易 悅， 王慧中， 鄭 丹， 茍 敏， 湯岳琴

(1.四川大學 建筑與環(huán)境學院環(huán)境 科學與工程系， 四川省環(huán)境保護有機廢棄物資源化利用重點實驗室， 四川 成都 610065； 2. 農(nóng)業(yè)部沼氣科學研究所， 四川 成都 610041)

丁酸和戊酸互營氧化產(chǎn)甲烷微生物學研究進展

易 悅1， 王慧中1， 鄭 丹2， 茍 敏1， 湯岳琴1

(1.四川大學 建筑與環(huán)境學院環(huán)境 科學與工程系， 四川省環(huán)境保護有機廢棄物資源化利用重點實驗室， 四川 成都 610065； 2. 農(nóng)業(yè)部沼氣科學研究所， 四川 成都 610041)

丁酸和戊酸是產(chǎn)甲烷過程中重要的中間代謝產(chǎn)物，特別是在含蛋白廢水的厭氧消化體系中，丁酸和戊酸是主要的中間代謝產(chǎn)物。研究互營丁酸和戊酸氧化分解的微生物學對于含蛋白廢水的處理乃至厭氧消化體系穩(wěn)定高效運行都是極其重要的。文章總結(jié)了目前已分離獲得的丁酸和戊酸氧化菌，介紹了已知的丁酸和戊酸的氧化分解途徑，同時概述了關(guān)于丁酸和戊酸互營氧化分解相關(guān)的微生物群落研究現(xiàn)狀，對利用丁酸和戊酸產(chǎn)甲烷的微生物學研究的未來發(fā)展提出了建議。

丁酸； 戊酸； 互營脂肪酸氧化； 甲烷發(fā)酵； 厭氧消化

甲烷是微生物在嚴格厭氧條件下對有機物質(zhì)進行氧化分解而產(chǎn)生的，是重要的溫室氣體，也是可再生清潔能源，在全球的碳循環(huán)中起著極其重要的作用。

微生物產(chǎn)甲烷過程可分為水解產(chǎn)酸、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸和產(chǎn)甲烷3個階段。第1階段由厭氧和兼性厭氧的水解和發(fā)酵細菌將纖維素、淀粉等水解成單糖，并進一步發(fā)酵生成各種有機酸、低級醇，H2及CO2；將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，并進一步發(fā)酵生成各種有機酸，釋放氨，H2及CO2；將脂類水解為甘油和脂肪酸，進一步氧化分解生成有機酸、H2和CO2。第2階段產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細菌氧化分解第1階段產(chǎn)生的有機酸、低級醇，生成乙酸，H2和CO2。第3階段由嚴格厭氧的產(chǎn)甲烷古菌完成，主要是氫營養(yǎng)型和乙酸營養(yǎng)型這兩大類產(chǎn)甲烷古菌，乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌直接利用乙酸產(chǎn)生甲烷，氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌利用H2和CO2產(chǎn)生甲烷[1]。

C2～C5的脂肪酸是產(chǎn)甲烷過程中重要的中間代謝產(chǎn)物，目前研究較多的是乙酸和丙酸的互營氧化，而針對丁酸和戊酸的互營氧化研究相對較少。食品加工業(yè)廢水含有較多蛋白質(zhì)，在厭氧消化過程中，蛋白質(zhì)水解發(fā)酵可生成各種有機酸[2]。不同的氨基酸分解生成的有機酸不同，其中，組氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、谷氨酸經(jīng)過Stickland反應(yīng)生成正丁酸，精氨酸、脯氨酸生成正戊酸，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸則分別生成異丁酸、異戊酸和2-甲基丁酸[3]。有研究表明，在奶制品及肉制品加工廠廢水的厭氧處理過程中，產(chǎn)生的乙酸約占總有機酸的30%，正丁酸約占20%，異丁酸約占7%，正戊酸、異戊酸、2-甲基丁酸則分別可以占到8%，16%，4%左右[4]。另有研究表明，丁酸和戊酸對于反應(yīng)器的變化有更快的響應(yīng)，這兩種酸是最好的監(jiān)測反應(yīng)器性能的指標[5]。丁酸還是丙酸降解途徑可能的中間產(chǎn)物，有研究表明，部分微生物能將丙酸轉(zhuǎn)化為丁酸，再進一步氧化分解[6]。

因此，研究丁酸和戊酸氧化分解產(chǎn)甲烷的微生物學，對于含蛋白廢水的處理以及厭氧消化反應(yīng)系統(tǒng)穩(wěn)定運行和調(diào)控都是極其重要的。

