謝立蘭，安 康，陳 力，孫紫德，方六榮

( 1.武漢生物工程學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430415；2.湖北省病毒載體工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430415；3.河北北方學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北 張家口 075000；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

豬DDX21基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)

謝立蘭1，2，安 康3，陳 力1，2，孫紫德1，2，方六榮4

( 1.武漢生物工程學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430415；2.湖北省病毒載體工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430415；3.河北北方學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北 張家口 075000；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

DEAD-box解旋酶21(DExD-box helicase 21， DDX21)是含DEAD-box的RNA解旋酶家族成員之一，不僅參與RNA的合成和加工過(guò)程，同時(shí)還參與機(jī)體的天然免疫應(yīng)答，調(diào)控病毒的復(fù)制。為了研究豬DDX21基因的結(jié)構(gòu)和功能，以豬腎傳代細(xì)胞(PK-15)總cDNA為模板，根據(jù)GenBank 公布的預(yù)測(cè)序列(XM_005657387.2)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增豬源DDX21基因，并采用分子生物學(xué)軟件將其編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，首次成功克隆了豬DDX21基因的cDNA序列(GenBank登錄號(hào)為KX396051)，其開放讀碼框全長(zhǎng)為2 355 bp，編碼784個(gè)氨基酸；與牛、斑馬魚、人、小鼠、大鼠和非洲爪蟾的氨基酸序列同源性分別為91.7%，57.5%，88.0%，82.3%，83.8%和48.9%；該基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)域和人、牛、小鼠、大鼠一樣，其C端都具有保守的GUCT結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明豬DDX21與牛DDX21的親緣關(guān)系最近。進(jìn)一步構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-DDX21，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，對(duì)DDX21基因進(jìn)行原核表達(dá)。經(jīng) SDS-PAGE 分析顯示重組菌可表達(dá)分子量約為 90 kDa的融合蛋白，與預(yù)期相符；在IPTG誘導(dǎo)濃度一定的條件下，重組菌的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5 h。豬DDX21基因的克隆和原核表達(dá)，為進(jìn)一步研究DDX21蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

豬；DDX21基因；克??；序列分析；原核表達(dá)

DEAD-box(DEAD-box proteins/DEAD-box helicases)家族蛋白是一類兼具有ATP酶活性和RNA解旋酶活性的RNA解旋酶，屬于細(xì)胞RNA解旋酶超家族2型(SF2)。該家族蛋白廣泛存在于從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物的許多物種中，通常含有9個(gè)保守的氨基酸基序，分別為基序Ⅰ、Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 和Q，并因其基序Ⅱ中的保守氨基酸序列Asp-Glu-Ala-Asp(D-E-A-D)被命名為DEAD-box蛋白[1-2]。DEAD-box蛋白家族成員眾多，在各種涉及RNA的細(xì)胞進(jìn)程中均發(fā)揮重要作用，包括轉(zhuǎn)錄、mRNA前體剪接、mRNA輸出、核糖體生成、翻譯起始、細(xì)胞器基因表達(dá)、RNA降解等[3-4]。

1993年，F(xiàn)lores-Rozas等[5]最先在Hela細(xì)胞的細(xì)胞核提取物中鑒定了一種新的具有打開雙鏈RNA分子和改變ssRNA形成等雙重功能的RNA解旋酶-RNA helicase Ⅱ。隨后Valdez 等[6]利用自身抗體從西瓜胃(Watermelon stomach)病人的血清中分離到一種核仁RNA 解旋酶，命名為Gu蛋白。經(jīng)鑒定，RNA helicase Ⅱ蛋白和Gu蛋白實(shí)為同一種蛋白，屬于DEAD-box蛋白家族成員，并將其命名為DDX21 (DEAD-box helicase 21)或RH Ⅱ/Ga(RNA helicase Ⅱ/Gua)[7]。后來(lái)的多項(xiàng)研究表明DDX21不僅參與RNA的生成和加工過(guò)程[8-9]，在不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及機(jī)體的炎癥反應(yīng)和信號(hào)傳遞中DDX21也起到非常重要的作用[10-11]，同時(shí)DDX21也參與了多種病毒(包括InfluenzaAvirusV(IAV)[12-13]、Humanimmunodeficiencyvirus1(HIV)[14]和Denguevirus(DENV)[15]等)的增殖過(guò)程。

