梁宏偉，李忠，羅相忠，鄒桂偉*

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黃顙魚(yú)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1基因的克隆及表達(dá)分析

梁宏偉1,2，李忠1，羅相忠1，鄒桂偉1*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北武漢 430223；2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430070)

為研究黃顙魚(yú)()胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1基因()的特征，闡明基因在不同性別黃顙魚(yú)組織中的表達(dá)特征和IGFBP1蛋白在雌、雄黃顙魚(yú)肌肉中的表達(dá)差異，克隆基因的cDNA全長(zhǎng)，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和Western Blot分析。結(jié)果表明：黃顙魚(yú)基因cDNA全長(zhǎng)為1 259 bp，其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為714 bp，編碼237個(gè)氨基酸，3端和5端非翻譯區(qū)分別為407 bp和138 bp；黃顙魚(yú)基因核苷酸序列與鲇形目斑點(diǎn)叉尾鮰的相似度(89%)較高，與鰱、鯉、鯽、草魚(yú)和團(tuán)頭魴等的差異較大；肝臟是黃顙魚(yú)基因mRNA表達(dá)最豐富的組織，基因在雄性個(gè)體心臟、腎臟、肌肉和腸組織中的表達(dá)量顯著高于雌性的(<0.05)；IGFBP1蛋白在雌、雄黃顙魚(yú)肌肉組織中都有表達(dá)，且在雄性個(gè)體中的表達(dá)量高于在雌性個(gè)體中的表達(dá)量。

黃顙魚(yú)；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1基因；心臟；腎臟；肌肉；腸

胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin–like growth factors，IGFs)包括IGF、IGF受體(IGFR)、IGF結(jié)合蛋白(IGF binding proteins，IGFBPs)和IGFBP水解酶等，在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。IGF系統(tǒng)包括一系列的多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，IGFBP與IGF結(jié)合后抑制IGF與其受體結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控作用[2]。IGFBP還可以通過(guò)延長(zhǎng)IGF半衰期來(lái)調(diào)節(jié)IGFs 的生物活性[2–3]。動(dòng)物體內(nèi)存在的6種IGFBPs[3]雖然在結(jié)構(gòu)上高度同源，但其各自發(fā)揮的功能和組織表達(dá)結(jié)構(gòu)[4]不同。IGFBP1與其他幾種結(jié)合蛋白有著明顯的差異，它通過(guò)運(yùn)輸和調(diào)節(jié)IGF與受體結(jié)合而參與機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖等生理過(guò)程[5]。關(guān)于魚(yú)類基因的功能研究越來(lái)越受到重視，草魚(yú)[6]、鰱[7]、建鯉[8]和花鱸[9]等的基因已被克隆和研究。

黃顙魚(yú)()在中國(guó)廣泛分布，由于具有肌間刺少、肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高等優(yōu)點(diǎn)，已成為中國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類之一。不同性別黃顙魚(yú)表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)差異，雄性比雌性生長(zhǎng)快，同齡性成熟黃顙魚(yú)雄性的個(gè)體明顯大于雌性的，具有明顯的雄性偏倚性。脊椎動(dòng)物個(gè)體的差異主要由生長(zhǎng)速率決定的，而生長(zhǎng)速率又受到下丘腦—垂體—性腺軸及其他組織分泌的生長(zhǎng)激素或類胰島素生長(zhǎng)因子的調(diào)控[10]。鑒于基因參與魚(yú)類的生長(zhǎng)和發(fā)育，筆者分析黃顙魚(yú)基因的序列特點(diǎn)和表達(dá)特征，并分析IGFBP1蛋白在雌、雄個(gè)體肌肉組織中的表達(dá)，旨在為研究基因在黃顙魚(yú)生長(zhǎng)中的作用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

黃顙魚(yú)采自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所試驗(yàn)場(chǎng)。隨機(jī)選取18月齡健康無(wú)傷的雌、雄性個(gè)體各10尾，雌性個(gè)體體質(zhì)量為(50±5) g，全長(zhǎng)為(14±2) cm；雄性個(gè)體的體質(zhì)量為(70±8) g，全長(zhǎng)為(18±3) cm。將試驗(yàn)魚(yú)用MS–222麻醉后，迅速采集其鰓、肌肉、心臟、腦、肝臟、脾臟、胃和腸等組織置于液氮中冷凍保存。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

用Trizol Reagent(Introvigen)進(jìn)行不同組織總RNA的提取。以總RNA為模板，按照RNA PCR Kit(AMV) Ver3.0 (TaKaRa)試劑盒的方法合成cDNA第一鏈，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2基因的克隆

通過(guò)Clustalx對(duì)從GenBank獲得的已有魚(yú)類基因mRNA序列進(jìn)行比對(duì)。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)保守區(qū)域引物(IGFBP1F/ IGFBP1R)。引物信息見(jiàn)表1。

