盧業(yè)健　邱蘭蘭　王莉莉

[摘要] 目的 分析CD38在M2型急性髓系白血病患者中的表達(dá)及其對(duì)患者預(yù)后的影響。方法 收集2012年1月～2015年12月解放軍總醫(yī)院診治的原發(fā)性M2型急性髓系白血病患者47例，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓樣本中白血病細(xì)胞CD38的表達(dá)，回顧性分析患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)以及生存狀況，并結(jié)合M2型白血病中最常見(jiàn)的遺傳學(xué)特征t（8；21）易位對(duì)此類疾病進(jìn)行預(yù)后分層研究。 結(jié)果 伴有t（8；21）易位的M2型急性髓系白血病患者中，CD38+比例為100%，高于非t（8；21）易位患者的73.9%（P = 0.02）。CD38-的非t（8；21）易位患者的誘導(dǎo)緩解率低于CD38+的非t（8；21）易位患者和CD38+的伴有t（8；21）易位的患者（50.0%、88.2%、95.8%，P = 0.03）。在生存分析方面，三者的3年無(wú)事件生存率分別為16.7%、38.1%和58.7%，雖然差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但是前者的5年總生存率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于后兩者（16.7%、44.0%、47.2%，P = 0.03）。 結(jié)論 在M2型急性髓系白血病中，CD38+與t（8；21）易位具有正相關(guān)性，CD38表達(dá)減弱是M2型急性髓系白血病預(yù)后不良的標(biāo)志之一，并有望指導(dǎo)患者的預(yù)后分層和個(gè)體化治療。

[關(guān)鍵詞] 急性髓系白血??；CD38；t（8；21）；預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R733.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）05（c）-0010-04

[Abstract] Objective To investigate the expression level of CD38 in the M2 subtype of acute myeloid leukemia and its effect on the prognosis of patients. Methods From January 2012 to December 2015， in PLA General Hospital， 47 patients with primary M2 subtype of acute myeloid leukemia were collected. The expression level of CD38 on leukemic cells was detected by flow cytometry. The clinical data and laboratorial characteristics and the survival status were compared between these patients， and the prognostic significance of CD38 was analyzed retrospectively with the combination of the most common genetic aberration of t（8；21） translocation in this type of leukemia. Results The rate of CD38+ patients was 100% in the M2 subtype of patients with t （8；21） translocation， which was higher than the 73.9% of CD38+ patients in non-t （8；21） patients （P = 0.02）. The remission rate after the induction therapy in the CD38- patients with non-t （8；21） was lower than those in the CD38+ patients with or without t （8；21） translocation （50.0%， 88.2%， 95.8%， P = 0.03）. The survival analysis showed that the 3-year EFS rate of these three cohorts was 16.7%， 38.1% and 58.7%， respectively， the differences were not statistically significant （P > 0.05）， while the 5-year OS rate of the CD38-patients was much lower than those in the CD38+ patients with or without t （8；21） translocation （16.7%， 44.0%， 47.2%， P = 0.03）. Conclusion CD38 expression has a positive correlation with t（8；21） in the M2 subtype of acute myeloid leukemia， and the downregulation of CD38 expression is one of the hallmarks of poor prognosis in this subtype， which is expected to guide the prognostic stratification and personalized therapy of the patients.

[Key words] Acute myeloid leukemia； CD38； t（8；21）； Prognosis

M2型急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia with maturation，AML-M2）是急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）中較為常見(jiàn)的一種亞型，約占AML的32%[1]。在AML-M2中，30%～40%的患者具有特征性染色體易位t（8；21）（q22；q22），該易位被認(rèn)為是一種預(yù)后較好的遺傳學(xué)標(biāo)志[2-3]；而剩下近70%的AML-M2患者的可重現(xiàn)性染色體易位發(fā)生率較低，其預(yù)后具有較大的異質(zhì)性。近年來(lái)，隨著二代測(cè)序等分子診斷技術(shù)的進(jìn)步，在AML-M2中發(fā)現(xiàn)了一些可能與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因突變，但這些突變?cè)诖祟惣膊☆A(yù)后中的意義還不甚明確[4-6]。因此，探索新的預(yù)后分層指標(biāo)對(duì)指導(dǎo)疾病個(gè)體化治療具有重要意義。

CD38是正常造血細(xì)胞或者白血病細(xì)胞表面常見(jiàn)的一個(gè)分子量為45 kD的跨膜糖蛋白，在急性髓系白血病細(xì)胞上的表達(dá)存在異質(zhì)性[7-8]，其表達(dá)減弱是造血干祖細(xì)胞的特征之一。既往有研究報(bào)道，CD38表達(dá)減弱可能與AML的預(yù)后不良相關(guān)[9-10]，但其在AML-M2中的表達(dá)狀況以及在預(yù)后分層中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探討CD38在AML-M2患者中的表達(dá)差異及其臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年1月～2015年12月解放軍總醫(yī)院診治的原發(fā)性AML-M2患者47例，其中男30例，女17例，平均發(fā)病年齡為（38.9±14.7）歲，中位隨訪時(shí)間為38個(gè)月（15～63個(gè)月）。所有患者均按WHO分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，按照FAB標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型，所有患者均符合：新診斷的原發(fā)性AML-M2；年齡>15歲；ECOG≤3分。根據(jù)初治骨髓樣本中白血病細(xì)胞CD38表達(dá)強(qiáng)度與陰性對(duì)照的比較將患者分為CD38+和CD38-組。

1.2 治療方案

所有患者均采取成人AML中國(guó)診療指南（2011版）[11]推薦的一線誘導(dǎo)化療方案，具體如下：①I(mǎi)A：Idarubicin 8～12 mg/m2第1～3天，Cytarabine 100～200 mg/m2第1～7天；②DA：Daunorubicin 45～90 mg/m2第1～3天，Cytarabine 100～200 mg/m2第1～7天；③MA：Mitoxantrone 6～10 mg/m2第1～3天，Cytarabine 100～200mg/m2第1～7天。誘導(dǎo)緩解后進(jìn)行多個(gè)療程鞏固或維持治療，具體方案為：IA、DA、MA方案或者大劑量（1～3 g/m2，q12h）阿糖胞苷單藥治療。

1.3 療效評(píng)估

AML血液學(xué)完全緩解（CR）：骨髓涂片原幼細(xì)胞<5%，外周血血象恢復(fù)且沒(méi)有原幼細(xì)胞，無(wú)輸血依賴（中性粒細(xì)胞絕對(duì)值>1.5×109/L，血小板>100×109/L）。AML復(fù)發(fā)：骨髓涂片原幼細(xì)胞>5%，與造血恢復(fù)無(wú)關(guān)，或者外周血出現(xiàn)原幼細(xì)胞以及其他組織出現(xiàn)髓外浸潤(rùn)。無(wú)事件生存期：從疾病確診到出現(xiàn)復(fù)發(fā)或者隨訪截止日?？偵嫫冢簭募膊〈_診日開(kāi)始到任何原因引起的死亡或者隨訪截止日。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析

按照標(biāo)準(zhǔn)方法，使用嵌合熒光標(biāo)記物的單克隆抗體CD38-PC5、CD34-PE、CD45-ECD等（Beckman Coulter，美國(guó)）標(biāo)記每例骨髓樣本，避光孵育30 min，隨后使用紅細(xì)胞裂解液排除成熟的紅細(xì)胞，并用PBS緩沖液洗滌兩次，最后使用多參數(shù)流式細(xì)胞儀（FC500，Beckman Coulter，美國(guó)）檢測(cè)樣品，并通過(guò)CXP軟件進(jìn)行分析。采集條件設(shè)置為從每個(gè)樣本至少收集1×105個(gè)細(xì)胞。FSC/SSC（前向散射/側(cè)向散射）門(mén)控用于排除細(xì)胞碎片；CD45/SSC門(mén)控表達(dá)用于識(shí)別白血病細(xì)胞（CD45dim vs SSClow），并在每個(gè)細(xì)胞群中分析白血病相關(guān)免疫表型。根據(jù)WHO界定的以20%為抗原表達(dá)的閾值，將CD38表達(dá)程度分為陽(yáng)性組（>80%原幼細(xì)胞表達(dá)CD38）和陰性組（>20%原幼細(xì)胞不表達(dá)CD38）。

1.5 染色體核型分析

根據(jù)ISCN指南（2005版）[12]，使用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)來(lái)自骨髓標(biāo)本的短期培養(yǎng)物進(jìn)行G顯帶染色，并運(yùn)用染色體自動(dòng)掃描分析系統(tǒng)（Metafer 4，Zeiss，德國(guó)）進(jìn)行中期分裂象掃描及核型分析，每例患者至少分析20個(gè)核型以排除克隆性異常。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。使用Kaplan-Meier生存曲線分析無(wú)事件生存期和總生存期，通過(guò)Log-lank分析比較不同曲線之間的差異。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M2型急性髓系白血病中t（8；21）易位和CD38表達(dá)情況

47例患者的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，AML-M2患者攜帶t（8；21）染色體異常的比例為51%（24/47），其中CD38+患者比例為100%（24/24）；而非t（8；21）易位患者的CD38+比例僅為73.9%（17/23），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.02），該結(jié)果提示CD38表達(dá)與t（8；21）易位存在正相關(guān)性。另外，基因突變的篩查結(jié)果顯示，在24例攜帶t（8；21）易位的初治患者中，檢出C-KIT基因突變3例，AML1基因突變1例；在17例非t（8；21）患者中，檢出NPM1基因突變3例，F(xiàn)LT3-ITD突變2例，DNMT3A基因突變1例。由于每種突變所占比例較低，且在t（8；21）和非t（8；21）兩組患者中分布不一致，因此將t（8；21）易位與CD38表達(dá)狀況相結(jié)合，對(duì)患者進(jìn)行了分組研究。

2.2 患者一般特點(diǎn)和治療反應(yīng)比較

根據(jù)是否伴隨t（8；21）易位以及CD38免疫表型，本研究將患者伴有t（8；21）染色體異常的CD38+患者、未伴有t（8；21）染色體異常的CD38+患者和CD38-患者，三類患者在年齡、白細(xì)胞數(shù)、血小板、血紅蛋白、性別構(gòu)成方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但是前兩者誘導(dǎo)化療后的完全緩解率明顯優(yōu)于后者（95.8% ，88.2%和50.0%，P=0.03）。見(jiàn)表1。

2.3 CD38免疫表型與預(yù)后

鑒于CD38表達(dá)與t（8；21）易位明顯呈正相關(guān)，以及t（8；21）染色體易位可提示患者獲得良好的預(yù)后，本研究進(jìn)一步探討了CD38表達(dá)在上述三類患者中與預(yù)后分層的相關(guān)性。未伴有t（8；21）易位的CD38-和CD38+患者以及伴有t（8；21）易位的CD38+患者的3年無(wú)事件生存率分別為16.7%、38.1%和57.8%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.12）。但是，前者的5年總生存率明顯差于后兩者（16.7%、44.0%、47.2%，P = 0.03），該結(jié)果提示在非t（8；21）亞型中，CD38-患者的預(yù)后要差于CD38+患者，CD38表達(dá)與t（8；21）易位相結(jié)合可將M2型急性髓系白血病進(jìn)行進(jìn)一步的預(yù)后分層，從而指導(dǎo)個(gè)體化治療。見(jiàn)圖1。

3 討論

AML-M2是一組發(fā)病率較高、異質(zhì)性較大的造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病，約1/3的AML-M2患者攜帶有可重現(xiàn)性t（8；21）易位并提示相對(duì)良好的臨床預(yù)后，但在其余2/3的患者中尚缺乏有效的預(yù)后分層指標(biāo)[13]。雖然細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)手段被已被廣泛用于AML的機(jī)制及預(yù)后研究，但在M2型白血病中的研究進(jìn)展較慢，除t（8；21）易位外尚未發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后分層體系。

近年來(lái)，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)造血細(xì)胞表面抗原的表達(dá)已成為血液系統(tǒng)疾病診斷、鑒別診斷、病情監(jiān)測(cè)中必不可少的方法之一，既往有研究顯示，一些血液腫瘤的細(xì)胞表面抗原的表達(dá)與腫瘤的預(yù)后相關(guān)[14-17]，這些發(fā)現(xiàn)為研究白血病的預(yù)后分層提供了新的思路。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在攜帶有t（8；21）易位的AML-M2患者中，其白血病細(xì)胞的CD38表達(dá)均為陽(yáng)性，而在無(wú)t（8；21）易位的患者中，CD38的表達(dá)呈現(xiàn)異質(zhì)性；進(jìn)一步的預(yù)后分析顯示，CD38-的非t（8；21）患者化療的誘導(dǎo)緩解率較差，且其5年OS明顯差于伴或不伴有t（8；21）易位的CD38+患者；而CD38+的非t（8；21）患者的總體預(yù)后則略差于或接近具有t（8；21）易位的AML-M2患者。上述發(fā)現(xiàn)提示依據(jù)CD38的表達(dá)和是否攜帶t（8；21）易位可以將AML-M2患者的預(yù)后進(jìn)一步分層，可對(duì)病情評(píng)估和個(gè)體化治療起到一定的指導(dǎo)作用。

CD38是一個(gè)具有酶促活性的跨膜糖蛋白，能夠調(diào)控Ca2+的流動(dòng)并影響細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路，也可作為受體或者黏附因子調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡和其他新陳代謝活動(dòng)[7-8]。既往的研究發(fā)現(xiàn)[18-19]，早期造血干祖細(xì)胞的表型可能為CD34+CD38-，隨著細(xì)胞進(jìn)一步向髓系分化和成熟，CD38表達(dá)增強(qiáng)，提示CD38的表達(dá)與細(xì)胞的分化階段相關(guān)聯(lián)。在一些體內(nèi)體外研究中發(fā)現(xiàn)，CD34+CD38-的白血病細(xì)胞可以在免疫缺陷的小鼠中植入并導(dǎo)致白血病的發(fā)生，且CD34+CD38-白血病細(xì)胞與CD34+CD38+白血病細(xì)胞相比對(duì)化療的敏感性明顯減弱[20-21]，這些現(xiàn)象均提示CD38-是白血病干細(xì)胞的主要特征之一，并有可能是導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)耐藥及預(yù)后不良的機(jī)制之一。目前，CD38在AML-M2發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制尚不清楚，但本研究數(shù)據(jù)提示，CD38+的M2型白血病細(xì)胞的分化階段可能較CD38-的白血病細(xì)胞更成熟，CD38在所有t（8；21）亞型中均表達(dá)也支持這一推論，由此可以推測(cè)，CD38的表達(dá)減弱可能與白血病細(xì)胞的分化較差、化療不敏感和預(yù)后不良有較好的相關(guān)性，并有望作為此類白血病的預(yù)后不良的標(biāo)志之一，為臨床提供更多有價(jià)值的病情評(píng)估的依據(jù)。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究將有助于更深入的揭示CD38在此類白血病中導(dǎo)致預(yù)后不良的作用機(jī)制。

隨著白血病的精準(zhǔn)診療概念的不斷深入和推進(jìn)，白血病的預(yù)后分層體系也越來(lái)越需要更多有效的預(yù)后參數(shù)對(duì)疾病進(jìn)行綜合評(píng)估和分層。本研究將免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)的預(yù)后信息進(jìn)行整合，對(duì)AML-M2進(jìn)行了更深層次的預(yù)后分層，為臨床治療策略的選擇提供了更多客觀依據(jù)，也為其他類型白血病的研究提供了新的思路。

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（收稿日期：2017-02-18 本文編輯：蘇 暢）