迄今為止，僅人、小鼠和非洲爪蟾的DDX21基因被鑒定，尚未有關(guān)于豬源DDX21基因的研究報(bào)道。本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆了豬DDX21的全長(zhǎng)CDs區(qū)序列，利用生物信息學(xué)軟件分析了該基因的保守結(jié)構(gòu)域及其與其他物種DDX1基因的同源性。同時(shí)，構(gòu)建了豬DDX21的原核表達(dá)質(zhì)粒，并在宿主菌BL21中成功進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，為今后深入研究豬DDX21蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、載體和細(xì)胞系

大腸桿菌(E.coli)DH5α菌株和BL21(DE3)菌株、原核表達(dá)載體pET-28a(+)、豬腎傳代細(xì)胞系(PK-15)均由武漢生物工程學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究中心保存?？寺≥d體pMD18-T購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)公司。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑RNAiso Plus、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒、DNA Marker、TaqDNA聚合酶、T4-DNA連接酶及各種限制性內(nèi)切酶等均購(gòu)自大連寶生物( TaKaRa)公司。SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、考馬斯亮藍(lán)R250和雙色蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自上海生工生物工程公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank預(yù)測(cè)的豬DDX21基因序列(XM_005657387.2)，利用Pinmer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物用于克隆DDX21，包括上游引物DDX21-2F(GAATTCATGCCGGGGAAACTTCGTAGT，下劃線部分為EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)) 和下游引物DDX21-2R(CTCGAGTTACTGTCCAAACGCTTTGC，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。引物由生工生物(上海) 股份有限公司合成。

1.4 豬DDX21基因的克隆

利用RNAiso Plus 法提取豬腎傳代細(xì)胞(PK-15)總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0)說(shuō)明書，以DDX21-2F和DDX21-2R為引物，利用RT-PCR方法擴(kuò)增豬DDX21基因編碼區(qū)(CDs)序列。PCR反應(yīng)體系：5×PCR Buffer 10 μL，Taq聚合酶1 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板10 μL，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 °C預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 °C退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物純化后克隆至pMD18-T 載體，命名為pMD18-DDX21，雙脫氧末端終止法進(jìn)行測(cè)序。

1.5 豬DDX21基因序列分析、同源性比對(duì)及構(gòu)建進(jìn)化樹

利用DNAStar軟件的EditSeq程序?qū)⑸鲜鏊@得的豬DDX21基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；利用網(wǎng)站http://web.expasy.org/protparam/ 分析DDX21蛋白的理化性質(zhì)；應(yīng)用DNAStar的MegAligen工作區(qū)和ClustalX軟件對(duì)不同物種DDX21蛋白的氨基酸序列及RH Ⅱ/ Gu蛋白C端結(jié)構(gòu)域 (The C-terminal domain in the RNA helicase Ⅱ / Gu protein family，GUCT)進(jìn)行同源性分析和比對(duì)，并進(jìn)一步利用 MEGA 7.0軟件構(gòu)建NJ(Neighbour-joining)系統(tǒng)發(fā)育樹；SMART服務(wù)器(http：//smart.embl-heidelberg.de)對(duì)豬DDX21蛋白質(zhì)功能進(jìn)行分析。

1.6 原核表達(dá)載體pET28a-DDX21的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ對(duì)pMD18T-DDX21 質(zhì)粒和pET-28a(+)空載體進(jìn)行雙酶切，分別回收純化DDX21基因片段和線性化的pET-28a(+)片段并將其連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中，挑取單克隆菌落并提取質(zhì)粒，用SphⅠ進(jìn)行單酶切鑒定后，將疑似正確的質(zhì)粒送到上海生工生物有限公司測(cè)序。

1.7 pET28a-DDX21的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒(命名為pET28a-DDX21)轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中，挑取單菌落至含50 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取上述菌液200 μL至新配制的5 mL含50 mg/mL卡那霉素抗生素的LB中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～1.0時(shí)，取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前樣品，剩余菌液加入一定濃度的IPTG后37 ℃誘導(dǎo)一定時(shí)間。誘導(dǎo)后取1 mL菌液離心，沉淀用40 μL PBS和10 μL 5×SDS上樣緩沖液充分混勻，100 ℃水浴5 min，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬DDX21基因的克隆

利用TaKaRa公司的細(xì)胞總RNA提取試劑-RNAiso plus 從豬腎傳代細(xì)胞系(PK-15)中提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)RT-PCR(兩步法) 擴(kuò)增豬DDX21基因的全長(zhǎng)cDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有一條約2 500 bp的條帶(圖1-A)，與預(yù)期相符。進(jìn)一步將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，與pMD18-T 載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，采用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切后所得片段大小均與預(yù)期結(jié)果一致(圖1-B)。挑取陽(yáng)性克隆(命名為pMD18-DDX21)菌液送生工(上海)生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)得到豬DDX21基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)由2 355個(gè)核苷酸組成(GenBank登錄號(hào)為KX396051)。

M1和M2．DL1.5 kb和DL2000 DNA Marker；1．豬DDX21擴(kuò)增產(chǎn)物；2，3．pMD18-DDX21/EcoR Ⅰ+BamH Ⅰ。

2.2 豬DDX21基因的氨基酸序列分析及同源進(jìn)化樹構(gòu)建

根據(jù)DNAStar軟件推導(dǎo)出豬DDX21基因編碼784個(gè)氨基酸，Protparam分析表明其蛋白分子量為87.22，等電點(diǎn)(pI)為9.35，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性為44.26，為不穩(wěn)定蛋白。進(jìn)一步運(yùn)用DNAStar的MegAligen 工作區(qū)將其與已知物種DDX21的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，豬DDX21 與牛(NP_001076996.1)、斑馬魚(NP_001120807.2)、人(NP_004719.2)、小鼠(NP_062426.2)、大鼠(NP_001032278.1)和非洲爪蟾(NP_001039224.1)的氨基酸同源性分別為91.7%，57.5%，88.0%，82.3%，83.8%和48.9% (圖2-A)，顯示哺乳動(dòng)物DDX21的氨基酸序列具有較高的同源性。根據(jù)不同動(dòng)物DDX21的氨基酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示豬DDX21與牛DDX21 的親緣關(guān)系最近(圖2-B)。

進(jìn)一步利用SMART軟件對(duì)豬DDX21的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他物種類似，豬DDX21也含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為位于206-413aa的DEXDc結(jié)構(gòu)域、位于449-533aa的RNA解旋酶(HELICc)結(jié)構(gòu)域和位于621-716aa的RH Ⅱ/ Gu蛋白C端結(jié)構(gòu)域(http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/job-status.pl?jobid=611832

146647831474358807OmTGQHIGxM)，圖3-A)，且Blast序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)DDX21的GUCT結(jié)構(gòu)域在哺乳動(dòng)物中高度保守，進(jìn)一步證明所克隆的序列為豬的DDX21序列(圖3-B)。

圖2 不同物種DDX21的氨基酸序列比較(A)和遺傳進(jìn)化樹(B)

圖3 DDX21基因的保守結(jié)構(gòu)域(A)和GUCT區(qū)的氨基酸序列比對(duì)(B)

2.3 豬DDX21基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)1.6方法所述構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-DDX21。將重組質(zhì)粒用SphⅠ單酶切鑒定后，產(chǎn)生一條約1 300 bp和一條約6 400 bp的線性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖4)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)pET28a-DDX21進(jìn)行測(cè)序，也證實(shí)無(wú)堿基錯(cuò)配，證明原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4DDX21基因重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

重組質(zhì)粒pET28a-DDX21轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)終濃度為1.0 mmol/L的IPTG在37 ℃分別誘導(dǎo)2，3，4，5 h后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒成功表達(dá)出約90 kDa大小的蛋白，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，融合蛋白的表達(dá)量也逐漸增加。而未誘導(dǎo)的空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和未誘導(dǎo)的 pET28a-DDX21重組質(zhì)粒均沒(méi)有出現(xiàn)相同的條帶(圖5)。進(jìn)一步通過(guò)加入不同終濃度的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，以篩選最優(yōu)的IPTG濃度。結(jié)果如圖6所示，在0.6～1.2 mmol/L的IPTG濃度時(shí)，目的蛋白都能表達(dá)，但表達(dá)量無(wú)明顯變化。參考《pET System Manual》中提到的“帶有T7lac啟動(dòng)子的載體則需要終濃度為1 mmol/L 的IPTG 才能完全誘導(dǎo)?！?，而IPTG對(duì)細(xì)菌也存在一定的毒性，為此進(jìn)一步選擇終濃度為1.0 mmol/L的IPTG在菌液不同吸光值時(shí)(分別在菌液OD600為0.4，0.6，0.8或1.0時(shí)添加IPTG)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行誘導(dǎo)，37 ℃培養(yǎng)5 h后運(yùn)用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)，以探索重組蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。電泳結(jié)果表明(圖7)，在同樣的誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度時(shí)，初始OD600分別為0.6和0.8時(shí)的菌液誘導(dǎo)后表達(dá)的重組蛋白基本相當(dāng)，明顯高于OD600為0.4或1.0試驗(yàn)組。

M1和M2．DL1.5 kb和DL2000 DNA Marker；1．pET28a-DDX21/ Sph Ⅰ單酶切鑒定。

M．蛋白Marker；1．誘導(dǎo)的空載體；2～5．pET28a-DDX21分別誘導(dǎo)2，3，4，5 h；6．未誘導(dǎo)的pET28a-DDX21。

M. Protein molecular weight Marker； 1. Induced the pET28a； 2-5. Induced pET28a-DDX21 for 2， 3， 4， 5 h， respectively； 6. pET28a-DDX21 before inducement.

圖5 誘導(dǎo)pET28a-DDX21不同時(shí)間后蛋白的表達(dá)

Fig.5 SDS-PAGE analysis of pET28a-DDX21 expression product after different induction time

M．蛋白Marker；1．誘導(dǎo)的空載體；2．未誘導(dǎo)的pET28a-DDX21；3～6．分別以0.6 ，0.8，1.0，1.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)pET28a-DDX1。

M. Protein molecular weight Marker； 1. Induced the pET28a； 2. pET28a-DDX21 before inducement； 3-6.Induced pET28a-DDX21 with 0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L IPTG， respectively.

圖6 不同濃度IPTG誘導(dǎo)pET28a-DDX21的表達(dá)

Fig.6 SDS-PAGE analysis of pET28a-DDX21 expression with different concentrations of IPTG

M．蛋白Marker；1．誘導(dǎo)的空載體；2～5．菌液吸光值分別為0.4，0.6，0.8，1.0時(shí)誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)；6．未誘導(dǎo)重組質(zhì)粒。

M. Protein molecular weight Marker； 1. Induced the pET28a； 2-5.Induced pET28a-DDX21 at different OD value 0.4， 0.6， 0.8，and 1.0 respectively； 6. pET28a-DDX21 before inducement.

圖7 不同吸光值時(shí)誘導(dǎo)pET28a-DDX21的表達(dá)

Fig.7 SDS-PAGE analysis of pET28a-DDX21 expression at different OD value

3 討論和結(jié)論

DEAD-box解旋酶是一個(gè)包含了與RNA代謝(轉(zhuǎn)錄起始、RNA剪切、核運(yùn)輸、前mRNA拼接)等許多過(guò)程的蛋白質(zhì)家族[1]。DDX21作為DEAD-box解旋酶家族的一員，已有多項(xiàng)研究表明其在核糖體RNA的生成、RNA編輯和轉(zhuǎn)錄等過(guò)程中起到非常重要的作用[8-9]，這些可能是由DDX21特殊的核仁定位決定的。此外，近期研究還表明DDX21參與了機(jī)體的天然免疫和病毒復(fù)制等諸多生物學(xué)過(guò)程。Zhang等[10]在分離鑒定能夠特異性結(jié)合poly(I∶C)的蛋白質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)DDX21和解旋酶DDX1及DHX36形成一個(gè)復(fù)合體，且DDX21通過(guò)其PRK結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合DDX1的SPRY結(jié)構(gòu)域和DHX36的C-HA2-DUF解旋結(jié)構(gòu)域，在poly(I∶C)的識(shí)別和信號(hào)傳遞過(guò)程中起橋梁作用；在IAV感染早期，DDX21通過(guò)結(jié)合IAV的PB1蛋白和抑制聚合酶的組裝，從而抑制IAV病毒RNA和蛋白質(zhì)的合成，而在病毒感染后期，病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1競(jìng)爭(zhēng)性的與DDX21，從而釋放出PB1蛋白并解除DDX21對(duì)其病毒的抑制作用[12]。類似的，DDX21還能抑制HIV、登革熱病毒和博爾納病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)等病毒的復(fù)制，但其具體機(jī)制尚不清楚[14-16]。

目前，有關(guān)DDX21的功能研究主要是以人[3]、鼠[17]和非洲爪蟾[18]為模型，其他物種卻鮮有功能報(bào)道。本研究通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增得到豬DDX21基因的CDs序列。該基因的CDs序列為2 355 bp，編碼784個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白分子量為87.22 kDa，等電點(diǎn)(pI)為9.35，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性為44.26(大于40被認(rèn)為不穩(wěn)定)。經(jīng)氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析，豬DDX21基因與其他哺乳動(dòng)物如牛、大鼠、人和小鼠的氨基酸序列之間的同源性較高，分別為91.7%，83.8%，88.0%和82.3%，且進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明豬DDX21與其他哺乳動(dòng)物的DDX21一樣，也存在DEXDc、HELICc和GUCT這3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中GUCT為DDX21蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域[19]。不同物種DDX21基因結(jié)構(gòu)域的高度保守性及豬DDX21與人DDX21之間較高的同源性，提示豬DDX21可能與人DDX21具有更相似的作用和功能。

本研究以pET28a(+)為原核表達(dá)載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-DDX21，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了豬DDX21蛋白。進(jìn)一步的分析表明pET28a-DDX21融合蛋白在IPTG終濃度為0.6～1.2 mmol/L時(shí)表達(dá)量變化不明顯。在IPTG終濃度為1 mmol/L，相同的初始OD值下誘導(dǎo)2～5 h都能表達(dá)，以誘導(dǎo)5 h后的表達(dá)量最高。在IPTG終濃度一定的條件下，初始OD值不同的菌液在誘導(dǎo)時(shí)間相同后蛋白表達(dá)差別較大，以初始OD為0.6和0.8時(shí)誘導(dǎo)的表達(dá)量較理想，初始OD值過(guò)低(0.4)或過(guò)高(1.0)時(shí)蛋白表達(dá)量都不高。pET28a(+)融合的his標(biāo)簽分子量小，不會(huì)改變目的蛋白自身的可溶性，在pH=8.0時(shí)，不攜帶電荷，對(duì)蛋白的折疊、構(gòu)象形成等影響較小，容易分離純化[20]。因此，pET28a-DDX21重組質(zhì)粒的構(gòu)建及DDX21表達(dá)條件的優(yōu)化可為重組蛋白的生產(chǎn)制備及進(jìn)一步研究豬DDX21的結(jié)構(gòu)提供基礎(chǔ)資料。

綜上所述，本研究首次克隆了豬DDX21基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析再次證明DDX21基因在不同物種中的高度保守性，并利用原核表達(dá)技術(shù)成功誘導(dǎo)表達(dá)豬DDX21蛋白，今后擬對(duì)豬DDX21蛋白的結(jié)構(gòu)及豬DDX21基因在豬源病毒復(fù)制中的作用和參與機(jī)體天然免疫的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Cloning，Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of PorcineDDX21

XIE Lilan1，2，AN Kang3，CHEN Li1，2，SUN Zide1，2，F(xiàn)ANG Liurong4

( 1.Center of Applied Biotechnology，Wuhan Institute of Bioengineering，Wuhan 430415，China；2.Hubei Engineering Research Center of Viral Vector，Wuhan 430415，China；3.College of Lab Medicine，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China；4.State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)

DDX21 (DExD-box helicase 21) is a RNA helicase，which belongs to the DEAD-box family of RNA helicases.Previous reports showed DDX21 not only take part in the generation and processing of RNA，but also have functional roles in virus′s replication.This experiment was conducted to obtain sequence of swine DEAD-box helicase 21 gene，and to study its prokaryotic expression.According to the predictedSusscrofaDDX21 gene mRNA sequence in GenBank(XM_005657387.2)，proper primers were designed.Total RNA was then extracted from porcine kidney passage cells(PK-15)，and CDs sequence of the gene was amplified by RT-PCR using the primers.The sequence analysis results showed that the sequence of porcine DDX21 CDs was in length of 2 355 bp which encoded 784 amino acids (GenBank Accession No.KX396051)； Compared withBostaurus，Daniorerio，Homosapiens，Musmusculus，RattusnorgicusandXenopustropicalis，homology of porcine DDX21 was 91.7%，57.5%，88.0%，82.3%，83.8%，and 48.9% at the amino acid level，respectively； Structural analysis with the SMART program indicated that porcine DDX21 contained a putative C-terminal GUCT domain.Similar GUCT domain domains had been identified in cattle，human，mouse and rat DDX21； Phylogenetic tree analysis showed that porcine DDX21 had the closest relationship with cattle DDX21.Additionally，prokaryotic expression vector pET28a-DDX21 was constructed for further study.After sequencing，the recombinant was transformed intoEscherichiacoliBL21 (DE3) competent cells.The SDS-PAGE experiment demonstrated that the recombinant objective protein appeared a molecular mass of approximately 90 kDa which was consistent with the anticipated size.When IPTG concentration was kept constant，5 h induction was optimal.Cloning of porcineDDX21 gene and expression inE.colilaid a foundation for the subsequent structural analysis and function research of this gene.

Porcine；DDX21 gene； Cloning； Sequence analysis； Prokaryotic expression

2017-04-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31402181)；湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(B2016303)

謝立蘭(1984-)，女，江西九江人，講師，博士，主要從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究。

方六榮(1969-)，女，湖北咸寧人，教授，博士，主要從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究。

Q78；S828

A

1000-7091(2017)03-0042-06

10.7668/hbnxb.2017.03.007