王燕，孫國祥

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；2.沈陽藥科大學藥學院，沈陽110016）

紫外聯(lián)合紅外光譜指紋圖譜整合評價三黃片質(zhì)量

王燕1,2，孫國祥2*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；2.沈陽藥科大學藥學院，沈陽110016）

目的：整合評價不同來源的30批三黃片樣品質(zhì)量。方法：建立三黃片紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜檢測方法，將兩種分析方法結果取均值整合后評價樣品質(zhì)量。結果：整合后的大部分樣品質(zhì)量等級均在合格范圍內(nèi)（質(zhì)量等級≤5）。結論：任何一種檢測方式都具有單一片面性，不能全面表征樣品真實質(zhì)量，需采用多種分析方法并用、全方位整合的技術手段才能客觀綜合地對其進行質(zhì)量評價，為中藥在其復雜組分未完全分離的情況下，提供了一種簡捷快速、全面客觀的定性定量質(zhì)控研究方法。

三黃片；紫外指紋圖譜；紅外指紋圖譜

三黃片由醫(yī)圣張仲景《金匱要略》中經(jīng)典名方“三黃瀉心湯”衍化而來，收載于歷版《中國藥典》。組方由大黃、黃芩浸膏和鹽酸小檗堿組成，主要成分為蒽醌類、黃酮類和生物堿類化合物，具備抗炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性，擁有瀉火通便、清熱解毒等功效，因用于治療咽喉腫痛、口鼻生瘡、尿黃便秘、牙齦腫痛〔1〕等癥而被臨床廣泛應用。目前，對其質(zhì)量控制的文獻報道主要集中在某一個或某幾個成分的定量分析以及定性指紋圖譜研究方面〔2-11〕，眾所周知，僅采用單一或少數(shù)幾個指標成分進行檢測不足以表征中藥尤其是復方制劑整體質(zhì)量。隨著科學技術的迅猛發(fā)展和現(xiàn)代分析技術手段的不斷提高，許多專家學者指出，中藥質(zhì)量應以中醫(yī)藥理論為指導思想，以中藥整體觀為基礎，體現(xiàn)多種分析技術檢測相結合的控制模式。

中藥指紋圖譜分析方法大多數(shù)以色譜指紋圖譜為主，而光譜指紋圖譜，如紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜因樣品前處理簡單、分析時間較短，檢測成本低廉等特點受到廣大分析工作者的日益關注。紫外光譜反映樣品中不飽和化學鍵（如雙鍵、三鍵、共軛體系及雜原子成分）的特征規(guī)律信息，常用于植物種類的分類判別、相似度評價或質(zhì)量一致性研究等，紅外光譜反映的是樣品中化學鍵振動轉(zhuǎn)動而產(chǎn)生的特征信息，具備信息量豐富且具有特征性和指紋性等特點，因此光譜指紋圖譜可以輔助色譜指紋圖譜從整體上實現(xiàn)對中藥質(zhì)量的控制。

綜上考慮，筆者從多種分析方法聯(lián)合、多維信息獲取、全方位整合、優(yōu)勢互補的角度出發(fā)，建立三黃片樣品紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜，將兩種分析方法結果平均整合后，評價30批樣品質(zhì)量，力求簡捷準確地反映其化學物質(zhì)的整體含量特征，為該中藥制劑的質(zhì)量分析提供一種全面合理的檢測手段。

1 材料

1.1 儀器Agilent1100型液相色譜儀（配有DAD檢測器，低壓四元梯度泵，在線脫氣裝置，自動進樣器）；Chemstation工作站（Agilent科技有限公司）；Sarturius-BS110S分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；BRUKER IFS55型紅外分光光度儀（瑞士布魯克公司）；AG285電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥來自19個廠家的30批三黃片樣品均購自沈陽各藥店（編號S1～S30），樣品信息見表1；色譜級甲醇購于山東禹王實業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

表1 30批三黃片樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 紫外指紋圖譜分析聚四氟乙烯管（650 mm× 0.12 mm），柱溫：（30.0±0.15）℃，流動相：甲醇，流速：0.8 mL∕min，進樣量：0.2μL。檢測波長：190～400 nm（DAD檢測器）。