表1　黃顙魚(yú)IGFBP1基因克隆及表達(dá)分析的引物

以制備的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積為50 μL，包括1×Buffer 5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，10 μmol/L的dNTPs 1 μL，5 UDNA聚合酶0.3 μL，約100 ng cDNA模板。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen)進(jìn)行膠回收，然后以pMD–18T為載體轉(zhuǎn)化插入的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的克隆送武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序?；讷@得的黃顙魚(yú)基因的保守序列，設(shè)計(jì)3′ RACE和5′ RACE特異性引物(表1)，用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech)進(jìn)行3′末端和5′末端的擴(kuò)增，并克隆測(cè)序。

1.2.3黃顙魚(yú)基因的序列分析

用軟件DNASTAR 6.0將克隆得到的基因保守區(qū)序列、3′末端和5′末端序列進(jìn)行拼接，得到cDNA序列全長(zhǎng)，并查找開(kāi)放閱讀框和預(yù)測(cè)氨基酸編碼序列、相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。將cDNA序列在NCBI中進(jìn)行Blast同源比對(duì)，并預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞定位。用在線工具ExPASy(http://www.expasy.org/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽和疏/親水性。通過(guò)MEGA 6.0軟件構(gòu)建基于基因氨基酸序列的Neighbor– Joining(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4基因在不同性別黃顙魚(yú)組織中的表達(dá)特征

基于克隆得到的黃顙基因cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)，以黃顙魚(yú)基因?yàn)閮?nèi)參(引物β–actin1/β–actin2，表1)，對(duì)基因在雌、雄黃顙魚(yú)腦、鰓、心臟、肝臟、腎臟、胃、腸和肌肉組織中的表達(dá)特征進(jìn)行分析。反應(yīng)體系：2×SYBR Premmix Ex(TakaRa) 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2 μL模板cDNA，9.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.5IGFBP1蛋白在雌、雄黃顙魚(yú)肌肉中的表達(dá)

取雌、雄黃顙魚(yú)各2尾，分別向其肌肉組織中加入蛋白抽提液，裂解后離心，將上清液轉(zhuǎn)移至離心管，通過(guò)BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(TIANGEN)進(jìn)行蛋白定量，校正，使其均一化。向蛋白中加入上樣緩沖液，煮沸3 min，迅速進(jìn)行冰浴，然后進(jìn)行10% SDS–PAGE凝膠電泳分離，隨后將分離的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯樹(shù)脂(PVDF)膜上，用5%牛血清蛋白(BSA)于室溫封閉1 h，用TBS/T溶液漂洗3次。將兔anti–IGFBP1 (ab4242，Abcam)抗體密封后于4 ℃過(guò)夜，用TBS漂洗3次。加入山羊抗兔的用辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗(Santa Cruz Biotechnology)，于室溫孵育1 h，再漂洗3次。用ECL Plus Detection Kit試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，并用GK–330C+凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

2　結(jié)果與分析

2.1黃顙魚(yú)基因的cDNA克隆與序列分析

克隆獲得的黃顙魚(yú)基因cDNA序列全長(zhǎng)為1 259 bp(GenBank登錄號(hào)為HM210741)，其中，開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)為714 bp，3′和5′ 非翻譯區(qū)分別為407 bp和138 bp，堿基A+T的含量為55.1%，G+C的含量為44.9%。其核苷酸序列包含了4個(gè)3′端與mRNA瞬時(shí)表達(dá)相關(guān)的快速降解信號(hào)ATTTA和1個(gè)低氧誘導(dǎo)因子1的輔助順式原件(HAS)序列CAGGT。核苷酸序列同源性比較結(jié)果表明，基因核苷酸序列與同屬鲇形目斑點(diǎn)叉尾鮰的同源性最高(89%)，與鰱的同源性為73%，與鯉、鯽、草魚(yú)和團(tuán)頭魴的同源性均為72%。

“·”為終止密碼子；“↓”為信號(hào)肽切割位點(diǎn)；“ mRNA”為快速降解信號(hào)；“ ”為HAS 序列。

黃顙魚(yú)基因編碼237個(gè)氨基酸，由20種氨基酸組成，其中亮氨酸(Leu)含量最高，為12.2%。蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為26 100，等電點(diǎn)(pl)為8.01。編碼蛋白質(zhì)信號(hào)肽序列的長(zhǎng)度為29個(gè)氨基酸(AA)，切割位點(diǎn)位于N端29位L(Leu)和30位E(Glu)之間。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，黃顙魚(yú)基因編碼的蛋白在N端和C端分別包含保守結(jié)構(gòu)域IGFBP 超家族(IGFBP superfamily)和超家族(TY superfamily)結(jié)構(gòu)域。黃顙魚(yú)編碼氨基酸序列的同源性比對(duì)結(jié)果表明，黃顙魚(yú)與同為鲇形目的斑點(diǎn)叉尾鮰的相似性最高，達(dá)80%，與草魚(yú)和鰱的同源性為59%，與團(tuán)頭魴和斑馬魚(yú)的同源性為58%，與其他魚(yú)類的序列同源性也在60%左右。黃顙魚(yú)IGFBP–1蛋白序列在不同魚(yú)類中的差異較大。

