舒英杰，黃麗燕，陳明，陶源，王占奎，麻浩

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基于亞細胞定位的大豆和鷹嘴豆原生質體分離體系的建立與優(yōu)化

舒英杰1,2，黃麗燕2，陳明2，陶源2，王占奎2，麻浩2

1 安徽科技學院農學院，安徽鳳陽 233100 2 南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇南京 210095

舒英杰, 黃麗燕, 陳明, 等. 基于亞細胞定位的大豆和鷹嘴豆原生質體分離體系的建立與優(yōu)化. 生物工程學報, 2017, 33(6): 976–985.Shu YJ, Huang LY, Chen M, et al. Establishment and optimization of systems for protoplasts isolation of soybean and chickpea that used in subcellular location. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 976–985.

以湘豆3號大豆和型鷹嘴豆幼嫩葉片為材料，研究了酶解種類及配比、酶解液中甘露醇濃度、酶解液pH和酶解時間對兩種豆科植物幼嫩葉片原生質體產量和存活率的影響。結果表明，湘豆3號大豆葉片在含有0.5%纖維素酶Onozuka R-10、0.8%半纖維素酶Hemicellulase、0.8%離析酶Macerozyme R-10、0.4%果膠酶Pectolyase Y-23、0.1% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 (MES) 和10%甘露醇的酶解液中 (pH 6.0)，27 ℃黑暗條件下恒溫水浴振蕩 (45 r/min) 酶解6 h，分離得到的原生質體產量和存活率最高；型鷹嘴豆葉片在含有0.5%纖維素酶Onozuka R-10、0.8%半纖維素酶Hemicellulase、0.8%離析酶Macerozyme R-10、0.1% MES和10%甘露醇酶解液中 (pH 4.8)，27 ℃黑暗條件下恒溫振蕩水浴 (45 r/min) 7–8 h，分離得到的原生質體產量和存活率最高。通過上述件分離到的湘豆3號大豆和型鷹嘴豆幼嫩葉片原生質體用于亞細胞定位的效果最好。

大豆，鷹嘴豆，原生質體，分離體系，亞細胞定位

植物“原生質體”一詞最早由Hanstein提出，指通過質壁分離，能與細胞壁分離開的那部分植物細胞，包括細胞膜、細胞質和細胞核[1]。植物原生質體不僅與細胞一樣含有完整的遺傳物質，具有全能性，還能通過相互融合進而分化產生新的植株，能高效攝取外界DNA、細胞器、病毒等物質，并且可以用來分離和純化突變體，進行種質資源的超低溫保存等。目前原生質體技術已被用于包括原生質體培養(yǎng)及植株再生[2]、研究激素等因子對細胞的影響[3]、研究基因瞬時轉化[4]、分析蛋白互作[5]、研究細胞壁再生[6]以及研究標記蛋白的亞細胞定位[7]等各個方面，因此篩選出不同植物最適宜的原生質體分離條件具有十分重要的意義。

大豆([L.] Merrill) 是我國主要的糧油兼用作物，在我國農業(yè)生產中發(fā)揮重要作用，尤其是隨著玉米臨儲價的取消，大豆在我國種植業(yè)結構調整中發(fā)揮越來越大的作用，全國種植業(yè)結構調整規(guī)劃[8](2016–2020) 顯示，到2020年，我國大豆種植面積達到9.3×106hm2。鷹嘴豆L.具有很強的耐旱、耐寒、耐貧瘠及生物固氮等特性，在解決土壤干旱、退化等問題中作用獨特，對于保持水土和生態(tài)環(huán)境治理有積極作用[9]。大豆和鷹嘴豆是本實驗室近幾年來主要的研究材料，對大豆α亞基缺失[10]、種子田間劣變的蛋白質組學[11]、轉錄組學和基因組學[12]，鷹嘴豆抗旱種質篩選、抗旱相關基因的克隆與功能分析[13]等方面進行了較為系統的研究。

