受到抑制(35.58±1.08vs43.29±2.49,P=0.002)。當對necroptosis模型使用Apocynin干預(yù)時，HK-2細胞ROS明顯下降(30.71±2.82vs43.29±2.49,P<0.001)，并且流式細胞計數(shù)結(jié)果顯示壞死細胞比例減少(2.00%±0.30%vs6.99%±2.79%,P<0.001)，同時受體相關(guān)蛋白3和混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域的磷酸化水平降低。 結(jié)論：ROS參與了HK-2細胞的necroptosis，并且通過抑制ROS的生成可減少necroptosis發(fā)生，提高損傷狀態(tài)下HK-2細胞存活率，減輕急性腎小管壞死。

活性氧自由基 necroptosis 腎小管上皮細胞 急性腎損傷

急性腎損傷(AKI)是可由多種病因?qū)е碌哪I功能急劇下降或腎臟損傷的一種臨床綜合征，其發(fā)病率和死亡率居高不下[1]，而急性腎小管壞死是AKI時嚴重的病理表現(xiàn)。既往認為細胞壞死是不可調(diào)控的，但近年來研究發(fā)現(xiàn)存在可調(diào)控性的細胞壞死。necroptosis是其中一種可調(diào)控性細胞壞死[2]，與凋亡有著本質(zhì)區(qū)別，一方面necroptosis在形態(tài)上仍表現(xiàn)為壞死，存在細胞破裂、內(nèi)容物釋放、誘發(fā)炎癥反應(yīng)等典型的細胞壞死的特征，碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色陽性；另一方面，與細胞凋亡依賴于一系列caspase酶不同，necroptosis的調(diào)控過程并不依賴于caspase酶，而是被受體相關(guān)蛋白1(receptor-interacting protein kinase 1,RIP-1)、RIP-3、混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)所調(diào)控[2]。我們前期的研究表明在腎小管上皮細胞受到損傷時可發(fā)生necroptosis[3]。同時，在缺血再灌注、順鉑、造影劑等多種AKI模型中，均發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞necroptosis參與了腎臟損傷[4-6]，并且通過necroptosis抑制劑necrostatin-1(Nec-1)來抑制RIP-1磷酸化RIP-3，或者敲除necrotosis通路中重要蛋白RIP-3或MLKL，均可抑制necroptosis，從而減輕AKI。在心肌細胞、肝細胞、肺腺瘤細胞等細胞中[7-9]，均發(fā)現(xiàn)活性氧自由基(reactive oxide species，ROS)參與了necroptosis，但是ROS在腎小管上皮細胞necroptosis中的作用尚未可知。本研究擬在前期成功建立的HK-2細胞的necroptosis模型中[3]，證實ROS在腎小管上皮細胞necroptosis中的作用。

材料和方法

材料 HK-2細胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α) 、芐氧羰酰-纈氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮(benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone，zVAD-fmk)(V116)、Nec-1(N9037)購自Sigma；Apocynin(sc-203321)、抗霉素A(sc-202467)購自Santa Cruz Biotechnology。Anexin V/PI細胞凋亡/壞死檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)活性氧檢測試劑盒購自于碧云天。磷酸化RIP-3(p-RIP-3)(ab209384)及磷酸化MLKL(p-MLKL)(ab187091)抗體購自于ABCAM；β-actin(#12413)及山羊抗兔(#7077)二抗購自于Cell Signaling Technology。

方法

HK-2細胞necroptosis模型的構(gòu)建 構(gòu)建方法同本課題組前期所構(gòu)建的HK-2細胞necroptosis模型[3]。無血清培養(yǎng)細胞24 h 使細胞生長同步化，用10 μg/L TNF-α和50 μmol/L zVAD-fmK 處理細胞6h后，加入10 μmol/L抗霉素A處理1h耗竭ATP。

Nec-1阻斷HK-2細胞necroptosis 在HK-2細胞使用100 μmol/L Nec-1 預(yù)處理8h，再使用10 μg /L TNF-α和50 μmol/L zVAD-fmK 處理細胞6h后，加入10 μmol/L抗霉素A處理1 h耗竭ATP。

抑制HK-2細胞NADPH酶活性 在HK-2細胞同時加入10 μg/L TNF-α、50 μmol/L zVAD-fmK及 NADPH酶抑制劑Apocynin 500 μmol/L處理6h，再加入10 μmol/L抗霉素A處理1 h耗竭ATP。。

Anexin V/PI染色后流式細胞計數(shù)檢測細胞凋亡/壞死 HK-2細胞培養(yǎng)時間結(jié)束，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，1 000 r/min離心3 min，棄培養(yǎng)液。用冷PBS洗滌細胞2次，用400 μl 1X Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106cells/ml。在細胞懸液中加入1.25 μl Anexin V后室溫孵育30 min，1 000 r/min離心3 min，棄上清。用400 μl 1X Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μl PI后輕輕混勻于2～8℃避光條件下孵育5 min。在1h內(nèi)用流式細胞儀上機檢測。