2.1.2 紅外指紋圖譜分析Bruker IFS-55型傅立葉紅外分光光度儀；DTGS型檢測器；波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1；升溫速度為2℃∕min；掃描速度為20次∕s；分辨率為8 cm-1。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 紫外指紋圖譜分析取本品數(shù)片，除去包衣，研細（過三號篩），取約0.3 g，精密稱定，加95%乙醇20 mL回流提取2次，每次各1 h，合并濾液，減壓濃縮至約20 mL，用95%乙醇定容至25 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.2 紅外指紋圖譜分析取本品1片，除去包衣并研磨成極細粉（過200目篩），取約1 mg，置瑪瑙研缽中，加入干燥的KBr極細粉約200 mg，充分研磨混勻，轉(zhuǎn)移至模具中，使平鋪均勻，制成透明供試片后置于樣品光路中，扣除用同法制成的空白KBr片的背景干擾，記錄相應光譜圖。

2.3 線性定量指紋法原理在色譜條件固定的前提下，色譜峰面積在一定程度上與樣品組分含量呈線性關系〔12〕，故中藥復雜化學體系定量研究具有線性屬性關系。線性定性相似度SL見公式1。用以表征樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜所含化學成分在整體指紋數(shù)量和分布比例上的相似程度，其中r和r′分別為線性回歸方程中正向相關系數(shù)和反向相關系數(shù)；線性定量相似度ML見公式2。用以表征樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜所含化學成分整體含量的相似程度，其中b為線性回歸方程中的斜率，a為誤差項，另外，指紋均化性變異系數(shù)α見公式3，也用來表征樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的信號分布均一程度。因此，采用SL、ML和α相結合綜合評價中藥及其制劑整體質(zhì)量水平的方法稱為線性定量指紋法，據(jù)此可將中藥質(zhì)量等級劃分為8級。等級越高的樣品，其質(zhì)量越差。見表2。

2.4 三黃片紫外指紋圖譜的建立和評價

2.4.1 方法學考察精密度試驗：取S2樣品，按“2.2.1”制備1份，按“2.1.1”檢測條件連續(xù)進樣6次，以254 nm非分離色譜圖考察精密度，計算保留時間和峰面積RSD均分別小于1.0%和3.0%，表明檢測系統(tǒng)穩(wěn)定，精密度良好。

表2 線性定量指紋法質(zhì)量等級評價標準

穩(wěn)定性試驗：取S2樣品，按“2.2.1”制備1份，分別在樣品制備后0、2、4、8、12和24 h，按“2.1.1”檢測條件進樣測定，以254 nm非分離色譜圖考察穩(wěn)定性，計算保留時間和峰面積RSD均分別小于1.0%和3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

重復性試驗：取S2樣品，按“2.2.1”制備6份，按“2.1.1”檢測條件進樣測定，以254 nm非分離色譜圖考察重復性，計算保留時間和峰面積RSD均分別小于1.0%和3.0%，表明本方法重復性良好。

2.4.2 紫外指紋圖譜的建立將30批三黃片樣品依次進樣檢測，記錄190～400 nm在線紫外光譜圖，見圖1A，在210～230 nm，260～300 nm紫外吸收信號較強，提示黃酮及其苷類，蒽醌類的紫外光譜特征。將樣品信號導入自主研發(fā)的“中藥光譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0”軟件，以各數(shù)據(jù)點為計量單元按均值法生成對照指紋圖譜并根據(jù)線性定量指紋法計算各樣品SUV、MUV和αUV值，所得質(zhì)量結果見表3。

2.4.3 線性定量指紋法評價三黃片紫外指紋圖譜整體質(zhì)量由表3可知，8個質(zhì)量等級都分配給了所有樣品，可見來自19個廠家的30批樣品質(zhì)量差異顯著，例如S23為1級屬最優(yōu)產(chǎn)品，相反，S8、S17、S18、S28和S30均為8級屬最次產(chǎn)品。所有樣品SUV≥0.90，46.3%≤MUV≤253.8%，說明30批樣品紫外指紋數(shù)量和分布比例較為相似，但整體含量存在明顯差別。其中11批產(chǎn)品質(zhì)量等級＞5級，歸其原因主要為定量相似度MUV值的顯著差異，如S8、S12、S18、S20、S28和S30因MUV值過高（145%～253%）致使質(zhì)量等級≥6級；S17、S21、S22、S25和S27因MUV值過低（46%～67%）導致質(zhì)量等級≥6級。另外，來自同一生產(chǎn)廠家的藥品質(zhì)量一致性也略有差別，例如，S1和S2（購自于百善唐威藥業(yè)有限公司）擁有相同或相似的質(zhì)量等級，分別為2級和3級；而S25、S26和S27（購自于亞寶藥業(yè)）卻擁有不同的質(zhì)量等級，分別為6級、4級和7級。