之前在分析基因功能時均以基因槍轟擊洋蔥表皮的方法進行相關基因的蛋白亞細胞定位研究，主要是由于洋蔥表皮細胞較大，有典型的植物細胞結構，便于基因槍操作。但由于洋蔥表皮細胞雖然含有細胞膜、細胞核、細胞壁、液泡等細胞器，但不含葉綠體，因此，利用洋蔥表皮細胞進行亞細胞定位研究存在一定的局限性。為此，本實驗以湘豆3號大豆和型鷹嘴豆幼嫩葉片為材料，研究了酶解液的種類及配比、酶解液中甘露醇濃度、pH值和酶解時間對兩種豆科植物原生質體產量和存活率的影響，以期為開展大豆和鷹嘴豆相關基因功能研究提供理論與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

以1–2葉期 (1對真葉展開，幼苗已具有兩個節(jié)并形成第一個節(jié)間) 湘豆3號大豆葉片和15–30 d苗齡 (具有5–6個葉序)型鷹嘴豆幼嫩葉片為材料，將葉片切成0.5–1.0 mm的細條置于酶解液中進行酶解，酶解條件為27 ℃、45 r/min、黑暗條件。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同酶解液組合、酶解液中甘露醇濃度、酶解液pH和酶解時間的篩選

前期預備實驗結果表明，型鷹嘴豆葉片在含有纖維素酶Onozuka R-10、半纖維素酶Hemicellulase和離析酶Macerozyme R-10的酶解液中酶解效果較好，而湘豆3號大豆葉片原生質體只有在添加果膠酶Pectolyase Y-23的條件下才能被酶解出來。不同酶解液組合采用正交實驗設計L9(34)，其中纖維素酶Onozuka R-10的濃度分別為0.5%、1.0%和1.5%，半纖維素酶Hemicellulase的濃度分別為0、0.4%和0.8%，離析酶Macerozyme R-10的濃度分別為0、0.4%和0.8%，果膠酶Pectolyase Y-23的濃度分別為0、0.2%和0.4%。酶解液中甘露醇濃度梯度設為8%、9%、10%、11%和12%；酶解液pH梯度設為4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4、8.8和9.2；酶解時間梯度設為4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h和12 h；每處理3次重復，分別統計不同處理湘豆3號大豆和型鷹嘴豆原生質體的產量和存活率。

1.2.2 原生質體產量和存活率的統計

湘豆3號大豆和型鷹嘴豆葉片原生質體分別用0.4%臺盼藍染液和0.1% FDA染液進行染色。染色后的湘豆3號葉片原生質體于電子顯微鏡下觀察計數，未被染色的為有活力的原生質體，被染成藍色的為死細胞；染色后的型鷹嘴豆葉片原生質體于熒光顯微鏡先在白光下統計總的原生質體數量，再切換到紫外激發(fā)光下記錄發(fā)綠色熒光的原生質體數量，發(fā)熒光的為有活力的原生質體。原生質體計數采用血球計數板計數法。

原生質體產量 (個/(g·FW)) =25個方格內原生質體總數/0.1×1 000×10

原生質體存活率 (%) =未被染色的原生質體數量/原生質體總數量×100

式中，0.1為中間25個方格的體積，單位為mm3；每1 mL酶解液中植物材料的鮮重為0.1 g。

1.2.3 亞細胞定位驗證

按上述方法分離出湘豆3號大豆和型鷹嘴豆幼嫩葉片的原生質體，將pA7空載體通過PEG誘導轉入原生質體中，培養(yǎng)12–16 h后，激光共聚焦顯微鏡下觀察標簽的表達，并采集照片。

