李曉樓

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石油污染對土壤微生物群落多樣性的影響

李曉樓

四川職業(yè)技術學院，四川遂寧 629000

李曉樓. 石油污染對土壤微生物群落多樣性的影響. 生物工程學報, 2017, 33(6): 968–975.Li XL. Influence of oil pollution on soil microbial community diversity. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 968–975.

土壤中的微生物主要有細菌、放線菌、真菌三大類群，微生物在石油污染的土壤中發(fā)揮著維持生態(tài)平衡和生物降解的功能。文中以四川省遂寧市射洪縣某廢棄油井周圍不同程度石油污染土壤為供試土壤，首先對各組供試土壤的基本理化性質進行測定分析；然后采用平板菌落計數(shù)法測定了供試土壤中三大類微生物數(shù)量的變化，結果表明：相比未被污染的對照土壤，石油污染的土壤中細菌、放線菌、真菌數(shù)量均減少，并且土壤中可培養(yǎng)微生物的數(shù)量與土壤含水量呈正相關；再采用454焦磷酸測序技術對土壤中的細菌群落多樣性及變化進行16S rRNA基因分析。在所有供試的4個土壤樣品中，共鑒定出不少于23 982個有效讀取序列和6 123種微生物，相比于未被污染的對照土壤，石油污染土壤中細菌的種類更加豐富，主要優(yōu)勢門類為酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門和變形菌門。但不同土壤樣品中優(yōu)勢菌群的群落結構有所差異，石油污染的土壤中，酸桿菌門、放線菌門和變形菌門的數(shù)量最多，未被石油污染的土壤中，放線菌門、擬桿菌門和變形菌門的數(shù)量最多。

石油污染土壤，454焦磷酸測序，16S rRNA，微生物群落多樣性

原油是一種由各種烴類和有機化合物組成的復雜混合物，原油泄露會帶來非常嚴重的環(huán)境問題[1-2]。盡管原油工業(yè)會帶來相應的經(jīng)濟效益，但石油泄露會影響并改變土壤微生物群落結構和生物地球化學循環(huán)，同時對土壤肥沃的可持續(xù)性和環(huán)境質量帶來非常嚴重的負面影響。石油污染物進入土壤后會影響植被的生長和人類的健康[3]。

土壤作為微生物主要的棲息地，是地球環(huán)境中生物多樣性最豐富的地方[4]。土壤微生物對維持環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)平衡發(fā)揮著至關重要的作用。此外，土壤中微生物群落的多樣性與其周圍的生態(tài)系統(tǒng)密切相關，是保持土壤生產(chǎn)力的重要組分之一。近年來，在污染土壤領域有很多關于土壤中微生物的物種多樣性[5]、遺傳多樣性[6]、結構多樣性[7]和功能多樣性[8]的研究。

隨著科學技術的不斷進步，現(xiàn)代分子生物學方法能夠極大地幫助我們了解微生物群落及其多樣性[9]。但是對于一些微生物成分復雜的樣品，分子生物學方法只能檢測樣品中的一些優(yōu)勢菌群，而不能鑒定樣品中微生物種類及含量[10-11]。由羅氏公司發(fā)明的454焦磷酸測序技術可以對細菌的16S rRNA基因進行焦磷酸測序并分析，從而能夠鑒定出樣品中細菌的種類及含量。該技術能夠克服一般分子生物學方法的局限性，并有效地檢測環(huán)境中細菌的種群和含量[12-13]。目前該技術已在各種環(huán)境中，如廢水、生物淤泥及石油污染土壤等樣品中檢測了細菌群落及多樣性[14]。

通過研究石油污染對土壤中的微生物群落影響并評估這些土著微生物降解石油的能力，能夠為環(huán)境污染的生物修復技術起到強有力的指導作用。本研究首先對各組供試土壤的基本理化性質進行測定分析；然后采用平板計數(shù)法測定在不同程度石油污染的土壤中細菌、放線菌及真菌數(shù)量的變化；再采用454焦磷酸測序技術測定在不同程度石油污染的土壤中原核微生物群落結構及其多樣性，為石油污染土壤的微生物修復提供有效的生物修復策略。

1 材料與方法

1.1 供試土壤、樣品處理及理化參數(shù)的測定

本次實驗以四川省遂寧市射洪縣某廢棄油井周圍不同程度石油污染土壤作為供試土壤。在本研究中，一共采集了4個土壤樣品，均來自同一廢棄油井地區(qū)。其中2個樣品分別隨機取自靠近廢棄油井周圍的土壤，另外2個樣品分別取自離油井100 m (石油輕度污染土壤組) 處和1 500 m (未被石油污染對照組) 處的土壤。所有土壤樣品均采集于離地表層20 cm處，每個樣品均分為3等份，一份用來測定土壤中的基本理化組分及石油的含量，一份用來測定土壤中3大類微生物數(shù)量，一份用來測定土壤中細菌群落的多樣性及結構。

采用烘干法[15-16]測定土壤的含水率，步驟為：稱取10 g篩好的土樣，裝入鋁盒稱重，打開鋁盒蓋，于105 ℃干燥8 h，再蓋上鋁盒蓋，稱重。以如下公式計算含水率：土壤含水率(%)=(濕土重–烘干土重)/烘干土重×100%[16]；采用電位計法[17-18]測定土壤pH；采用凱氏定氮法[19]測定土壤中的全氮含量；采用酸溶-鉬銻抗比色法[17]測定土壤中的全磷含量；采用重鉻酸鉀容量法[17]測定土壤中的有機質含量；采用手持電導率儀測定土壤浸出液的電導率(FiveEasy30，Mettler Toledo，Sweden)[17]；采用超聲-紫外法[17]測定土壤中石油的含量。表1列出了這些土壤的基本成分及特性。

1.2 土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量的測定

采用選擇性培養(yǎng)基及平板菌落計數(shù)法對土壤中三大類微生物的數(shù)量分別進行測定。分離細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，瓊脂糖15 g，氯化鈉5 g，單蒸水定容至1 000 mL pH 7.2，0.1 MPa，121 ℃滅菌后倒板；分離放線菌采用改良后的高氏I號培養(yǎng)基：KNO31 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，瓊脂18 g，淀粉20 g (先加入少量水調制成糊狀)，單蒸水1 000 mL，0.1 MPa，121 ℃滅菌后倒平板。臨倒平板時加入重鉻酸鉀溶液，以抑制細菌和霉菌的生長，同時調節(jié)pH 7.2–7.4；分離真菌采用酸性馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基：稱取200 g新鮮馬鈴薯，洗干凈后去皮切碎，加入1 000 mL單蒸水煮沸30 min，然后采用紗布過濾，濾液定容至 1 000 mL，再加15 g葡萄糖和15–20 g瓊脂，充分溶解后趁熱再次紗布過濾，分裝三角瓶，0.1 MPa，121 ℃滅菌后倒平板備用。

1.3 細菌16S rRNA基因的提取及PCR擴增

采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit (OMEGA，Georgia，GA，USA) 從1 g土壤中提取微生物總基因組DNA，每組樣品分別提取3次后合并在一起。細菌的16S rRNA基因大約由1 540個核苷酸組成。在本文中采用的16S rRNA基因擴增的通用引物為：正向序列fD1 (5′-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，反向序列E533R (5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)[19]。PCR擴增的產(chǎn)物為16S rRNA 基因上1–500 bp的DNA片段。PCR擴增反應的總體積為20 μL，包括 5 ng DNA模板，5 μmol/L引物 (0.8 μL)，2.5 mmol/L dNTPs (2 μL)，4 μL 5×Fast Pfu緩沖液，和0.4 μL Fast Pfu聚合酶(Applied Biosystems，California，CA，USA)。PCR擴增反應程序為：94 ℃，2 min，1個循環(huán)；然后94 ℃，30 s；55 ℃，30；72 ℃，1 min的條件下進行35個循環(huán)，最后72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物的分子量為450 bp，采用2%瓊脂糖凝膠鑒定。

