齊興柱，汪軍，劉磊

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4 2個谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、鑒定及其在外源氧化脅迫下的表達(dá)

齊興柱1,2，汪軍3，劉磊3

1 海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南?？?570228 2 海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南?？?570228 3 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所，海南?？?571101

齊興柱, 汪軍, 劉磊. Foc4 2個谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、鑒定及其在外源氧化脅迫下的表達(dá). 生物工程學(xué)報, 2017, 33(6): 995–1005.Qi XZ, Wang J, Liu L. Cloning and characterization of two glutathione S-transferases cDNAs in Foc4 and expression under exogenous oxidative stress. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 995–1005.

為鑒定香蕉枯萎病菌 (尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種，f. sp.44) 中的2個假想谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶 (GSTs) ，采用RT-PCR方法克隆了這2個GSTs基因cDNA編碼序列，隨后分別將2個基因定名為1和2。其中，1的開放閱讀框長609 bp，編碼202個氨基酸殘基，2的開放閱讀框長693 bp，編碼230個氨基酸殘基。進化樹分析表明：Fogst1屬于GSTs超家族的sigma(σ)亞型成員，F(xiàn)ogst2屬于GSTs超家族中目前未知的亞家族成員。為了驗證1和2的表達(dá)，分別構(gòu)建了1和2的原核表達(dá)重組載體pET28a-1和pET28a2，并將pET28a-1和pET28a2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得以可溶形式表達(dá)的重組蛋白Fogst1和Fogst2。GSTs 活性分析表明，以CDNB為底物檢測，2個重組蛋白均具有GSTs酶活性。分別取外源氧化脅迫處理后1、5、12、24 h菌絲樣品進行相對熒光定量PCR分析，結(jié)果表明：1和2在前5 h表達(dá)量均大幅上調(diào)，表達(dá)量隨后下調(diào)并恢復(fù)正常水平。這些結(jié)果均暗示1和2可能參與了4抗外源氧化脅迫過程。

4，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶，氧化脅迫

尖孢鐮刀菌古巴?；?號小種 (f.sp.4，4) 是香蕉枯萎病的病原菌，自2001年首次在海南省三亞鳳凰鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)以來，對海南省乃至我國香蕉種植業(yè)造成了重大影響。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (Glutathione-transferases，GSTs；EC 2.5.1.18) 是一種多功能酶，屬于一個超級蛋白家族，廣泛存在于動物、植物、真菌和細(xì)菌細(xì)胞中[1]。典型的GSTs是由兩個亞基組成的可溶性蛋白，通過催化毒素與還原性谷胱甘肽 (Glutathione，GSH) 結(jié)合，或者被動地與各種內(nèi)源性或外源性異型生物質(zhì)，包括致癌物、治療藥物、氧化應(yīng)激產(chǎn)物 (如活性氧等) 結(jié)合，參與細(xì)胞中的代謝、誘導(dǎo)脅迫、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，然后通過轉(zhuǎn)運蛋白將連有谷胱甘肽的代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運入液泡，從而達(dá)到解毒和保護細(xì)胞免受多種外界環(huán)境因素的毒害[2-8]。

近年來，許多研究證據(jù)表明，當(dāng)動植物受病菌侵染或寄生蟲侵害時，往往會引起寄主細(xì)胞內(nèi)活性氧的升高，而GSTs能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平，從而協(xié)助保護生物體免受損害[9-12]。由于GSTs對處于逆境脅迫環(huán)境中的細(xì)胞具有重要的解毒作用，人們對各種動植物的基因進行了廣泛研究。目前許多參與植物抗逆/抗病響應(yīng)的被分離鑒定，比如水稻的2顯著響應(yīng)稻瘟病菌的誘導(dǎo)[13]；在向日葵中，干旱、鹽、草酸、核盤菌及其代謝物均能誘導(dǎo)向日葵1基因的表達(dá)量出現(xiàn)顯著變化[14]；在番茄中，多個基因家族成員響應(yīng)SA和鹽脅迫[15]等。在動物中，也有報道西氏貝蛔蟲在侵入大熊貓腸道過程中，參與清除宿主免疫系統(tǒng)觸發(fā)的活性氧物質(zhì)[16]；在白菜黑斑病菌中，異硫氰酸鹽 (ITC) 誘導(dǎo)的活性分析表明，在白菜黑斑病菌清除寄主有毒代謝物及活性氧物質(zhì)并成功入侵寄主的過程中，5個分別屬于GSTFuA、GTT1、Ure2pB、GSTO和MAPEG亞家族的GSTs都發(fā)揮了必不可少的作用，比如屬于GSTFuA亞家族的GSTs表現(xiàn)出了GSH轉(zhuǎn)移酶活性，而屬于GTT1亞家族的GSTs則表現(xiàn)出了過氧化物酶的活性[17]。