2 結果與分析

2.1 不同酶解液組合對大豆和鷹嘴豆葉片原生質體分離的影響

不同酶液組合對湘豆3號大豆和型鷹嘴豆幼嫩葉片原生質體產量和存活率的影響見表1和表2。表1可知，不同酶液組合對湘豆3號大豆葉片原生質體產量和存活率有明顯影響，其中處理3、6和7的原生質體產量較高，分別為2.16×107個/(g·FW)、1.94×107個/(g·FW)和1.99×107個/(g·FW)；處理2、3、4和7的原生質體存活率較高，分別為83.97%、75.93%、72.09%和71.86%。綜合原生質體產量和存活率，湘豆3號葉片原生質體分離最適宜的酶解液組合為處理3，即酶組成為0.5%纖維素酶Onozuka R-10+0.8%半纖維素酶Hemicellulase+0.8%離析酶Macerozyme R-10+0.4%果膠酶Pectolyase Y-23。從原生質體產量來看，處理3最高(1.10×107個/(g·FW))，處理2次之 (1.04×107個/ (g·FW))，從原生質體存活率來看，處理2最高 (86.81%)，處理3次之 (83.71%)，但是處理3所用的半纖維素酶和離析酶濃度是處理2的2倍。因此，綜合考慮，認為型鷹嘴豆葉片原生質體分離最適宜的酶解液組合為處理2，即酶組成為0.5%纖維素酶Onozuka R-10+0.4%半纖維素酶Hemicellulase+0.4%離析酶Macerozyme R-10 (表2)。

2.2 酶解液中甘露醇濃度對大豆和鷹嘴豆葉片原生質體分離的影響

將大豆和鷹嘴豆幼嫩葉片分別置于2.1中的最優(yōu)酶解液組合中進行酶解，酶解過程中其他條件均保持一致，發(fā)現不同甘露醇濃度對大豆和鷹嘴豆原生質體分離效果影響顯著 (圖1)。隨著酶解液中甘露醇濃度的升高，湘豆3號大豆與型鷹嘴豆葉片原生質體的產量和存活率均呈現先升高后下降的趨勢，當酶解液中甘露醇濃度為10%時，原生質體的產量和存活率達最高，即湘豆3號大豆與型鷹嘴豆葉片原生質體分離最適宜的酶解液甘露醇濃度均為10%。

表1 不同酶解液組合對大豆葉片原生質體產量與存活率的影響

表2 不同酶解液組合對鷹嘴豆葉片原生質體產量與存活率的影響

圖1 甘露醇濃度對大豆和鷹嘴豆葉片原生質體分離的影響(圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著，P<0.05)

2.3 酶解液pH對大豆和鷹嘴豆葉片原生質體分離的影響

將切好的大豆和鷹嘴豆葉片分別置于pH不同的酶解液中進行酶解，其他條件均為2.1和2.2篩選得到的最優(yōu)條件，結果見圖2。由圖2可知，湘豆3號大豆葉片原生質體的產量和存活率均隨著酶解液pH的增大呈先小幅度升高隨后降低的趨勢，當酶解液pH為6時，原生質體產量和存活率均達到最大值；型鷹嘴豆葉片原生質體的產量和存活率總體隨著酶解液pH的增大呈逐漸下降趨勢，即型鷹嘴豆葉片原生質體分離最適宜的酶解液pH 為4.8。

2.4 酶解時間對大豆和鷹嘴豆葉片原生質體分離的影響

在最佳酶解液組合、酶解液中甘露醇最佳濃度及酶解液最佳pH確定的情況下，將切好的大豆和鷹嘴豆葉片分別置于最優(yōu)條件下進行酶解，觀察酶解時間對原生質體產量和存活率的影響，結果見圖3。隨著酶解時間的延長，湘豆3號葉片原生質體的產量呈先增后降趨勢，原生質體存活率總體呈逐漸降低趨勢；型鷹嘴豆葉片原生質體產量隨酶解時間的延長呈現先增加后降低的趨勢，而存活率則呈現緩慢降低的趨勢。綜合考慮原生質體產量與存活率，認為湘豆3號葉片原生質體分離最適宜的酶解時間為6 h，型鷹嘴豆葉片原生質體分離最適宜的酶解時間為7–8 h。

2.5 大豆和鷹嘴豆葉片原生質體分離及其在亞細胞定位中的應用效果

通過上述條件的優(yōu)化，將湘豆3號大豆幼嫩葉片在含有0.5%纖維素酶Onozuka R-10、0.8%半纖維素酶Hemicellulase、0.8%離析酶Macerozyme R-10和0.4%果膠酶Pectolyase Y-23的酶液中加10%甘露醇，pH為6.0時酶解6 h，在電子顯微鏡下觀察分離到的原生質體如圖4B、C所示；型鷹嘴豆幼嫩在含有0.5%纖維素酶Onozuka R-10、0.4%半纖維素酶Hemicellulase和0.4%離析酶Macerozyme R-10的酶液中加10%甘露醇，pH為4.8時酶解7–8 h，在熒光顯微鏡下觀察分離到的原生質體見 圖4E、F。由圖4可知，通過上述篩選方法分別從湘豆3號大豆和型鷹嘴豆葉片中分離出的原生質體數量較多，視野中破碎的原生質體較少，且活力較高。

圖2 酶解液pH對大豆和鷹嘴豆葉片原生質體分離的影響(圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著，P<0.05)

圖3 酶解時間對大豆和鷹嘴豆葉片原生質體分離的影響(圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著，P<0.05)

圖4 大豆和鷹嘴豆葉片原生質體分離效果

將上述方法分離得到的原生質體參照 Yoo等[14]的方法進行蛋白的亞細胞定位驗證，結果見圖5。圖5 A、B分別為連有綠色熒光蛋白GFP的空載體pA7轉入湘豆3號及型鷹嘴豆葉片原生質體的效果圖，可以明顯觀察到載體pA7在原生質體中的表達位置，效果較好，即通過本實驗分離到的大豆和鷹嘴豆葉片的原生質體可以應用于相關基因蛋白的亞細胞定位研究。

圖5 GFP載體在大豆和鷹嘴豆葉片原生質體中的亞細胞定位效果

3 討論

植物原生質體的分離方法主要有機械分離法和酶解分離法兩種，機械分離法是將細胞置于高滲溶液中使其發(fā)生質壁分離，再用利刃割破細胞壁使原生質體游離出來，利用此種方法獲得的原生質體數量較少，且受植物種類的限制；酶解分離法即將分離材料置于不同酶的混合液中酶解掉細胞壁從而游離出原生質體，這種方法獲得的原生質體數量大、完整性好，因此酶解法目前被廣泛應用于植物原生質體的分離。之前關于百脈根[15]和苜蓿[16]等豆科植物原生質體分離的研究均有報道，但尚未見關于鷹嘴豆原生質體分離研究的相關報道；大豆原生質體分離培養(yǎng)的報道主要有懸浮細胞[17]、幼莢[18]、未成熟種子的子葉[19-20]、幼苗子葉[21-22]、葉肉細胞[23]等，但是這些方法均不適用于湘豆3號大豆幼嫩葉片原生質體的分離。因此，本實驗在參考前人研究的基礎上，通過對最佳酶液組合、酶解液中甘露醇濃度、酶解液pH及酶解時間的篩選，建立并優(yōu)化了湘豆3號大豆和型鷹嘴豆幼嫩葉片原生質體分離體系。

由于細胞壁的主要組成成分是纖維素、半纖維素和果膠，因此本實驗選用了纖維素酶Onozuka R-10、半纖維素酶Hemicellulase和離析酶Macerozyme R-10用來分離原生質體，而研究過程中發(fā)現，在僅有這3種酶存在的情況下，湘豆3號大豆葉片原生質體幾乎不能被分離出來，因此向酶解液組合中添加了果膠酶Pectolyase Y-23，實驗結果表明分離效果較好。前人研究發(fā)現酶解液組合、酶解液中甘露醇濃度、酶解液pH及酶解時間都會對原生質體的分離效果有較大影響，本研究通過正交實驗和單因素比較實驗研究了這些因素對湘豆3號大豆和型鷹嘴豆幼嫩葉片原生質體分離的影響，并篩選出了適合湘豆3號大豆和型鷹嘴豆幼嫩葉片原生質體分離的最佳酶液組合、酶解液中甘露醇濃度、酶解液pH及酶解時間。研究發(fā)現，兩種豆科植物材料原生質體分離的最適宜條件存在一定差異，這可能是由于不同植物以及不同取材部位細胞的細胞壁結構及組成不同導致的。

植物原生質體活力檢測方法主要有形態(tài)識別法、熒光顯微鏡識別 (FDA法)、酚藏花紅染色法、伊凡藍 (Evan’s blue) 染色法、臺盼藍染色法、噻唑藍 (Thiazolyl blue，MTT) 染色法等[24-25]。本實驗過程中將分離后的型鷹嘴豆葉片原生質體用FDA染色，效果很好，視野清晰，能清楚地區(qū)分有無活力的原生質體；將此種染色方法應用于湘豆3號大豆上，效果則不明顯，原生質體不能被很好地染色，熒光較淡，有活力的原生質體與無活力的原生質體界線不明晰，改用臺盼藍染液染色后效果較好。由于使用FDA對湘豆3號大豆和型鷹嘴豆葉片原生質體進行染色時操作方法完全相同，因此推測造成這種差異的原因可能跟物種差異 有關。

植物原生質體一個重要作用就是應用于蛋白的亞細胞定位研究，關于蛋白亞細胞定位的方法目前主要有利用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞、利用根癌農桿菌侵染煙草葉片以及PEG轉化原生質體法等。應用不同體系研究蛋白的亞細胞定位可能會出現不同的結果[22]，本實驗室之前也一直利用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞的方法進行蛋白的亞細胞定位研究，但是實驗結果經常不理想。因此，希望建立一套實用性更強、效果更好的大豆和鷹嘴豆相關蛋白的亞細胞定位研究體系。本研究建立的湘豆3號大豆和型鷹嘴豆幼嫩葉片原生質體分離體系分離出的原生質體數量多、存活率高，可以明顯觀察到空載體pA7在原生質體中的表達位置，效果較好，適合于相關蛋白的亞細胞定位研究。

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(本文責編 郝麗芳)

Establishment and optimization of systems for protoplasts isolation of soybean and chickpea that used in subcellular location

Yingjie Shu1,2, Liyan Huang2, Ming Chen2, Yuan Tao2, Zhankui Wang2, and Hao Ma2

1 College of Agronomy, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, Anhui, China 2 State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

Young leaves ofchickpea as well as soybean., which are the current plants that studied in our laboratory were selected as materials. Effects on protoplasts yield and survival rate of different enzyme combination, concentration of D-Mannitol in enzyme combinations, pH of enzyme combinations and enzymolysis time are detected. The results showed that, the best condition for.leaf protoplasts isolation is to rotate the cut materials for 6 hours in enyzme solution under temperature of 27 ℃ and rotate speed of 45 r/min for 6 h. Onozuka R-10 (0.5%), Hemicellulase (0.8%), Macerozyme R-10 (0.8%) in combination with Pectolyase Y-23 (0.4%) dissolving in CPW solution with MES (0.1%) and Mannitol (10%), pH 6.0 was found best for protoplasts isolation of.leaves.The best condition for protoplasts isolation ofchickpea is to put the cut materials into enzymatic hydrolysate enzymolyse for 7 to 8 hours under temperature of 27 ℃ and rotate speed of 45 r/min on water bath shaker, the optimum combination of enzyme consists of Onozuka R-10 (0.5%), Hemicellulase (0.8%), Macerozyme R-10 (0.8%), MES (0.1%) and Mannitol (10%) dissolved in CPW solution with pH 4.8. The protoplasts prepared with the methods above are used in subcellular location and the effects show well.

soybean, chickpea, protoplasts, isolation system, subcellular location

10.13345/j.cjb.170086

March 4, 2017; Accepted:April 19, 2017

Yingjie Shu. Tel/Fax: +86-550-6732029; E-mail: shuyj@ahstu.edu.cn Hao Ma. Tel/Fax: +86-25-84395324; E-mail: Lq-ncsi@njau.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31101212, 31171572, 31371711), Natural Science Foundation of Anhui Province (No. 1608085MC69), the Youth Talent Major Project of College and University of Anhui (No. gxyqZD2016216).

國家自然科學基金 (Nos. 31101212, 31171572, 31371711)，安徽省自然科學基金 (No. 1608085MC69)，安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目 (No. gxyqZD2016216) 資助。

網絡出版時間：2017-05-03

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