1.4 細菌16S rRNA基因的焦磷酸測序及數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒(OMEGA，USA) 進行純化，采用羅氏454焦磷酸測序儀器(Roche 454 Life Sciences，Branford，CT，USA) 對200 ng純化后的PCR產(chǎn)物進行測序。所得序列用Mothur[20](v.1.21.1) 軟件處理分析。為了改善焦磷酸測序數(shù)據(jù)的質量以及消除隨機測序錯誤的影響，我們從測序的數(shù)據(jù)庫中刪除了一些有缺陷的數(shù)據(jù)，包括：q平均值小于25，有效讀取序列小于200 bp等[21]。然后將所得到的序列與Mothur提供的RDP參考序列和分類系統(tǒng)進行比對和分類。采用基于序列相似度的方法將序列分為不同的操作分類單位OTUs (Operational taxonomic units，即OTUs，序列相似度大于97%可定義為同一種OTU)，每一個OTU通常被視為一個微生物物種。相似性小于97%就可以認為屬于不同的種，相似性小于93%–95%，可以認為屬于不同的屬。樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度都是基于對OTU的分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對供試土壤基本成分的數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計。采用GraphPaD Prism 5作圖軟件及-test對供試土壤微生物數(shù)量進行作圖統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 供試土壤理化性質研究

2.2 供試土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量的測定

從圖1中可以看出，石油污染土壤中含有的細菌、放線菌及真菌的數(shù)量相比于未被污染的對照組均有所減少，并且土壤中總的可培養(yǎng)微生物數(shù)量與土壤中水分的含量呈現(xiàn)出明顯的正相關趨勢。另外在未被污染的土壤中放線菌的數(shù)量遠遠大于另外3種土樣的數(shù)量，表明在被石油污染的土壤中，放線菌的生長受到抑制。

表1 供試土壤的基本理化性質分析

圖1 供試土壤中各種微生物的數(shù)量與含水量的關系

2.3 供試土壤中細菌群落多樣性的研究

表2表示樣品經(jīng)過454焦磷酸測序并分析后的結果，其中從4組樣品中一共分析了23 982個有效讀取序列。在所有的土壤樣品中一共有 6 246個操作分類單位 (Operational taxonomic units，OTUs)。在兩組石油污染的土壤中，其OTUs數(shù)值均明顯高于未被污染的土壤對照組。Chao1豐富度估計量 (Chao1 richness estimator)、香農(nóng)-威納多樣性指數(shù) (Shannon-Wiener diversity index)、辛普森多樣性指數(shù) (Simpson diversity index) 等測量數(shù)據(jù)均表明被石油污染后的土壤中細菌的種類增加。

2.4 供試土壤中微生物的群落結構分析

根據(jù)測序結果，我們一共從4組土壤樣品中分析出29個不同的門類。其中，酸桿菌門 (Acidobacteria)、放線菌門 (Actinobacteria)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)、綠彎菌門 (Chloroflexi)、浮霉菌門 (Planctomycetes) 和變形菌門(Proteobacteria) 為優(yōu)勢菌群，共占據(jù)細菌總含量的80%左右。然而在不同的土壤樣品中，優(yōu)勢菌群的群落結構有所差異。從圖2中可以看出，在石油污染的土壤中，酸桿菌門 (Acidobacteria)、放線菌門 (Actinobacteria) 和變形菌門 (Proteobacteria) 的含量最多。在未被石油污染的土壤中，放線菌門 (Actinobacteria)、擬桿菌門 (Bacteroidetes) 和變形菌門 (Proteobacteria) 的含量最多。并且，在石油污染的土壤中，變形菌門 (Proteobacteria)、浮霉菌門 (Planctomycetes)、綠彎菌門 (Chloroflexi) 和酸桿菌門 (Acidobacteria) 的含量明顯多于未被污染的對照組，而擬桿菌門 (Bacteroidetes)、放線菌門 (Actinobacteria) 的含量則明顯少于未被污染對照組。

表2 供試土壤樣品中細菌群落的多樣性

–: Data not available.

圖2 供試土壤樣品中主要菌落的相對含量

3 結論與討論

迄今為止，大量關于石油污染的生物修復研究都集中在從油污土壤中分離出細菌的混合物，然而卻很少有人去研究油污土壤中微生物的群落結構及其多樣性。在本文中，我們分析了四川省遂寧市射洪縣某廢棄油井周圍油污土壤中各種微生物的群落結構及其多樣性，實驗結果證明：相比于無油污對照土壤，油污土壤中的微生物種類更加豐富，群落結構更加復雜。