2.2黃顙魚(yú)基因的進(jìn)化分析

用黃顙魚(yú)基因的氨基酸序列與GenBank中獲得的其他16個(gè)物種的氨基酸序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。結(jié)果顯示，17個(gè)物種分為兩大類群，魚(yú)類為單獨(dú)一個(gè)類群，與其進(jìn)化地位一致，黃顙魚(yú)基因首先與同屬鲇形目的斑點(diǎn)叉尾鮰聚為一支，然后與鯉科的草魚(yú)、鰱、團(tuán)頭魴、鯽、鯉和斑馬魚(yú)聚為一支，同屬鱸形目的花鱸和黃金鱸聚在一起；在另外一個(gè)大類群中，人和小鼠聚為一支，牛和豬聚為一支，然后再與非洲爪蟾聚在一起。

圖2　基于IGFBP1基因氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3黃顙魚(yú)基因在雌、雄個(gè)體組織中的表達(dá)特征

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果(圖3)表明，黃顙魚(yú)基因mRNA在腦、鰓、心臟、肝臟、腎臟、胃、腸和肌肉組織中的表達(dá)量差異較大，在肝臟組織的表達(dá)量最大，其次是在腸道、肌肉和腎臟中的表達(dá)，在心臟、腦和腮組織中的表達(dá)量相當(dāng)。基因在雌、雄黃顙魚(yú)中的表達(dá)分析結(jié)果(圖3)表明，雄性心臟、腎臟、肌肉和腸組織中的表達(dá)量顯著高于雌性的(<0.05)，而雌性鰓中的表達(dá)量顯著大于雄性的(<0.05)；在腦、肝臟和胃組織中的表達(dá)雌、雄差異沒(méi)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。

組織

2.4IGFBP1蛋白在雌、雄黃顙魚(yú)肌肉組織中的表達(dá)特征

以甘油醛–3–磷酸脫氫酶(glyceraldehyde–3– phosphate dehydrogenase，GAPDH)蛋白作為內(nèi)參，檢測(cè)IGFBP1蛋白在雌、雄黃顙魚(yú)肌肉組織中的表達(dá)情況(圖4)，結(jié)果表明，IGFBP1蛋白在雌、雄黃顙魚(yú)肌肉組織中均有表達(dá)，且在雄性中的表達(dá)高于在雌性中的。

M　雄性個(gè)體；F　雌性個(gè)體。

3 結(jié)論與討論

包括魚(yú)類在內(nèi)的脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)主要受胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)信號(hào)通路的調(diào)控[11]。IGFBP1是IGFs通路中的一個(gè)重要組成蛋白。近年來(lái)，一些硬骨魚(yú)類的基因全序列或部分序列被克隆和研究[12–18]。本研究中成功克隆了黃顙魚(yú)基因的cDNA全長(zhǎng)序列，其核苷酸序列與同屬鲇形目的斑點(diǎn)叉尾鮰的同源性較高，而與其他物種的同源性較低?；蛩幋a的AA序列也呈現(xiàn)相似的特征，即在同目物種間相對(duì)保守，而與其他物種序列相比差異較大。

魚(yú)類序列存在一些保守結(jié)構(gòu)[19]。在IGFBP1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，N端是與IGF–1結(jié)合的重要區(qū)域；中心區(qū)決定了IGFBP的特異性；C端部分參與與IGF–1的結(jié)合，并與細(xì)胞粘附相關(guān)。IGFBP1作為一個(gè)重要的結(jié)合蛋白，通過(guò)這些保守結(jié)構(gòu)序列與其他蛋白結(jié)合，從而發(fā)揮IGFBP1的生物學(xué)作用。首先，動(dòng)物IGFBP1氨基酸序列N–端存在保守的CGCCXXC結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是IGFBP1與IGFs結(jié)合的重要序列結(jié)構(gòu)[20]；其次，在IGFBP1的C端有一個(gè)CWCV保守區(qū)域結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在LGFBPs蛋白與IGFs以及與細(xì)胞外相關(guān)結(jié)構(gòu)的結(jié)合中有重要作用[9]。與其他物種的IGFBP1氨基酸結(jié)構(gòu)相比，黃顙魚(yú)的N端和C端同樣存在這2種保守序列，其中黃顙魚(yú)IGFBP1氨基酸序列CGCCXXC的結(jié)構(gòu)為CGCCLAC。此外，在多數(shù)物種基因的非編碼區(qū)還含有AT富集區(qū)，存在多個(gè)ATTTA序列，此序列可參與選擇性的mRNA降解過(guò)程[21]?；|序列包含3個(gè)ATTTA結(jié)構(gòu)，1個(gè)存在于5端非翻譯區(qū)，2個(gè)存在于3端非翻譯區(qū)[9]。黃顙魚(yú)基因的5端非翻譯區(qū)有2個(gè)ATTTA序列，分別位于90~94 nt和98~102 nt，3端非翻譯區(qū)有4個(gè)ATTTA序列，分別位于965~969、1 097~1 101、1 120~1 124、1 167~1 171 nt，表明黃顙魚(yú)的更容易啟動(dòng)選擇性的mRNA降解過(guò)程。

