黃 蕾 劉彥彬 林宇涵 靳蕊霞 周明生

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去除巨噬細胞對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓小鼠腎臟的保護作用

黃 蕾1,2劉彥彬1,2林宇涵1靳蕊霞2周明生1

目的：巨噬細胞浸潤與高血壓及腎損傷有密切關(guān)系，本實驗觀察使用脂質(zhì)體氯膦酸二鈉(CL)去除巨噬細胞對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的高血壓腎臟損傷的保護作用。 方法：24只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照、正常+CL組(CL 0.1 ml/10g體重，每周2次尾靜脈注射)、Ang Ⅱ組[1.4 mg/(kg·d),通過植入式膠囊滲透壓泵連續(xù)灌注14d]、AngⅡ+CL組。 結(jié)果：與正常組比，AngⅡ明顯增加小鼠收縮壓，蛋白尿，腎結(jié)構(gòu)損傷和巨噬細胞浸潤以及炎癥細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)的表達；在AngⅡ高血壓小鼠，CL顯著降低腎臟巨噬細胞浸潤，改善腎臟的結(jié)構(gòu)和功能損傷以及炎癥因子的表達，并輕度降低血壓。AngⅡ還誘導(dǎo)腎臟纖維化，增加纖維化因子TGF-β1,纖維連接蛋白及NADPH氧化酶gp91phox和p22phox的表達，CL治療有效地抑制AngⅡ誘導(dǎo)腎臟纖維化以及上述細胞因子的表達。 結(jié)論：巨噬細胞浸潤在AngⅡ高血壓引起的腎損傷中起重要作用，其機制可能與增加巨噬細胞在腎臟組織釋放炎癥細胞因子及氧化應(yīng)激反應(yīng)，去除巨噬細胞對其有保護作用。

腎臟損傷 高血壓 血管緊張素Ⅱ 巨噬細胞

高血壓是引起腎臟損害和終末期腎病的主要危險因素。 研究表明免疫細胞特別是單核巨噬細胞浸潤與高血壓腎損傷密切相關(guān)。 單核巨噬細胞是機體免疫系統(tǒng)對組織損傷做出反應(yīng)的第一線免疫細胞，在維持機體內(nèi)環(huán)境功能穩(wěn)定，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及組織損傷和修復(fù)中起著重要的作用。 大量研究表明在各種不同類型腎臟病變中，巨噬細胞是腎組織中浸潤最多也是最重要的炎癥細胞之一[1]。臨床研究也表明在各種腎臟疾病中巨噬細胞在腎臟組織的浸潤程度與腎臟組織的、尿蛋白程度、腎功能減退及其預(yù)后密切相關(guān)[2]。過度的激活腎素血管緊張素系統(tǒng)是引起高血壓及高血壓腎臟損傷的重要發(fā)病機制之一。 血管緊張素 Ⅱ(Ang Ⅱ)是一個前置性炎癥調(diào)節(jié)因子，研究表明 Ang Ⅱ可促進免疫細胞、特別是單核巨噬細胞在腎臟組織中浸潤，引起腎臟炎癥反應(yīng)和腎臟組織損傷[1,3-4]。目前還缺乏直接的實驗證據(jù)證明巨噬細胞在高血壓腎損傷中的作用，本研究將利用AngⅡ高血壓模型，通過尾靜脈注射脂質(zhì)體氯膦酸二鈉(CL)去除巨噬細胞，研究巨噬細胞去除對AngⅡ高血壓小鼠腎臟損傷的保護效應(yīng)，探討免疫巨噬細胞在高血壓及其腎臟損傷中的作用及可能機制。

材料和方法

實驗動物 8～10周齡雄性C57BL/6小鼠24只，SPF級，體重20～25g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，在錦州醫(yī)科大學實驗動物中心所屬的SPF級動物房飼養(yǎng)。

主要實驗試劑與儀器 AngⅡ(Sigma,RN4474-91-3,A9525-10 mg)；植入式膠囊滲透壓泵(Durect,CA95014,Alzet model 1007D)；CL(美國FormuMax，5 ml)；p22phox,gp91phox,Fibronectin(Santa,sc-21870/sc-5827/Sc-9068,100 μl)；TGF-β1(R&D,MAB2401)；MOMA-2(abcam,ab33451,100 μl)；大小鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)(北京軟隆生物技術(shù)有限公司，BP-98A)；顯微鏡(奧林巴斯，BX51)；電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(BioRad,PowerPac Basic)。