1.1 資料來源 納入標準：符合國際尿控協(xié)會PFD診斷標準[6]；單胎妊娠；陰道自然分娩；無會陰側切；產(chǎn)道輕度撕裂傷；無盆腔感染等病史；子宮脫垂POP-Q 0度、Ⅰ度、Ⅱ度；自愿參與本研究；治療耐受力和依從性良好。排除標準：泌尿系、生殖系統(tǒng)感染、腫瘤等疾病；產(chǎn)道嚴重撕裂傷；認知障礙或有精神疾??；治療依從性差；抵觸本研究。分組方案：采用隨機數(shù)字表法隨機分為研究組和對照組，兩組患者基線資料對比具有可比性(P>0.05)。見表1。

Sutton等[23]的研究結果表明，在長期受柴油污染的土壤中，其土壤中的微生物群落結構及多樣性發(fā)生了改變，土壤中的主要優(yōu)勢菌群有變形菌、厚壁菌門、放線菌、酸桿菌門和綠彎菌門。然而，在我們的研究中，如圖2所示，石油污染的土壤中主要的優(yōu)勢菌群有酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門和變形菌門，其中放線菌門和浮霉菌門對石油的降解起到了重要的作用[23]。此外，相比于未被污染的對照土壤組，石油污染的土壤組中的酸桿菌門的含量明顯升高，這可能是由于石油污染組的土壤偏堿性導致的，這也與供試土壤測量的pH值結果相符合 (表1)。因此，在不同類型的油污土壤中，其微生物的群落結構和主要優(yōu)勢菌群存在一定的差異。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)土壤中微生物的數(shù)量與土壤的含水率表現(xiàn)出一定的正相關趨勢，這一結論與任芳菲等[24]的研究結果相符，為干旱地區(qū)油污土壤的治理，增加油污土壤中微生物含量，進而提高微生物的降解效率提供依據(jù)和思路。油污土壤處于長期濕潤和長期干燥兩種條件下，土壤中微生物的數(shù)量及多樣性可能存在差異，由于受條件限制，本文沒有深入研究。

本研究報告了石油污染的土壤中微生物多樣性的變化，并利用焦磷酸測序技術對石油污染的土壤中原核微生物的群落結構及多樣性進行了分析。結果表明，相比于干凈的土壤，油污土壤中的微生物種類更加豐富，能夠降解油污的菌群明顯增多，主要優(yōu)勢菌群發(fā)生改變。這些數(shù)據(jù)能夠幫助我們更好地了解和利用各種土著微生物在石油污染土壤微生物修復中的作用。

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(本文責編 陳宏宇)

Influence of oil pollution on soil microbial community diversity

Xiaolou Li

Sichuan Vocational and Technological College, Suining 629000, Sichuan, China

Bacteria, actinomycetes and fungi are the three major groups of soil microbes. Soil microbes play a critical role in ecological and biodegradation processes in petroleum-contaminated soils. Based on the actual situation, this study took the oil polluted soil around the abandoned oil well in Shehong County, Suining City, Sichuan Province as the test soil. First, we determined the physiochemical properties of the tested soil; then we analyzed the changes of physiochemical properties and the three major microbes in petroleum contaminated soils. The number of the three major microbes in contaminated soils was relatively fewer than uncontaminated samples, and the water content of the soil was in positive correlation with the number of microbes. Also we assessed the soil bacteria community diversity and changes therein in petroleum-contaminated soils using 454 pyrosequencing of 16S rRNA genes. No less than 23 982 valid reads and 6 123 operational taxonomic units (OTUs) were obtained from all 4 studied samples. OTU richness was relatively higher in contaminated soils than uncontaminated samples. Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Planctomycetes and Proteobacteria were the dominant phyla among all the soil samples. However, the prokaryotes community abundance of phyla was significantly different in the four samples. The most abundant OTUs associated with petroleum-contaminated soil sample were the sequences related to Acidobacteria, Actinobacteria and Proteobacteria, whereas the most abundance sequences with uncontaminated sample were those related to Actinobacteria, Bacteroidetes and Proteobacteria.

petroleum contaminated soil, 454 pyrosequencing, 16S rRNA, microbial community diversity

10.13345/j.cjb.160467

December 2, 2016; Accepted:February 9, 2017

Xiaolou Li. Tel:+86-825-2221989; E-mail: nh3749@163.com

Supported by:Sichuan Provincial Department of Education Key Projects (No. 13ZA0036).

四川省教育廳重點基金項目(No. 13ZA0036) 資助。