前期的研究表明，4在侵染香蕉苗時，在入侵位點會遭遇寄主細(xì)胞的活性氧迸發(fā)現(xiàn)象[18]，同時，本課題組通過對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，4中基因多達(dá)27個，同時也發(fā)現(xiàn)，4在有香蕉苗誘導(dǎo)時，細(xì)胞內(nèi)多個的表達(dá)上調(diào)。而目前國內(nèi)外文獻均未見有關(guān)4功能研究的報道。為了進一步探究在4入侵香蕉苗的過程中是否參與解除寄主細(xì)胞產(chǎn)生的強氧化脅迫環(huán)境，本研究克隆了4中2個表達(dá)上調(diào)最顯著的基因完整的cDNA編碼區(qū)序列并利用生物信息學(xué)方法對其進行了歸類和命名，分析了2個基因在外源氧化脅迫條件下的表達(dá)特性，為探究它們在4入侵香蕉苗過程中的功能提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用菌株及培養(yǎng)條件

4的野生型B2菌株從海南省樂東縣發(fā)病 (香蕉枯萎病) 的田間巴西蕉根部采集，由本實驗室分離鑒定并保存。真菌菌株的培養(yǎng)采用葡萄糖-馬鈴薯培養(yǎng)基 (固體PDA、液體PDB)。為了提取H2O2處理不同時間的菌體總RNA，將在PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d的4 B2菌株在超凈工作臺中用6層擦鏡紙過濾收集濾液 (即孢子液)，然后按1∶50的比例將孢子液接種到新的PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，然后加入H2O2至終濃度10 μmol/mL，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，并分別于1、5、12和24 h收集菌體，液氮研磨，提取總RNA。克隆用大腸桿菌菌株DH5α和原核表達(dá)用菌株BL21(DE3)均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 試劑和引物

植物總RNA提取試劑盒，PCR Mix反應(yīng)混合物均購自北京天根生化科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒采用TaKaRa公司的RNA LA PCRTMKit。熒光定量PCR試劑盒采用2×one-step SYBR-Real-time RT-PCR Kit (北京百泰克公司產(chǎn)品)。PCR引物 (表1) 由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。GSTs酶活性檢測采用北京EBT公司的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測試 劑盒。

1.3 2個的克隆及生物信息學(xué)分析

利用H2O2處理后的野生型B2菌株轉(zhuǎn)錄組信息獲得了2個表達(dá)上調(diào)明顯的基因的cDNA信息，其編碼的假想蛋白GenBank登錄號分別為EMT69530.1和EMT62696.1。利用其cDNA序列信息在其起始密碼子和終止密碼子附近設(shè)計引物 (表1)，并以10μmol/mL H2O2誘導(dǎo)5h的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用普通PCR方法擴增、克隆后獲得了4的2個基因編碼區(qū)序列。分別將2個基因編碼區(qū)序列預(yù)測的蛋白質(zhì)序列在NCBI中進行Blast，獲得其他相關(guān)物種的基因的蛋白序列，參考Morel和Edgar等[19]以及Calmes等[17]的文獻也獲得一部分相關(guān)物種的基因的蛋白序列。

所應(yīng)用的生物信息學(xué)分析軟件包括：NCBI blast在線軟件http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi；NCBI結(jié)構(gòu)域預(yù)測在線軟件CDD http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.Cgi。ClustalX軟件對4的2個GSTs蛋白序列及所獲得的同源蛋白序列進行多重序列比對，以鑒定它們之間的同源性；MEGA7.0軟件[20]對所獲得的序列構(gòu)建了鄰位相接的系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Bootstrap方法 (1 000 replicates；seed=64 238)對該樹進行分析。