2.5 三黃片紅外指紋圖譜的建立和評價

2.5.1 方法學考察精密度試驗：取S2樣品，按“2.2.2”制備1份，按“2.1.2”檢測條件連續(xù)進樣6次，記錄光譜圖，導入“中藥光譜指紋圖譜評價系統(tǒng)3.0”軟件，計算SIR≥0.995且RSD為0.13%，表明精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取S2樣品，按“2.2.2”制備1份，分別在樣品制備后0、1、2、3、4和6 h，按“2.1.2”檢測條件進樣測定，記錄光譜圖，導入軟件，計算SIR≥0.990且RSD為0.26%，表明樣品在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取S2樣品，按“2.2.2”平行制備6份，按“2.1.2”檢測條件進樣測定，記錄光譜圖，導入軟件，計算SIR≥0.990且RSD為0.58%，表明本方法重復性良好。

2.5.2 紅外指紋圖譜的建立將30批三黃片樣品依次壓片檢測，記錄光譜圖，見圖1B，3 600～3 000 cm-1大寬峰為黃酮類或酚酸類羥基伸縮振動引起；2 900 cm-1附件的吸收峰為亞甲基反對稱伸縮振動引起；1 800～1 500 cm-1的吸收峰為羧酸類或酯類羰基伸縮振動引起；將樣品信號導入“中藥光譜指紋圖譜評價系統(tǒng)3.0”軟件，按均值法生成對照指紋圖譜并根據(jù)線性定量指紋法計算各樣品SIR、MIR和αIR值，所得質(zhì)量結果見表3。

2.5.3 線性定量指紋法評價三黃片紅外指紋圖譜整體質(zhì)量由表3可知，樣品質(zhì)量差異較大，2批樣品（S17和S28）為1級；5批（S4、S7～S9和S27）為4級；5批（S14、S16、S22和S29、S30）為5級；4批（S10、S20和S23、S24）為6級；3批（S1、S2和S26）為7級；S3為8級；其余10批為3級。所有樣品SIR≥0.94，但65.6%≤MIR≤168.8%，說明30批樣品紅外指紋數(shù)量和分布比例較為相似，但指紋整體含量存在明顯差別。S1、S2、S3和S26因MIR值過高（＞140%）未達到質(zhì)量等級≤5為合格樣品的要求；而S10、S20、S23和S24則因MIR值過低（＜70%）。

表3 30批三黃片紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜相似度測定結果

2.6 整合兩種分析方法評價三黃片的質(zhì)量為避免單一方法評價的片面性，實現(xiàn)從多維角度、多方位整合評價中藥整體質(zhì)量，根據(jù)公式4～6對紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜分析結果進行整合，由表3可知，整合后的各樣品等級差異有所縮小，除S8和S18為8級，S22、S27和S28為6級外，其余樣品等級均在5級以內(nèi)且以1級、2級和3級居多。

圖1 30批三黃片樣品紫外（A）和紅外（B）光譜圖

圖2 不同評價方法得到的樣品質(zhì)量等級

2.7 不同分析方法的評價結果比較圖2描繪了三黃片在不同分析方法下的質(zhì)量等級情況，采用不同檢測方法得到的樣品等級不同，如S7在紫外指紋圖譜、紅外指紋圖譜和整合法時質(zhì)量等級分別為5、4和1級，差異較大，更進一步說明任何一種檢測方式因檢測原理不同都具有單一片面性，不能全面表征樣品真實質(zhì)量，需采用多種分析方法并用、全方位整合的方式才能客觀綜合地對其進行評價。鑒于同一檢測方式的各批樣品質(zhì)量差異主要來源于定量相似度這一現(xiàn)象，對上述不同分析方法得到的定量相似度作圖。見圖3。

3 討論

本文采用紫外指紋圖譜聯(lián)合紅外指紋圖譜共同評價三黃片質(zhì)量，運用多種分析技術共同監(jiān)測樣品中飽和、不飽和鍵的化學成分信息，試圖揭示各類化學組分的整體含量特征，從多角度展現(xiàn)中藥質(zhì)量全貌，為中藥在其復雜組分未完全分離的情況下，提供了一種簡捷快速全面客觀的定性定量質(zhì)控研究方法。

圖3 不同評價方法得到的樣品定量相似度結果

指紋圖譜表征中藥化學成分整體概況，但無法獲取相關藥效活性信息，指紋圖譜表征的成分是否代表藥效活性成分，與藥效相關程度如何，樣品質(zhì)量等級差異是否與藥效活性成分含量數(shù)量有直接相關關系目前尚未闡明，而且未經(jīng)藥效學驗證的化學指紋也有可能為無效成分。因此，構建化學組分與生物活性之間關聯(lián)度的譜效關系模型將在后續(xù)的實驗研究中開展并進行報導。

〔1〕國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部〔M〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

〔2〕高蘇亞，黨高潮，李華.高效毛細管區(qū)帶電泳法測定三黃片中黃芩苷〔J〕.中草藥，2007，38（7）：1012-1014.