1 互營丁酸氧化菌與丁酸氧化分解途徑

1.1 互營丁酸氧化菌

大部分互營丁酸氧化菌為彎曲桿狀，生長pH值范圍基本都接近中性，但從堿性環(huán)境中分離獲得的Themosyntrophalipolytica最適生長pH值為堿性。互營丁酸氧化菌以中溫菌居多，但從溫泉中分離的Themosyntrophalipolytica和Syntrophothermuslipocalidus生長溫度在45℃以上，而從永凍層土壤中分離的Algorimarinabutyrica生長溫度必須低于25℃。在一些極端環(huán)境中可能還有很多具有丁酸氧化功能的菌株沒有被發(fā)現(xiàn)，目前分離出的菌株只是冰山一角，為了能更好的了解丁酸在不同生態(tài)環(huán)境下的氧化情況，有必要進行深入研究。

目前分離培養(yǎng)的互營丁酸氧化菌都能與氫營養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷菌互營共生，少部分氧化菌還能與硫酸鹽還原菌共培養(yǎng)。大部分的丁酸氧化菌除了能利用丁酸之外，還能利用戊酸等其它大于5個碳的脂肪酸作為電子供體，產(chǎn)物主要為乙酸、丙酸和H2。一部分氧化菌能在含巴豆酸的基質(zhì)上單獨生長，因此巴豆酸通常被用來進行丁酸氧化菌的分離培養(yǎng)。

除了表1總結(jié)的互營丁酸氧化菌外，從鹽堿湖分離獲得的Desulfobotulusalkaliphilus[8]，從污水處理場沉積污泥分離獲得的Desulfovibriobutyratiphilus[9]，從處理造紙廢水的中溫UASB厭氧污泥中分離獲得的Desulfatirhabdiumbutyrativorans[10]和從河口沉積物中分離到的Desulfolunabutyratoxydans[11]，能以硫酸、硫代硫酸鹽和亞硫酸鹽等為電子受體，將丁酸進行氧化分解，產(chǎn)物為乙酸，其中，Desulfatirhabdiumbutyrativorans還能進一步將乙酸分解為H2和CO2。

表1 互營丁酸和戊酸氧化菌

表1(續(xù)) 互營丁酸和戊酸氧化菌

注：①Syntrophomonasbryantii最初被命名為Clostridiumbryantii(Stieb and Schink 1985)，之后基于16S rRNA基因序列，重命名為Syntrophomonasbryantii。

1.2 丁酸氧化途徑

從表2可以看出正丁酸和異丁酸氧化分解生成乙酸的標準吉布斯自由能均大于0。為了使丁酸能夠順利被氧化，該反應(yīng)需要與產(chǎn)甲烷反應(yīng)進行耦合，將反應(yīng)產(chǎn)物H2分壓降低，使實際吉布斯自由能減小，才能保證反應(yīng)的順利進行。部分硫酸鹽還原菌也能利用丁酸降解產(chǎn)生的H2，使氫分壓保持在一個較低的范圍[27]。

表2 丁酸和戊酸氧化分解有關(guān)的反應(yīng)和標準吉布斯自由能[28]

正丁酸產(chǎn)甲烷過程首先是由丁酸氧化菌將丁酸氧化分解成乙酸和H2，然后再由產(chǎn)甲烷菌利用H2/CO2和乙酸生成甲烷。目前已知的正丁酸氧化分解途徑是β氧化(見圖1)。丁酸被輔酶A轉(zhuǎn)移酶激活，與輔酶A生成丁酰輔酶A，在脫氫酶的作用下生成巴豆酰基輔酶A。巴豆?；o酶A經(jīng)烯酰輔酶A水化酶作用生成羥基丁酰輔酶A，羥基丁酰輔酶A在脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶A。乙酰乙酰輔酶A在硫解酶的作用下生成2個乙酰輔酶A，產(chǎn)生的乙酰輔酶A可以通過底物水平磷酸化，形成1個ATP 和1個乙酸分子，或者繼續(xù)與丁酸反應(yīng)生成丁酰輔酶A。1mol的正丁酸經(jīng)β氧化途徑氧化分解最終生成2 mol乙酸和2 mol H2[1，28]。

1.3 丁酸異構(gòu)化反應(yīng)