1.4 RT-PCR分析基因表達(dá)

按北京天根公司的植物總RNA提取試劑盒說明書提取處理后菌株的總RNA，然后利用2×one-step SYBR-Real-time RT-PCR Kit (Bioteke Corp.產(chǎn)品)，以3μg總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板，RT-PCR引物為：5￠-3￠-，5￠-3￠-、5￠-Actin、3-Actin(表1)。PCR反應(yīng)體系的總體積為25μL，其中含模板(總RNA)1.5μL，2×one-step SYBR mix 12.5μL，引物1.3μL (0.2 μmol/L)，RT-PCR MIX1.25μL，RNase-free H2O 7.15μL。PCR反應(yīng)在BIO-RAD公司的Mini OpticonTMRreal-Time PCR System上進行。PCR熱循環(huán)條件如下：94℃變性30s；退火溫度設(shè)梯度溫度48–50℃，并退火15s；72℃延伸15s；然后讀取熒光值，重復(fù)40個循環(huán)；最后從45℃到90℃，每隔0.2℃讀取溶解曲線熒光值，每讀數(shù)一次，停留2s。運行完畢后，從Opticon Monitor 3.1軟件讀取值，以β-actin基因作為內(nèi)參對照，利用2–法計算各基因的相對表達(dá)水平。

表1 本研究所用引物名稱及序列

1.51和2基因的原核表達(dá)

以含有1和2基因編碼序列的T載體為模板，含有HⅠ和Ⅰ的引物5￠-exp、3￠-exp、5￠-exp、3￠-exp進行PCR擴增并克隆到PM18-T載體，再將質(zhì)粒pMT18-T-1和pMT18-T-2用HⅠ和Ⅰ雙酶切，回收目的片段連接至用同樣酶切的表達(dá)載體pET28a，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-1和pET28a2，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中。菌株BL21(DE3)pET28a-1和菌株BL21(DE3) pET28a2 在LB培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)過夜，再以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至600為0.4–0.6，加入IPTG至終濃度分別為0、0.2、1和2 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)約3.5 h。取10 mL菌液離心收集菌體，去上清后加1 mL PBS緩沖液，菌體重新懸浮后超聲破碎菌體并離心，取16 μL上清及4μL 5×蛋白上樣緩沖液混勻變性后進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色后觀察結(jié)果。同時以轉(zhuǎn)入空白質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3) pET28a作對照。

1.61和2的原核表達(dá)產(chǎn)物酶活性分析

測定原理為GSTs催化GSH與CDNB結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物的吸收峰波長為340 nm；通過測定340 nm波長處吸光度上升速率計算GSTs的活性。將H2O2處理好的菌絲進行冰浴超聲波破碎后，經(jīng)離心，取上清作為待測的粗酶液置于冰上。測定方法如下：空白管：取1支石英比色皿，加入100 μL試劑一，900 μL試劑二和100 μL試劑三，迅速混勻后于340 nm測定吸光度變化，記錄10 s和310 s吸光度為1和2；測定管：取1支石英比色皿，加入100 μL待測粗酶液，900 μL試劑二和100 μL試劑三，迅速混勻后于340 nm測定吸光度變化，記錄10 s和310 s吸光度為3和4?；钚詥挝欢x為在常溫下，每毫升液體每分鐘催化1 nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個酶活單位。GSTs酶活性計算公式如下：

GSTs (nmol/(min·mL))=[(4–3)–(2–1)] ÷÷×106×反總÷樣÷=230×[(4–3)–(2–1)]

其中，：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×103L/(mol·cm)；：比色皿光徑，1 cm；106：1 mol=1×106μmol；反總：反應(yīng)體系總體積，1 100 μL=0.001 1 L；樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，100 μL=0.1 mL；：反應(yīng)時間，5 min。

2 結(jié)果與分析

2.14 2個酶基因的克隆鑒定

前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，4在入侵位點會遭遇寄主細(xì)胞因活性氧迸發(fā)而產(chǎn)生的強氧化脅迫環(huán)境。為探討4遭遇外源氧化脅迫時的分子應(yīng)對機制，采用H2O2模擬外源強氧化脅迫環(huán)境，處理4野生型B2菌株，并對其進行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個編號分別為和的基因相對于未用H2O2處理4野生型B2菌株的表達(dá)顯著上調(diào)。利用其cDNA序列信息在其起始密碼子和終止密碼子附近設(shè)計引物 (表1)，采用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (RNA LA PCRTMKit) 對4野生型B2菌株的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄后PCR擴增，獲得了和的cDNA序列，其cDNA編碼序列電泳結(jié)果如圖1所示。將PCR擴增獲得的2個cDNA片段克隆后送深圳華大基因研究院測序，測序結(jié)果與現(xiàn)有的和的cDNA序列比對表明成功獲得了和的cDNA的編碼序列。將2個基因編碼區(qū)預(yù)測的蛋白質(zhì)序列輸入到NCBI blast在線軟件，進行blast查詢比對和結(jié)構(gòu)域查詢，初步確定2個基因均為谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因。因此，分別將命名為1，命名為2。

2.2 2個GSTs酶的分類

通過Blast在線查詢和參考Mélanie Morel[19]和Calmes Benoit[17]的文獻獲得部分真菌的基因的蛋白序列。利用ClustalX軟件對4野生型B2菌株的2個GSTs酶蛋白序列及同源蛋白序列進行多重序列比對，以鑒定它們之間的同源性，并利用MEGA7.0軟件[21]對所獲得的多重序列比對結(jié)果構(gòu)建了鄰位相接的系統(tǒng)發(fā)育樹 (NJ-tree)，如圖2所示。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明：1被歸類為σ型(Sigma-class) GSTs酶，2被歸類為目前功能未知而且尚未命名的一類亞型(GST_N family unknown subfamily)。

2.31和2的原核表達(dá)與重組蛋白的活性測定

為了驗證1和2基因編碼蛋白的功能，構(gòu)建了1和2的原核表達(dá)載體。將1和2完整的編碼區(qū)用HⅠ和Ⅰ分別從pMT18-T-1和pMT18-T-2載體切下，連入經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體pET28a，分別得到pET28a-1和pET28a-2。分別將pET28a-1和pET28a-2轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，不同濃度IPTG誘導(dǎo)3.5 h收集菌體，同時以轉(zhuǎn)入pET28a空質(zhì)粒的菌體作對照。SDS-PAGE檢測顯示，圖3A的1、2、3和4號泳道分別為2、1、0.2和0 mmol/LIPTG誘導(dǎo)后的BL21(DE3) pET28a-1總蛋白電泳圖，5號泳道為BL21(DE3) pET28a的總蛋白電泳圖；圖3B中，1、2、3、5號泳道分別為2、1、0.2和0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的BL21(DE3) pET28a-2總蛋白電泳圖，4號泳道為BL21(DE3) pET28a的總蛋白電泳圖。從圖3可以看出，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3) pET28a-1菌株在分子量約為28 kDa處有明顯的蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期的Fogst1分子量基本一致，而且在0.2、1和2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下均有大量表達(dá)(圖3A)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3) pET28a-2菌株在分子量約為30 kDa處有明顯的蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期的Fogst2分子量基本一致，而且也是在0.2、1和2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下均有較大量的表達(dá)。菌體超聲破碎離心后，僅以上清液點樣電泳，即可見清晰表達(dá)條帶，說明2個重組蛋白主要以可溶形式存在于細(xì)胞中。GST可以催化CDNB 與GSH反應(yīng)，其產(chǎn)物在340 nm處有特征吸收，可用分光光度法檢測。基于該原理，以北京EBT公司的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶活性檢測試劑盒分別對經(jīng)2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3) pET28a-1和BL21(DE3) pET28a-2菌體破碎后的上清液進行了GSTs活性檢測。結(jié)果2種菌體上清中，均檢測到了明顯的GSTs活性(表2)，證明1和2編碼的蛋白質(zhì)屬于4的GSTs家族。

圖1 兩個谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因Fogst1和Fogst2 cDNA編碼序列的PCR擴增

圖3 SDS-PAGE分析重組Fogst1 (A) 和Fogst2 (B)蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)

表2 重組Fogst1和Fogst2蛋白的活性檢測

2.4 2個GSTs酶的在外源氧化脅迫條件下的mRNA水平表達(dá)

前期工作中的外源氧化脅迫條件細(xì)下的轉(zhuǎn)錄組測序表明，1、2兩個基因轉(zhuǎn)錄本相對于未處理樣品大幅增加，因此我們推測這兩個基因在此過程中必定發(fā)揮了作用，為了進一步驗證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中關(guān)于這兩個基因的數(shù)據(jù)是否準(zhǔn)確，利用終濃度為10 μmol/mL的外源H2O2模擬這種強氧化脅迫環(huán)境，采用半定量RT-PCR技術(shù)分析了兩個基因在H2O2處理1、5、12、24 h的相對表達(dá)量(圖4)。結(jié)果表明：1) 無論是1還是2，在前 5 h的表達(dá)均遠(yuǎn)高于12 h和24 h的表達(dá)，說明在外源H2O2存在的情況下，為參與清除外源H2O2，1和2基因表達(dá)均迅速上調(diào)；2) 在12–24 h的時間段，表達(dá)量已經(jīng)逐漸恢復(fù)到對照樣品的水平，說明培養(yǎng)液中外源H2O2因病原菌的清除及自身的降解已經(jīng)差不多消失完全，對4的菌絲生長的影響已經(jīng)很輕微了。

圖4 Foc4的2個谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因Fogst1和Fogst2在外源H2O2誘導(dǎo)條件下的相對表達(dá)狀況

3 討論

植物對病原菌入侵的最快防衛(wèi)反應(yīng)之一就是活性氧的急促釋放，稱為氧化爆發(fā) (Oxidative burst)，這種現(xiàn)象在植物抵抗病原菌入侵過程中具有重要作用。前期的研究工作中我們發(fā)現(xiàn)4在入侵香蕉苗后引起了香蕉苗根部活性氧迸發(fā)[14]。為了應(yīng)對植物寄主所產(chǎn)生的強氧化脅迫環(huán)境并成功入侵寄主，病原菌必須通過自身基因表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞代謝改變等一系列變化來應(yīng)對這種強氧化脅迫環(huán)境。為此，以H2O2模擬外源強氧化脅迫環(huán)境處理4野生型B2菌株并對其進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)1和2表達(dá)顯著上調(diào)。因此對這2個基因進行了克隆鑒定和表達(dá)分析驗證。

GSTs同工酶是一個超級蛋白家族，在其他物種中的研究也相對較多，對GSTs酶的分類也比較成熟，但真菌中GSTs酶的研究相對較晚。雖然在許多真菌中都有發(fā)現(xiàn)GSTs基因，但對真菌中GST的分類研究相對還很少，根據(jù)等電點的不同、底物特異性、對抑制劑的敏感性、免疫學(xué)特性和氨基酸序列相似性的不同，GSTs被分為許多亞型。如哺乳動物中可溶性GSTs有8種，分別為α、μ、π、σ、θ、ζ、κ和ω型[17]，植物中的可溶性GSTs有θ、ζ、φ、τ、λ型5種，昆蟲中的GST被劃分為3類，分別為σ、δ和ε型[22-23]。在真菌中GST的研究還相對較少，且已經(jīng)鑒定的真菌GSTs有些與已有的亞型相同，有些與已有的亞型不相同。比如，Morel和Ngadin等[24]利用已有的基因組數(shù)據(jù)，通過同源比對及進化分析等方法將19種子囊菌、8種擔(dān)子菌以及2種接合菌的GSTs超家族蛋白分為Omega、GTT1、GTT2、Ure2p、MAK16、EFBγ和GTE七大類，其中粟酒裂殖酵母中僅發(fā)現(xiàn)7個GSTs，而在褐腐菌中發(fā)現(xiàn)46個分屬于所有7類。而Morel和Edgar等[19]又認(rèn)為，真菌胞漿GSTs酶有8大類，分別為GTT 1、GTT 2、URE 2p、MAK 16、EFb1、GSTFuA、GSTO和GHR。傳統(tǒng)上，兩個蛋白質(zhì)的氨基酸序列一致性超過40%即認(rèn)為它們屬于同一種類型的蛋白質(zhì)，當(dāng)同工酶的氨基酸序列一致性低于20%即認(rèn)為它們不屬于同一種類型的蛋白質(zhì)[25]。然而，如果以這些基本序列作為唯一的標(biāo)準(zhǔn)，仍有許多“非規(guī)范的”GSTs酶在多種真菌中被發(fā)現(xiàn)，因而增加了GSTs酶分類的復(fù)雜性。比如，有幾個通常被歸為GSTs酶 (EF1Bg，MAK16) 的蛋白家族，是基于其在結(jié)構(gòu)上與GSTs酶的相似性，而不是以具有谷胱甘肽依賴的活性而被歸類為GSTs酶。而我們根據(jù)氨基酸基本序列采用同源比對及進化分析鑒定的4的2個GSTs酶中，F(xiàn)ogst1屬于σ亞型，F(xiàn)ogst2不屬于以上分類中的任何一種亞型。但根據(jù)2個基因原核表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測表明Fogst1和Fogst2均具有GSTs酶活性說明兩者均為4的GSTs酶。同時也說明真菌GSTs酶亞型分類的復(fù)雜性，目前的真菌GSTs酶亞型分類并不完善。

為了解1和2是否參與4與香蕉苗相互作用的過程，本研究運用RT-PCR技術(shù)分析了利用外源H2O2模擬香蕉苗根部所處的活性氧迸發(fā)環(huán)境來誘導(dǎo)1和2基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明1和2可能參與了4清除外源H2O2的過程。

4 結(jié)論

根據(jù)以上研究結(jié)果，得出如下結(jié)論：1) 從4中克隆得到2個基因1和2,說明2個基因在4中真實存在，其中，1的編碼序列長609 bp，編碼202個氨基酸殘基，2的編碼序列長693 bp，編碼230個氨基酸殘基。2) Fogst1屬于GSTs酶超蛋白質(zhì)家族中的σ亞型。3)1和2原核表達(dá)及活性檢測表明兩者均具有GSTs酶活性，說明兩者均為4中的GSTs酶。4) 在外源氧化脅迫存在的條件下，1和2的表達(dá)均有上調(diào)，進一步推測1和2均可能參與了消除4入侵香蕉苗時香蕉苗根部因活性氧迸發(fā)產(chǎn)生的強氧化脅迫環(huán)境。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Cloning and characterization of two glutathione-transferases cDNAs in4 and expression under exogenous oxidative stress

Xingzhu Qi1,2, Jun Wang3, and Lei Liu3

1 Key Laboratory of Tropic Biological Resources ,,570228,,2,,570228,,Institute of Environment and Plant ProtectionChinese Academy of Tropical Agricultural SciencesHaikouHainanChina

In order to identify two putative glutathione-transferase (GSTs) genes inf. sp.4 (4), cDNA sequences of the entire coding regionsthegenes were cloned from4 using RT-PCR method. Subsequently, thegenes were named1 and2 respectively. The length of open reading frame of1 was 609 bp and encoded a protein including 202 amino acid residues,2 possessed an open reading frame with 693 bp which encoded a 230-amino acid protein. Phylogenetic analysis showed that Fogst1 belonged to sigma (σ) subtype members of the GSTs superfamily, and Fogst2 was a new member of an unknown subfamily in the GSTs superfamily. To verify the expression of1 and2, the recombinant prokaryotic expression vector pET28a-1 and pET28a2 were constructed and transformed intoexpression strain BL21(DE3). The soluble recombinant proteins Fogst1 and Fogst2 were obtained after being induced by IPTG. GSTs activity assays showed that both of the two recombinant proteins had specific activity with CDNB. For real time RT- PCR analysis, the mycelium samples of4 were collected after treatment by H2O2for 1, 5, 12, 24 hours. The results showed that the expression of1 and2 were significantly up-regulated in the first 5 hours, and then decreased and returned to normal level. These results suggested that1 and2 may be involved in the process of4 resistance to exogenous oxidative stress.

4, glutathione-transferase, oxidative stress

10.13345/j.cjb.160474

December 11, 2016; Accepted:March 20, 2017

Xingzhu Qi. Tel/Fax: +86-898-66279214; E-mail: qixingzhu2013@163.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31560491), Doctoral Research Start-up Fund of Hainan University (No. kyqd5143).

國家自然科學(xué)基金(No. 31560491)，海南大學(xué)博士科研啟動基金(No. kyqd5143) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-04-11

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170411.1712.005.html