〔3〕崔書亞，黃銥泠.循環(huán)伏安法測定三黃片中黃芩苷的含量〔J〕.綿陽師范學院學報，2008，27（11）：48-50.

〔4〕FENG Y L，YU B Y，DONG X P.Simultaneous determination of three kinds of components in sanhuang tablets by high-performance liquid chromatography〔J〕.Acta Pharmaceutica Sinica，2006，41（3）：285-288.

〔5〕ZHONG S.Simultaneous Determination of Six Active Ingredients of Sanhuang Tablet by HPLC〔J〕.Asian Journal of Chemistry，2013，25（15）：8549-8551.

〔6〕解軍波，張彥青，戚務勤.RRLC-MS∕MS法測定三黃片中小檗堿、黃芩苷和大黃素〔J〕.中草藥，2010，41（5）：739-741.

〔7〕王鈺瑩，馮偉紅，楊菲，等.“一測多評”法測定三黃片中的大黃蒽醌類成分〔J〕.中國中藥雜志，2012，37（2）：212-217.

〔8〕LIU Y，BIH，YOU F，etal.Determination ofthe fingerprint chromatogram of Sanhuang tabletby HPLC〔J〕.Asian JournalofChemistry，2012，24（10）：4522-4524.

〔9〕DU Q，TANG D Q，YANG D Z，et al.Combination of Fingerprint Analysis and Multiple Compounds Determination for the Quality Control of Sanhuang Tablet by HPLCDAD〔J〕.Latin American Journal of Pharmacy，2012，31（9）：1330-1340.

〔10〕張艷菊，吳清，倪健，等.不同廠家三黃片HPLC指紋圖譜的比較〔J〕.世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14（3）：1656-1662.

〔11〕鄭笑為，鐘家亮，馮媛媛，等.中成藥三黃片的X射線衍射Fourier指紋圖譜研究〔J〕.中國藥事，2007，21（10）：813-815.

〔12〕孫國祥，豆小文，楊蘭萍，等.高效液相色譜-線性指紋定量法評價人參歸脾丸的三波長指紋圖譜〔J〕.色譜，2013，31（5）：456-461.

The Integrated Use of Ultraviolet Spectrum Fingerprint Coupled with Infrared Spectrum Fingerprint to Comprehensively Assess the Quality Grades of San-huang Tablets

Wang Yan1,2，Sun Guoxiang2*
（1.College ofPharmacy and Chemistry,DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000,China；2.College ofPharmacy,Shenyang PharmaceuticalUniversity,Shenyang 110016,China）

Objective:To comprehensively evaluate the quality grades of 30 batches of San-huang tablets from diverse commercial brands.Methods:Ultraviolet spectrum fingerprint and infrared spectrum fingerprint were developed for the measurement of Sanhuang tablets.To evaluate the quality of the drug samples,SL,MLandαvalues were computed for each analytical method,and the integrated SL,MLandαvalues were also calculated by taking the average value of the above-established method.Results:Mostofthe samples were qualified（quality grade≤5）after the use of integrated method.Conclusion:Any detection method is single and onesided,and could notoverallcharacterize the tested samples,which reminds us thatitis essentialto adoptmulti-approaches to disclose the quality information oftraditional Chinese medicine and herbalpreparations.The strategy proposed in this study provides a simple, fast,comprehensive and objective approach for the quality control of traditional Chinese medicine and herbal preparations from both the qualitative and quantitative aspects,in the case thatcomplex components are notyetcompletely separated.

San-huang tablets;ultravioletspectrum fingerprint;infrared spectrum fingerprint

O657

A

2096-2266（2017）06-0031-06

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.06.008

（責任編輯李楊）

國家自然科學基金資助項目（81560695）；大理大學博士科研啟動基金資助項目（KYBS201512）

2016-10-18

2016-12-01

王燕，高級實驗師，博士，主要從事中藥質(zhì)量標準和體內(nèi)藥物分析研究.

*通信作者：孫國祥，教授，博士.