硬骨魚(yú)肝臟是IGFBP1合成的主要場(chǎng)所[22]?；蛟诟闻K組織中的表達(dá)最豐富。在大菱鲆中，基因在肝臟中的表達(dá)量最高，在脾臟中的表達(dá)量次之，而在心臟、胃、腎臟中的表達(dá)量較低，在腸中只有微量表達(dá)[3]。mRNA在花鱸肝臟中的表達(dá)量最高，在肌肉和脾臟中有較高表達(dá)，而在腦、垂體、腸、頭腎中只有少量的表達(dá)，在其他組織中的表達(dá)量極少[9]。本研究中，黃顙魚(yú)基因在肝臟中的表達(dá)量最高，在肌肉、腎臟和腸中的表達(dá)量次之，在心臟、腦和鰓中的表達(dá)量較低。魚(yú)類的mRNA除在肝臟中有豐富的表達(dá)外，在肌肉、腸和腎等組織中也有表達(dá)，但在不同物種間的表達(dá)特征不同。這可能與物種的生理狀態(tài)、生活環(huán)境和生活習(xí)性等有關(guān)。黃顙魚(yú)雄性個(gè)體的表達(dá)量高于雌性個(gè)體的。這與黃顙魚(yú)雄性的生長(zhǎng)比雌性快相一致。魚(yú)類的生長(zhǎng)受GH /GHR/IGF軸的調(diào)控[23]，IGFs是生長(zhǎng)軸中的關(guān)鍵因子。魚(yú)類 IGFs的基本功能是促生長(zhǎng)。IGFBPs 家族成員與IGFs結(jié)合，調(diào)節(jié)IGFs的作用效率，并用其運(yùn)送 IGFs到靶組織，從而發(fā)揮IGFs的生物學(xué)效應(yīng)[24]。

本研究結(jié)果表明，基因在雌、雄黃顙魚(yú)不同組織中的表達(dá)存在差異，無(wú)論是mRNA還是蛋白的表達(dá)，在肌肉組織中的表達(dá)均是雄性高于雌性。這與雄性個(gè)體的生長(zhǎng)快于雌性個(gè)體的研究結(jié)果相一致，因此，基因可能與不同性別個(gè)體的生長(zhǎng)調(diào)控有關(guān)。關(guān)于基因?qū)S顙魚(yú)生長(zhǎng)的調(diào)控作用還有待研究。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王庫(kù)

Expression and expression analysis ofgene in yellow catfish ()

LIANG Hongwei1,2, LI Zhong1, LUO Xiangzhong1, ZOU Guiwei1*

(1.Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China; 2.Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province, Wuhan 430070, China)

To analyze the characteristics of insulin–like growth factor–binding protein 1(), and to reveal its expression pattern in different gender tissues and the expression difference of its protein between male and female muscles, thecDNA was cloned from the. The mRNA expression ofwas studied using florescent quantitative real–time PCR and the protein expression pattern of IGFBP1 was detected using western blot method. The full–length of cDNA ofis 1 259 bp which included a 138 bp complete 5untranslated region (5′ UTR), a 407 bp 3′ UTR and a 714 bp open reading frame (ORF) region which encoded a 237 amino acid of peptides. The results indicated that nucleotide sequences ofwere obvious difference from other species (such as,,,and,etc.)except for, which was identical to Siluriformes ofThe highest abundance expression oftranscript was detected in liver, and mRNA level ofin heart, kidney, muscle and intestine from male was higher than that from female (<0.05). The IGFBP1 protein expression from male was higher than that from female. The results provided data support for further functional investigation ongene in

;; gender differences; heart; kidney; muscle; intestine

10.13331/j.cnki.jhau.2017.03.014

S917.4

A

1007-1032(2017)03-0298-06

2016–09–01

2017–04–20

“十二·五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100401)；水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺(tái)項(xiàng)目(2016DKA30470)

梁宏偉(1978—)，男，副研究員，博士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種研究，lianghw@yfi.ac.cn；

，鄒桂偉，研究員，zougw@yfi.ac.cn

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn