梁 喬，趙鳳菊，顧貴波，楊本勇，李井春，魏園園

(遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽(yáng) 110164)

遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥基因的檢測(cè)與分析

梁 喬，趙鳳菊*，顧貴波，楊本勇，李井春，魏園園

(遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽(yáng) 110164)

為了解遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥情況，采用K-B紙片法對(duì)65株豬源大腸埃希菌菌株進(jìn)行6種氨基糖苷類(lèi)抗生素的藥敏試驗(yàn)，同時(shí)采用PCR方法對(duì)耐藥菌株rpsl基因和4種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4進(jìn)行檢測(cè)及序列分析，并將陽(yáng)性樣品與GenBank中登錄的序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示，遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌對(duì)鏈霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素的耐藥率分別為26.2%、15.4%、18.5%、29.2%、4.6%、21.5%；23株耐藥菌株rpsl基因檢出率為100%；4種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4檢出率分別為13.0%、8.7%、69.6%、4.3%。以上結(jié)果表明，在氨基糖苷類(lèi)抗生素中耐藥性最低的是丁胺卡那霉素，rpsl基因及氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因普遍存在于遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌中。

豬； 大腸埃希菌； 氨基糖苷類(lèi)抗生素； 耐藥基因；PCR

氨基糖苷類(lèi)抗生素如慶大霉素、妥布霉素、鏈霉素等因具有高效、廣譜、藥物動(dòng)力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在臨床中被廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物細(xì)菌感染的治療，這些藥物主要通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性、多環(huán)節(jié)抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[1-2]。隨著氨基糖苷類(lèi)抗生素的不當(dāng)使用，細(xì)菌耐藥問(wèn)題也日益突出，主要是由于細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物吸收量的減少、產(chǎn)生氨基糖苷類(lèi)鈍化酶(aminoglycosides-modifyingenzymes,AMEs)以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)的減少，其中產(chǎn)生氨基糖苷類(lèi)鈍化酶是細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥最重要的原因[3-4]。目前，革蘭氏陰性菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥比率、耐藥表型、耐藥機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)其耐藥模式能夠在不同種類(lèi)的細(xì)菌間傳播[5]。明確氨基糖苷類(lèi)作用機(jī)制與細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)耐藥機(jī)制、掌握細(xì)菌的耐藥基因流行情況顯得尤為重要。鑒于此，研究遼寧地區(qū)65株豬源大腸埃希菌株對(duì)鏈霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素和慶大霉素6種氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥性，并運(yùn)用建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)rpsl基因和4種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因進(jìn)行檢測(cè)與序列分析，旨在掌握遼寧地區(qū)流行的主要氨基糖苷類(lèi)耐藥基因，進(jìn)一步了解耐藥的分子機(jī)制，從分子水平對(duì)大腸埃希菌菌株耐藥及潛在耐藥問(wèn)題進(jìn)行分析和推測(cè)，進(jìn)而科學(xué)指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料和方法

1.1 菌株

65株從遼寧各地區(qū)分離、鑒定的豬源大腸埃希菌，由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存。

1.2 主要試劑

鏈霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素和慶大霉素藥敏紙片均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。DNAzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；ExTaqDNA聚合酶(5U/μL)、dNTP(2.5mmol/L)、溴化乙錠、DL2000DNAMarker、三羥甲基氨基甲烷核乙酸電泳緩沖液購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。其他試劑均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.3 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用K-B紙片擴(kuò)散法，病原菌純培養(yǎng)18～24h后，挑取純培養(yǎng)菌落置于無(wú)菌生理鹽水中，制成相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，用滅菌棉簽蘸取適量均勻涂抹到MH瓊脂培養(yǎng)基表面，反復(fù)幾次，最后沿平皿周邊繞2圈，貼好紙片后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18h，測(cè)量藥敏試紙?jiān)谄桨逯挟a(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑，判定結(jié)果依據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.4 耐藥基因的PCR檢測(cè)

1.4.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank上登錄的氨基核苷類(lèi)基因相應(yīng)的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成了5對(duì)特異性引物，序列見(jiàn)表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.4.2 細(xì)菌DNA模板的制備 將大腸埃希菌劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，挑選典型菌落，用滅菌生理鹽水制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，按DNAzol試劑說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 PCR反應(yīng)體系及條件 采用25 μL反應(yīng)體系:滅菌去離子水16.375 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 2 μL，ExTaqDNA聚合酶0.125 μL，上、下游特異性PCR引物各1 μL，DNA 2 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL上樣緩沖液混合后，在1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.4.4 耐藥基因PCR產(chǎn)物序列測(cè)定及分析 選取rpsl基因和4種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4陽(yáng)性樣品進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并與GenBank基因庫(kù)的相應(yīng)基因序列進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

采用K-B紙片擴(kuò)散法，對(duì)65株豬源大腸埃希菌進(jìn)行氨基糖苷類(lèi)藥物藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，共23株對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥，耐藥率為35.4%(23/65)。其中，對(duì)卡那霉素的耐藥率最高，為29.2%(19/65)；其次是鏈霉素26.2%(17/65)、慶大霉素21.5%(14/65)、新霉素18.5%(12/65)、妥布霉素15.4%(10/65)；對(duì)丁胺卡那霉素耐藥率最低，為4.6%(3/65) (表2)。

表2 65株豬源大腸埃希菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2 耐藥基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.1rpsl基因的PCR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)23株大腸埃希菌氨基糖苷類(lèi)耐藥菌株rpsl基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為374 bp的片段。

2.2.2 4種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因的PCR檢測(cè)結(jié)果 采用PCR方法對(duì)23株氨基糖苷類(lèi)耐藥菌株進(jìn)行aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4四種鈍化酶基因檢測(cè)。由表3可知，23株氨基糖苷類(lèi)耐藥菌株aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4耐藥基因總的檢出率為73.9%(17/23)；aac(3)-Ⅳ的檢出率為13.0%(3/23)，aadA的檢出率為8.7%(2/23),aac(6′)-Ⅰb-cr的檢出率為69.6%(16/23)，aacC4的檢出率為4.3%(1/23)。其中，15株攜帶1種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因，占所有菌株的65.2%(15/23)， 2株攜帶2種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因,占所有菌株的13.0%(2/23)，僅有1株攜帶3種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因，占所有菌株的 4.3%(1/23)，未發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶4種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因的菌株。

表3 23株大腸埃希菌中氨基糖苷類(lèi)藥物主要耐藥基因攜帶情況

2.3 耐藥基因的序列分析

將4種鈍化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4陽(yáng)性樣品的測(cè)序結(jié)果與GenBank基因庫(kù)的相應(yīng)基因序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，4種基因陽(yáng)性樣品的同源性分別為100%、99%、100%、99%，23株耐藥菌株經(jīng)rpsl基因測(cè)序后未發(fā)現(xiàn)突變。

3 結(jié)論與討論

同時(shí)用表型與基因型方法分析遼寧地區(qū)大腸埃希菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥性，結(jié)果表明，遼寧地區(qū)分離的大腸埃希菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素存在普遍耐藥性。通過(guò)表型研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌對(duì)鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素等常用的氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥性較高，對(duì)丁胺卡那霉素的耐藥性較低，這與前人的研究結(jié)果基本一致[4,6,7-8]。通過(guò)基因型研究發(fā)現(xiàn)，遼寧地區(qū)大腸埃希菌攜帶的主要氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因是aac(6′)-Ⅰb-cr，其次是aac(3)-Ⅳ、aadA、aacC4； rpsl基因在23株耐藥菌株中均有攜帶，且未發(fā)現(xiàn)突變。

rpsl基因的作用是編碼核糖體蛋白S12，核糖體蛋白S12也是鏈霉素等抗生素的作用位點(diǎn)。正常情況下，鏈霉素與S12蛋白結(jié)合后能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，rpsl基因突變則能使鏈霉素結(jié)合到核糖體上的能力降低，從而產(chǎn)生耐藥性。rpsl基因主要突變位點(diǎn)在43位(AAG→AGG)和88位(AAG→AGG)，常見(jiàn)的突變類(lèi)型為43位突變[7]。據(jù)報(bào)道，rpsl基因突變率較高，吳雪瓊等[10]對(duì)57株結(jié)核分枝桿菌耐藥基因型進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rpsl基因突變率達(dá)82.3%；Tsai等[9]對(duì)127株耐藥菌株通過(guò)測(cè)序的方法來(lái)鑒定rpsl基因突變，發(fā)現(xiàn)rpsl基因突變率可高達(dá)100%。本試驗(yàn)中23株菌株均檢測(cè)出rpsl基因，且均未發(fā)生突變，證明遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌對(duì)鏈霉素的耐藥不是由于rpsl基因突變導(dǎo)致的，鏈霉素耐藥可能存在其他的耐藥機(jī)制。

aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4四種基因?qū)儆诎被擒疹?lèi)鈍化酶基因，因產(chǎn)生鈍化酶而產(chǎn)生耐藥性。不同地區(qū)檢出的氨基糖苷類(lèi)鈍化酶的種類(lèi)和檢出率也有所不同。湯景元等[11]對(duì)我國(guó)19個(gè)省規(guī)模化豬場(chǎng)的大腸埃希菌進(jìn)行耐藥基因調(diào)查，檢出主要鈍化酶基因是aadA1和aaC2；于學(xué)輝等[12]對(duì)我國(guó)西南地區(qū)鴨源大腸埃希菌進(jìn)行耐藥基因調(diào)查，檢出的主要鈍化酶基因是ant(6″)-Ⅰa和ant(6″)-Ⅱa；孫慧等[6]對(duì)山東地區(qū)禽源大腸埃希菌進(jìn)行耐藥基因調(diào)查，檢出主要鈍化酶基因是ant(3″)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb、aph(3′)-Ⅱa。本試驗(yàn)中檢出遼寧地區(qū)大腸埃希菌攜帶的主要氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因是aac(6′)-Ⅰb-cr。aac(6′)-Ⅰb-cr屬于變異基因，首次在假單胞菌屬中被發(fā)現(xiàn)[13]，隨后在國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較多[14-17]。本研究結(jié)果表明，aac(6′)-Ⅰb-cr基因在氨基糖苷類(lèi)耐藥菌株中檢出率較高，這與前人研究結(jié)果一致。aac(3)-Ⅳ基因是至今為止唯一被確定的能夠引起慶大霉素、安普霉素交叉耐藥的基因，相關(guān)研究結(jié)果顯示，大約26%的慶大霉素耐藥大腸埃希菌分離株攜帶該基因[18-19]；aadA基因主要對(duì)鏈霉素進(jìn)行鈍化修飾，能夠通過(guò)耐藥質(zhì)粒在細(xì)菌間進(jìn)行耐藥基因的擴(kuò)散與傳播[20]；aacC4基因在大腸埃希菌中編碼AAC(3)-Ⅳ氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，AAC(3)-Ⅳ氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶對(duì)安普霉素、卡那霉素、慶大霉素、潮霉素及其他幾種氨基糖苷類(lèi)抗生素均有抑制作用[21]。

抗生素的持續(xù)使用引起了細(xì)菌的選擇性進(jìn)化壓力，產(chǎn)生抗生素耐藥菌，反過(guò)來(lái)又導(dǎo)致細(xì)菌病治療失敗和發(fā)病率的提高[22-24]。因此，對(duì)耐藥基因的研究能夠從分子水平上對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行推測(cè)，且能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥基因的變異等問(wèn)題[25]，對(duì)遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌感染的控制與治療具有重要意義。

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DetectionandAnalysisofResistanceGenestoAminoglycosideAntibioticsamongSwineEscherichia coliStrainsinLiaoningArea

LIANGQiao,ZHAOFengju*,GUGuibo,YANGBenyong,LIJingchun,WEIYuanyuan

(PreventionandControlCenterofLiaoningProvinceAnimalEpidemicDisease,Shenyang110164,China)

In order to investigate the aminoglycoside resistance ofEscherichiacoliisolated from swine in Liaoning,the drug sensitivity to six kinds of aminoglycosides antibiotics in 65 strains ofE.coliwere analyzed by K-B method.Meanwhile,PCR was used to detect and analyze the sequences of therpslgene as well as four aminoglycoside modifying enzyme genes includingaac(3)-Ⅳ,aadA,aac(6′)-Ⅰb-crandaacC4.Thehomologouscomparisonwereprocessedamongthedetectedgenesfromtheaminoglycoside-resistantstrainswiththesequencespublishedinGenBank.Theresultsindicatedthattheresistanceratestostreptomycin,tobramycin,neomycin,kanamycin,amikacinandgentamicinwere26.2%,15.4%,18.5%,29.2%,4.6%and21.5%,respectively.Inalltwenty-threeaminoglycoside-resistantstrains,thedetectionrateofrpslwas100%,andthedetectionratesofaac(3)-Ⅳ,aadA,aac(6′)-Ⅰb-crandaacC4were13.0%,8.7%,69.6%and4.3%,respectively.TheseresultssuggestedthattheseE.colistrainspresentedlowestaminoglycosideresistancetoamikacin,andalsorpslgeneandaminoglycosidemodifyingenzymegeneswerecommonlyfoundinE.coliisolatedfromswineinLiaoning.

swine; Escherichia coli;aminoglycosideantibiotics;drugresistancegene;PCR

2017-01-12

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201402573)

梁 喬(1991-)，女，遼寧莊河人，助理獸醫(yī)師，本科，主要從事畜病檢驗(yàn)工作。E-mail:15242494959@163.com

*通訊作者：趙鳳菊(1978-)，女，河北廊坊人，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物人畜共患病的防控與研究。 E-mail:fengjuzho2003@163.com

S

A

1004-3268(2017)06-0134-04