動物模型構(gòu)建 雄性C57BL/6小鼠24只常規(guī)飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境。用5%水合氯醛(3 mg/kg I.P.)麻醉，隨機分成4組：(1)正常對照組(n=6):在肩胛背部作一假切口并縫合，同時尾靜脈注射Liposome(脂質(zhì)體包裹PBS)作為正常對照；(2)正常+去巨噬細胞組(n=6)：在其肩胛部作一假手術(shù)，尾靜脈注射CL；(3)AngⅡ組(n=6)：在肩胛背部植入灌有AngⅡ膠囊滲透壓泵，該泵可連續(xù)14d釋放AngⅡ到周圍組織[1.4 mg/(kg·d)]，同時尾靜脈注射Liposome(脂質(zhì)體包裹PBS)；(4)AngⅡ+去巨噬細胞組(n=6)：植入AngⅡ滲透壓泵并尾靜脈注射CL治療14d。去巨噬細胞藥物CL于手術(shù)前一天，以及手術(shù)后從尾靜脈注射，每周兩次，每次注射劑量為0.1ml/10g體重。對照組小鼠在同樣時間間隔接受相同劑量的脂質(zhì)體PBS注射。去巨噬細胞藥物CL注射后第2天取尾部血液，制作血涂片進行吉姆薩染色，并以外周血中的粒細胞減少70%作為有效去除巨噬細胞去除的標準[5]。 CL被廣泛地應(yīng)用于去除動物活體內(nèi)器官和組織中的巨噬細胞，CL經(jīng)尾靜脈進入循環(huán)后被巨噬細胞識別、吞噬，進而誘導(dǎo)巨噬細胞調(diào)亡[6]。有研究表明通過尾靜脈注射CL能有效去除血液循環(huán)中75%、組織浸潤中70%左右的巨噬細胞[5-7]。

血壓、尿蛋白/肌酐比測定 分別測量手術(shù)前、手術(shù)第7天及手術(shù)第14天的收縮壓(SBP)。干預(yù)結(jié)束后收集尿液，測定尿蛋白及肌酐。

腎臟病理分析 新鮮小鼠腎臟組織去除包膜后，沿橫截面將腎臟切開，取1/2腎臟組織在4%多聚甲醛固定24h后，包埋、制作石蠟切片。采用PAS、Masson和免疫熒光法染色觀察腎臟損傷、膠原沉積及炎癥細胞在腎臟的浸潤情況。PAS和Masson法的染色程序參照試劑盒說明書(廈門邁威生物科技有限公司、北京雷根生生物技術(shù)有限公司)。

腎小球硬化程度評分：每張切片觀察20個小球，評分腎小球損傷程度。分為0分：正常腎小球、無硬化；1分：輕度損傷，腎小球損傷比例<25%；2分：中度損傷，腎小球損傷比例25%～75%；4分：完全損傷，腎小球損傷比例>75%。纖維化測量方法：采用IPP軟件計算藍色纖維化面積占總面積的百分比。

用Western Blot的方法分析腎臟組織中炎性細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)，纖維連接蛋白(FN)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的兩個亞基p22phox、gp91phox等的表達。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

SBP、尿蛋白/肌酐 與對照組比較，AngⅡ明顯增加動脈SBP(186±7 mmHgvs110±5 mmHg),尿蛋白/肌酐比值(2.6±0.24 mg/mgvs1.8±0.2 mg/mg)；巨噬細胞去除藥CL治療明顯降低Ang Ⅱ引起的SBP增加(150±6 mmHg,P<0.05，圖1A),減少尿蛋白/肌酐比值(2.1±0.16 mg/mg,P<0.05，圖1B)。

圖1 CL治療對Ang Ⅱ小鼠血壓、尿蛋白/肌酐的影響(n=6)CL：脂質(zhì)體氯膦酸二鈉；Ang Ⅱ：血管緊張素Ⅱ；*:與Ang Ⅱ比較，P<0.05;#:與Ang Ⅱ+CL比較，P<0.05

CL治療減少了腎臟組織中巨噬細胞的表達 MOMA-2是小鼠巨噬細胞的一個標示性抗原。如圖2所示，MOMA-2在腎臟組織中陽性表達，與對照組比較，AngⅡ增加了巨噬細胞在腎臟組織中的浸潤；CL治療降低了巨噬細胞在腎臟組織中的浸潤(P<0.05)。

圖2 A：MOMA-2在各組小鼠腎臟的熒光表達(IF，×400)；B：MOMA-2陽性細胞數(shù)目(n=6)Ang Ⅱ:血管緊張素Ⅱ；CL：脂質(zhì)體氯膦酸二鈉；a:正常對照；b:正常+CL；c:Ang Ⅱ；d:Ang Ⅱ+CL；△:與正常+CL比較，P <0.05，*:與AngⅡ比較，P<0.05；#:與AngⅡ+CL比較，P<0.05

CL治療抑制AngⅡ引起的炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達 如圖3所示，AngⅡ 明顯增加了炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達。CL治療后高血壓小鼠腎臟中TNF-α、IL-1β的表達明顯降低。

CL治療抑制AngⅡ引起的NADPH氧化酶的表達 如圖4所示，AngⅡ能顯著增加NADPH氧化酶的兩個亞基gp91phox和p22phox的蛋白表達量。而去除灌注AngⅡ小鼠巨噬細胞后gp91phox和p22phox的蛋白表達量明顯降低，CL治療能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NADPH氧化酶的表達。

圖3 CL治療對AngⅡ小鼠炎癥因子表達的影響(n=6)TNF-α；腫瘤壞死因子α；IL-1β:白細胞介素1β；CL：脂質(zhì)體氯膦酸二鈉；Ang Ⅱ：血管緊張素Ⅱ；*:與Ang Ⅱ比較，P <0.05

圖4 CL治療對AngⅡ小鼠NADPH氧化亞基表達的影響(n=6)CL：脂質(zhì)體氯膦酸二鈉；Ang Ⅱ：血管緊張素Ⅱ；*:與AngⅡ比較，P<0.05；#:與AngⅡ+CL比較，P<0.05

CL治療抑制AngⅡ引起的腎臟纖維化 TGF-β1及其下游分子FN是調(diào)節(jié)細胞基質(zhì)和纖維化反應(yīng)過程的重要纖維因子。AngⅡ明顯增加了FN和TGF-β1的表達，而CL治療能明顯抑制高血壓小鼠腎臟中FN和TGF-β1的表達(圖5)。

腎臟病理結(jié)果

PAS染色 實驗2周后，PAS 染色顯示泵入AngⅡ的小鼠腎臟出現(xiàn)明顯腎小球膨大，腎小管擴張，腎間質(zhì)增多。AngⅡ組小鼠經(jīng)CL治療后，腎臟病理明顯改善(圖6)。

Masson染色 如圖7所示，與其余各組比較，AngⅡ組小鼠腎小球硬化伴腎間質(zhì)纖維化明顯。AngⅡ組小鼠經(jīng)CL治療后，纖維化面積明顯減少，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖5 CL治療對AngⅡ小鼠纖維化的影響(n=6)FN：纖維連接蛋白；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子β1；CL：脂質(zhì)體氯膦酸二鈉；Ang Ⅱ：血管緊張素 Ⅱ；*:與AngⅡ比較，P<0.05；#:與AngⅡ+CL比較，P<0.05

圖6 A：各組小鼠腎臟病理變化(PAS，×400)；B：腎小球損傷評分(n=6)CL：脂質(zhì)體氯膦酸二鈉；Ang Ⅱ：血管緊張素Ⅱ；a:正常對照；b:正常+CL；c:Ang Ⅱ；d:Ang Ⅱ+CL；*:與Ang Ⅱ比較，P<0.05；#:與Ang Ⅱ+CL比較，P<0.05

討 論

圖7 A：各組小鼠腎臟病理變化(Masson,×400);B:纖維化面積百分比(n=6)CL：脂質(zhì)體氯膦酸二鈉；Ang Ⅱ：血管緊張素 Ⅱ；a:正常對照；b:正常+CL；c:Ang Ⅱ；d:Ang Ⅱ+CL；*:與Ang Ⅱ比較，P<0.05;#:與Ang Ⅱ+CL比較，P<0.05

巨噬細胞浸潤與高血壓腎損傷有密切關(guān)系，但目前尚無直接的實驗證據(jù)證明巨噬細胞在高血壓腎損傷中的確切作用。本實驗通過尾靜脈注射CL對AngⅡ高血壓鼠進行巨噬細胞去除，結(jié)果表明CL能有效地減少循環(huán)血中的單核細胞和腎臟中的巨噬細胞浸潤，巨噬細胞去除明顯地減輕AngⅡ引起的腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷，同時降低AngⅡ引起的腎臟炎性細胞因子表達和NADPH氧化酶活性。這些結(jié)果提供了直接的實驗證據(jù)支持巨噬細胞參與AngⅡ高血壓腎臟損傷的病理機制。

AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓常伴有腎巨噬細胞浸潤增加，浸潤的巨噬細胞在腎組織中釋放炎性細胞因子引起腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損害。TNF-α和IL-1β是巨噬細胞釋放的主要炎性細胞因子，也是炎性巨噬細胞被激活(M1型)的標志[8]。目前有研究表明巨噬細胞來源的TNF-α在高血壓和糖尿病腎損害中起著非常重要的作用[9-10]。本實驗結(jié)果顯示AngⅡ在增加巨噬細胞在腎組織浸潤的同時，腎組織中的炎性細胞因子TNF-α和IL-1β等的表達明顯增加，巨噬細胞去除在降低AngⅡ引起的腎結(jié)構(gòu)和功能損傷的同時，也降低了腎組織中這些細胞因子的表達。這些結(jié)果提示AngⅡ增加腎組織炎性因子表達和炎癥反應(yīng)至少部分與增加腎組織巨噬細胞浸潤有關(guān)，AngⅡ通過增加巨噬細胞來源的炎性因子促進腎損傷。

AngⅡ高血壓腎病也與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[11]。AngⅡ可直接激活腎組織細胞中的NADPH氧化酶，或通過增加浸潤在腎臟組織中的炎癥細胞(主要是M1型巨噬細胞)NADPH氧化酶誘導(dǎo)腎氧化應(yīng)激反應(yīng)[1,12-13]。膜亞基gp91phox和p22phox是NADPH氧化酶在吞噬細胞的主要表達類型[14]。我們的實驗結(jié)果顯示AngⅡ明顯增加腎臟組織中NADPH氧化酶的兩個亞基gp91phox和p22phox的表達；去除巨噬細胞可降低腎gp91phox和p22phox的表達，表明巨噬細胞是AngⅡ促進腎氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要來源。

AngⅡ高血壓腎損傷的另一個特征是腎臟纖維化， AngⅡ促進腎纖維化主要是通過上調(diào)腎TGF-β1[15]，TGF-β1是一個重要的纖維調(diào)節(jié)因子，它主要通過增加基質(zhì)蛋白的合成來刺激內(nèi)皮細胞在腎小球系膜積聚[16]，在高血壓腎臟損害中扮演重要角色[17-18]。腎組織中的TGF-β1可來自腎細胞本身，也可來自浸潤的巨噬細胞[1]。我們的實驗結(jié)果顯示巨噬細胞去除明顯的改善AngⅡ高血壓小鼠的腎纖維化并降低腎組織TGF-β1和FN的表達，這些結(jié)果說明巨噬細胞也參與AngⅡ引起的高血壓腎纖維化過程。

綜上所述，本研究表明巨噬細胞參與了AngⅡ高血壓腎臟損傷和腎纖維化病理過程。巨噬細胞去除減少腎臟組織中的巨噬細胞募集及巨噬細胞來源的炎性細胞因子，降低腎臟的炎癥，氧化應(yīng)激反應(yīng)以及腎纖維化過程，從而降低高血壓腎臟組織損傷。 我們的研究結(jié)果有可能為發(fā)展一個以抑制巨噬細胞腎浸潤或巨噬細胞分泌炎性因子為靶目標的高血壓腎病治療方法提供新思路。

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(本文編輯 青 松)

Renal protection of macrophage depletion in angiotensin Ⅱ induced hypertensive mice

HUANGLei1，2,LIUYanbin1，2,LINYuhan1,JINRuixia2,ZHOUMingsheng1

1DepartmentofPhysiology，JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121000,China2TheFirstAffiliatedHospital,JinzhouMedicalUniversity;Jinzhou121000,China

Correspondingauthor:ZHOUMingsheng(E-mail:zhoums1963@163.com)

Objective：Macrophage infiltration is tightly contacting with hypertensive renal injury, the present study investigated renal protection of macrophage depletion by clodronate liposome (CL) in angiotensin (Ang) Ⅱ-induced hypertension mice. Methodology：Twenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into four groups: normal control, normal plus CL treatment (CL, 0.1 ml/10g BW, 2 times/week by tail vein injection), AngⅡ infusion [1.4 mg/(kg·day), implanted by mini-pump], and AngⅡ plus CL treatment for 14 days. Results：Compared with control mice, AngⅡ infusion significantly increased systolic blood pressure (SBP), proteinuria, renal structural damage, renal macrophage infiltration associated with higher expression of proinflamamtory cytokine tumor necrosis factor (TNF) α and inteleukin (IL) 1β. CL markedly reduced renal macrophage infiltration, renal structural and functional impairment, and the expression of the proinflammatory cytokines with a mild reduction in SBP in AngⅡ mice. Furthermore, AngⅡ also induced renal fibrosis with increasing expression of fibrotic factors TGF-β1 and fibronectin as well as the expression of NADPH oxidae subunits gp91phox and p22phox, depletion of macrophage by CL effectively reversed renal fibrosis and the changes in those molecules induced by AngⅡ. Conclusion： Macrophage was the main contributor to AngⅡ hypertensive renal injury. The underlying mechanisms may involve increased production/release of macrophage-derived inflammatory cytokine and oxidative stress, macrophage depletion protects AngⅡ induced renal hypertensive injury.

renal damage hypertension angiotensinⅡ macrophage

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.03.008

國家自然科學基金項目(81670384，81470532)

1錦州醫(yī)科大學生理教研室(錦州,121000)；2錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院

周明生(E-mail:zhoums1963@163.com)

2016-09-27

? 2017年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有