ROS測定 按照1∶ 1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA ，使終濃度為10 μmol/L。各組干預(yù)細胞用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，1 000 r/min離心3 min，棄培養(yǎng)液。用冷PBS洗滌細胞2次，后懸浮于稀釋好的 DCFH-DA 中，細胞濃度為濃度大約為1×106cells/ml， 37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細培養(yǎng)液洗滌三次。在1h內(nèi)用流式細胞儀上機檢測。通過流式細胞儀測量DCFH-DA平均熒光強度來評估ROS的生成。

Western Blot 配置10%聚丙烯酰胺凝膠，點樣后130V電泳90 min，PVDF膜400 mA轉(zhuǎn)膜60 min。3% BSA封閉1h，TBST洗膜后一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×4次，二抗室溫孵育1h。TBST洗膜5 min×4次后，加入顯影液曝光。曝光后圖像采用Image J測量灰度。

統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。

結(jié) 果

圖1 PI染色流式細胞計數(shù)比較各組間細胞壞死比例*:與necroptosis組比較,P<0.001；PI:碘化丙啶；Nec-1:necrostatin-1

HK-2細胞necroptosis的構(gòu)建及證實 流式細胞計數(shù)結(jié)果顯示(圖1)，HK-2細胞經(jīng)TNF-α、zVAD-fmK及抗霉素A處理后，較對照組細胞PI(+)細胞數(shù)明顯增加(6.99%±2.79%vs1.53%±0.30%,P<0.001)，Anexin V(+)細胞無明顯變化(2.83%±0.65%vs2.85%±0.74%,P=0.876)，提示該模型誘導(dǎo)了HK-2細胞壞死，而對凋亡無明顯影響。Nec-1預(yù)處理可減輕HK-2細胞壞死(2.05%±0.61%vs6.99%±2.79%,P<0.001)，而對凋亡無影響(3.23%±0.74%vs2.83%±0.65%,P=0.876)。這證實TNF-α、zVAD-fmK 及抗霉素A誘導(dǎo)的細胞死亡是Nec-1可抑制的可調(diào)性細胞壞死。同時為了進一步證實TNF-α、zVAD-fmK及抗霉素A所誘導(dǎo)的細胞死亡是necroptosis，采用Western Blot的方法檢測necroptosis通路中RIP-3和MLKL的磷酸化水平。Western Blot結(jié)果顯示(圖2)HK-2細胞加入TNF-α、zVAD-fmK及抗霉素A后，磷酸化RIP-3和磷酸化MLKL水平明顯升高，而加入Nec-1后則可降低RIP-3和MLKL磷酸化程度。因此證實TNF-α、zVAD-fmK及抗霉素A所誘導(dǎo)的細胞死亡是necroptosis。

Necroptosis組ROS水平增加 通過DCFH-DA活性氧探針檢測各組細胞ROS發(fā)現(xiàn),necroptosis模型組HK-2細胞ROS水平較對照組明顯升高(平均熒光強度43.29±2.49vs25.90±1.27,P<0.001)，而對模型組使用Nec-1預(yù)處理后ROS水平則可回落(35.58±1.08vs43.29±2.49,P=0.002)(圖3)。

抑制ROS生成可減輕HK-2細胞necroptosis 在TNF-α、zVAD-fmK及抗霉素A誘導(dǎo)的neroptosis模型中加入NADPH酶的抑制劑Apocynin后，可見HK-2細胞ROS水平呈下降趨勢(30.71±2.82vs43.29±2.49,P<0.001)(圖3)，說明Apocynin抑制了HK-2細胞ROS形成。流式細胞計數(shù)顯示對necroptosis模型加入Apocynin后，PI (+)陽性的壞死細胞比例下降(2.00%±0.30%vs6.99%±2.79%,P<0.001)，而細胞凋亡無明顯變化(2.43±0.61vs2.83%±0.65%,P=0.876)(圖1)。同時Wester Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),Apocynin可抑制neroptosis模型組細胞RIP-3和MLKL磷酸化水平(圖2)。

圖2 流式細胞儀檢測DCFH-DA染色熒光強度比較各組間ROS生成Nec-1：necrostatin-1；ROS：活性氧自由基；DCFH-DA：2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽

圖3 Western Blot比較各組間necroptosis的關(guān)鍵蛋白*:與necroptosis組比較,P<0.05；P-RIP-3:磷酸化受體相關(guān)蛋白3;p-MLKL:磷酸化混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域；Nec-1:necrostatin-1

討 論

急性腎小管壞死是AKI嚴重的病理表現(xiàn)。既往認為腎小管上皮細胞壞死是不可調(diào)控的，因此如何阻止AKI時腎小管上皮細胞壞死一直是未能攻克的難題。近年來，研究發(fā)現(xiàn)存在可調(diào)控性的細胞壞死，其中necroptosis是可調(diào)控性細胞壞死的一種重要形式，通過活化的RIP-1將RIP-3磷酸化，并進一步磷酸化pMLKL，最終使得細胞膜及線粒體膜破裂，導(dǎo)致細胞壞死[10-11]。而且越來越多研究證實腎小管上皮細胞中可出現(xiàn)necroptosis，并且在多種AKI動物模型中均證實necroptosis參與了AKI的發(fā)生、發(fā)展，通過necroptosis通路中相關(guān)蛋白抑制劑或敲除關(guān)鍵蛋白，均可減輕AKI[4-6]。

當氧原子上有未配對電子的自由基則被稱為ROS，包括過氧化物、超氧化物、單線態(tài)氧等，生理狀態(tài)下為氧代謝的副產(chǎn)物，起到信號傳導(dǎo)及維持細胞穩(wěn)態(tài)的作用。一些研究在發(fā)現(xiàn)ROS參與了心肌細胞、肝細胞、肺腺瘤細胞的necroptosis，并且抑制ROS生成可減少necroptosis發(fā)生[7-9]。既往研究中發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注、膿毒血癥、腎毒性藥物、造影劑等多種原因所導(dǎo)致的AKI時，腎小管上皮細胞ROS的生成均明顯增加，并且通過激活炎癥體、損傷線粒體、引起細胞凋亡等導(dǎo)致腎小管上皮細胞損傷，清除ROS可在不同程度上減輕腎小管上皮細胞損傷[12-15]。但是并未有研究報道ROS是否參與了腎小管上皮細胞necroptosis并最終導(dǎo)致腎臟損傷，本研究首次探討了腎小管上皮細胞ROS在necroptosis中的作用。

本研究通過流式細胞計數(shù)以及Western Blot在細胞和蛋白水平驗證了前期所建立的HK-2細胞的necroptosis的模型，并且發(fā)現(xiàn)necroptosis時HK-2細胞存在ROS的增加，而抑制necroptosis則明顯減少了ROS的生成。這提示腎小管上皮細胞發(fā)生necroptosis存在ROS的生成增加。當我們使用了NADPH酶的抑制劑Apocynin成功地減輕了necroptosis時細胞ROS，發(fā)現(xiàn)伴隨著ROS的下降，PI (+)陽性的壞死細胞數(shù)也隨之下降，同時蛋白水平上necroptosis標志性蛋白磷酸化RIP-3和磷酸化MLKL均呈下降趨勢。這提示當腎小管上皮細胞ROS的生成減少時necroptosis也得到減輕。通過上述實驗證實ROS參與了HK-2細胞凋亡樣壞死，并且使用NADPH抑制劑Apocynin抑制ROS生成可減輕HK-2細胞necroptosis。

目前ROS如何參與necroptosis的機制尚不明確。在本研究中Nec-1可通過抑制RIP-1活化RIP-3可減少ROS生成，提示ROS作為RIP-1和RIP-3的下游機制參與了necroptosis；而抑制NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS也可減少RIP-3的磷酸化水平及necroptosis，則提示ROS同時在RIP-3的上游機制來影響necroptosis。本研究雖然發(fā)現(xiàn)ROS參與了HK-2細胞的necroptosis，但是暫未闡明其具體機制，需要進一步研究來揭示ROS與necroptosis的關(guān)系。

綜上所述，ROS參與了HK-2細胞的necroptosis，并且通過抑制ROS生成可減少necroptosis發(fā)生，提高損傷狀態(tài)下HK-2細胞存活率，減輕急性腎小管壞死。該研究的結(jié)果有利于揭示腎小管上皮細胞necroptosis的具體機制，提供新的AKI的治療靶點。

1 Susantitaphong P,Cruz D N,Cerda J,et al.World incidence of AKI:a meta-analysis.Clin J Am Soc Nephrol,2013,8(9):1482-1493.

2 Galluzzi L,Vitale I,Abrams JM,et al.Molecular definitions of cell death subroutines:recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012.Cell Death Differ, 2012,19(1):107-120.

3 Liang X,Chen Y,Zhang L,et al.Necroptosis,a novel form of caspase-independent cell death,contributes to renal epithelial cell damage in an ATP-depleted renal ischemia model.Mol Med Rep,2014,10(2):719-724.

4 Linkermann A,Brasen J H,Himmerkus N,et al.Rip1 (receptor-interacting protein kinase 1) mediates necroptosis and contributes to renal ischemia/reperfusion injury.Kidney Int,2012,81(8):751-761.

5 Xu Y,Ma H,Shao J,et al.A Role for Tubular Necroptosis in Cisplatin-Induced AKI.J Am Soc Nephrol,2015,26(11):2647-2658.

6 Linkermann A,Heller J O,Prokai A,et al.The RIP1-kinase inhibitor necrostatin-1 prevents osmotic nephrosis and contrast-induced AKI in mice.J Am Soc Nephrol,2013,24(10):1545-1557.

7 Zhang T,Zhang Y,Cui M,et al.CaMKII is a RIP3 substrate mediating ischemia- and oxidative stress-induced myocardial necroptosis.Nature Medicine,2016,22(2):175-182.

8 Jiang Y,Shan S,Chi L,et al.Methyl methanesulfonate induces necroptosis in human lung adenoma A549 cells through the PIG-3-reactive oxygen species pathway.Tumor Biology,2016,37(3):3785-3795.

9 Takemoto K,Hatano E,Iwaisako K,et al.Necrostatin-1 protects against reactive oxygen species (ROS)-induced hepatotoxicity in acetaminophen-induced acute liver failure.FEBS Open Bio,2014,4:777-787.

10 Zhang DW,Shao J,Lin J,et al.RIP3,an Energy Metabolism Regulator That Switches TNF-Induced Cell Death from Apoptosis to Necrosis.Science,2009,325(5938):332-336.

11 Wang H,Sun L,Su L,et al.Mixed Lineage Kinase Domain-like Protein MLKL Causes Necrotic Membrane Disruption upon Phosphorylation by RIP3.Mol Cell,2014,54(1):133-146.

12 Quintavalle C,Brenca M,De Micco F,et al.In vivo and in vitro assessment of pathways involved in contrast media-induced renal cells apoptosis.Cell Death Dis,2011,2:e155.

13 Winterberg PD,Wang Y,Lin KM,et al.Reactive oxygen species and IRF1 stimulate IFN production by proximal tubules during ischemic AKI.Am J Physiol Renal Physiol,2013,305(2):F164-172.

14 Ahn JM,You SJ,Lee YM,et al.Hypoxia-inducible factor activation protects the kidney from gentamicin-induced acute injury.PLoS One,2012,7(11):e48952.

15 Zhao W,Zhang L,Sui M,et al.Protective effects of sirtuin 3 in a murine model of sepsis-induced acute kidney injury[J].Scientific Reports,2016,6:33201.

(本文編輯 青 松)

Effect of reactive oxygen species on necroptosis in renal tubular epithelial cell

DONGWei1,ZHANGShu1,CHENYuanhan2,LIZhilian2,LIRuizhao2,SHIWei2,WANGWeidong3,LIChunling3,LIANGXinling1,2

1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou5105152DivisionofNephrology,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China3InstituteofHypertension,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China

Correspondingauthor:LiangXinling(xinlingliang_ggh@163.com)

Objective：To investigate the role of reactive oxygen species on necroptosis in renal tubular epithelial cell. Methodology：The necroptosis model of HK-2 cell was constructed as our previous research.Apocynin,a specific inhibitor of NADPH oxidase was delivered in the necroptosis model.ROS production was detected by Dichlorodihydrofluorescein diacetate.The manner of cell death was identified by flow cytometry.Western Blot was used to determine phosphorylation of receptor-interacting protein kinase 3(RIP-3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL)which are essential to necroptosis. Results：Necroptosis model of HK-2 cell was established by TNF-α,benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (zVAD-fmk) and antimycin A.In this model,PI(+) HK-2 cells was increased and phosphorylation of RIP-3 and MLKL was augmented.ROS increased in necroptosis group(43.29±2.49vs25.90±1.27,P<0.001) and could be inhibited by Nec-1(35.58±1.08vs43.29±2.49,P=0.002).Apocynin not only decreased ROS production(30.71±2.82vs43.29±2.49,P<0.001),but also reduced the proportions of necrosis in the necroptosis model(2.00%±0.30%vs6.99%±2.79%,P<0.001).Phosphorylated RIP-3 and MLKL was also decreased by Apocynin. Conclusion：ROS play an important role in necroptosis of HK-2 cell.Necroptosis could be ameliorated by inhibiting ROS production.

reactive oxygen species necroptosis renal tubular epithelial cell acute kidney injury

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.03.009

國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目，國家自然科學(xué)基金面上項目(81570609),廣東省自然科學(xué)基金(2014A030313545)

1南方醫(yī)科大學(xué)(廣州，510515);2廣東省人民醫(yī)院 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院高血壓研究所

梁馨苓(E-mail:xinlingliang_ggh@163.com)

2016-11-30

? 2017年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有