有研究表明[30]，在微生物的作用下，正丁酸和異丁酸之間能夠相互轉(zhuǎn)化，并且正丁酸轉(zhuǎn)化為異丁酸的速率大于異丁酸轉(zhuǎn)化為正丁酸的速率。Matthies[29]等從湖底沉積物中分離獲得一株不具有丁酸氧化功能的厭氧細菌WoG13，該菌能夠使正丁酸和異丁酸之間發(fā)生異構(gòu)化(見圖2)，正丁酸和異丁酸異構(gòu)化反應(yīng)的吉布斯自由能基本為0。正丁酸和異丁酸都能被被輔酶A轉(zhuǎn)移酶激活，與輔酶A生成正/異丁酰輔酶A，正/異丁酰輔酶A被一種異丁酸異位酶催化，使正/異丁酸上羧基從與之相連的碳原子轉(zhuǎn)移到與該碳原子相鄰的另一個碳原子上，從而導致異構(gòu)的發(fā)生，該異丁酸異位酶嚴格依賴于輔酶B12存在。該研究還發(fā)現(xiàn)，H2和異丁酸積累時會抑制異構(gòu)化反應(yīng)的進行。除了WoG13，另有研究發(fā)現(xiàn)互營丁酸氧化菌Syntrophothermuslipocalidus也具有將異丁酸轉(zhuǎn)化為正丁酸的功能[24]。

1.輔酶A轉(zhuǎn)移酶； 2. ?；o酶A脫氫酶； 3. 烯酰輔酶A水化酶； 4. L-(+)-3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶； 5. 3-酮脂酰輔酶A硫解酶； 6.磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶； 7. 乙酸激酶圖1 丁酸氧化分解途徑[28]

圖2 丁酸異構(gòu)化途徑[29]

2 互營戊酸氧化菌和戊酸氧化分解途徑

2.1 互營戊酸氧化菌

戊酸包括正戊酸、異戊酸和2-甲基丁酸。目前分離獲得的正戊酸互營氧化菌株有12株，其中有兩株同時能氧化2-甲基丁酸。大部分正戊酸和2-甲基丁酸氧化菌都屬于能通過β-氧化途徑降解脂肪酸的互營單胞菌屬(Syntrophomonas)?；I戊酸氧化菌細胞以桿狀居多，生長pH值范圍基本都接近中性，分離培養(yǎng)的菌株中中溫氧化菌居多。

跟丁酸氧化菌一樣，目前分離培養(yǎng)的正戊酸和2-甲基丁酸氧化菌都必須與氫營養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷菌互營共生，少部分氧化菌同時還能與硫酸鹽還原菌共培養(yǎng)。大部分戊酸氧化菌除了能夠氧化戊酸之外，還能氧化丁酸等其它有機酸。一部分氧化菌能在含巴豆酸的基質(zhì)上單獨生長。除表1中列出的互營戊酸氧化菌外，從污水處理場沉積污泥分離獲得的Desulfovibriobutyratiphilus[9]也能夠氧化分解正戊酸。

1.乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶； 2.酰基輔酶A脫氫酶； 3.甲基巴豆酰基輔酶A 脫羧酶； 4. 3-甲基-戊烯二酰輔酶A水化酶； 5. 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A裂解酶； 6. 乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶； 7. 磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶； 8. 乙酸激酶圖3 異戊酸氧化分解途徑[26]

目前，還沒有分離得到能互營氧化異戊酸的菌株，僅僅獲得了一個能以異戊酸為唯一碳源的混合培養(yǎng)物，該混合培養(yǎng)物包括菌GraIval和Methanospirillumhungatei[26]。異戊酸是厭氧消化體系中重要的代謝產(chǎn)物，分離異戊酸氧化菌并對其進行功能的解析，對于揭示異戊酸互營氧化機理十分重要。

2.2 戊酸氧化分解途徑

基于到目前為止取得的成果，認為正戊酸和2-甲基丁酸是通過與丁酸氧化類似的β-氧化途徑氧化分解，產(chǎn)物為乙酸、丙酸和H2(見表2)[30]。吳為民[31]等研究發(fā)現(xiàn)，在微生物的作用下，2-甲基丁酸能通過異構(gòu)化產(chǎn)生正戊酸，但是正戊酸通過異構(gòu)化產(chǎn)生2-甲基丁酸的現(xiàn)象并沒有被觀察到，該反應(yīng)不可逆。該研究還發(fā)現(xiàn)，異戊酸與正戊酸之間并不會像正丁酸和異丁酸那樣在微生物的作用下發(fā)生異構(gòu)化現(xiàn)象[30]。

3 丁酸/戊酸產(chǎn)甲烷微生物群落研究

互營丁酸/戊酸氧化微生物的生理代謝功能是與其它生物及自然環(huán)境長期相互作用的結(jié)果，因此從群落水平來研究各微生物在群落中擔負的角色和產(chǎn)生的作用能更為準確地反映出丁酸/戊酸產(chǎn)甲烷微生物群落的物種組成、群落結(jié)構(gòu)、群落功能、群落演替，以及厭氧消化相關(guān)微生物之間及微生物與環(huán)境因子之間的相互關(guān)系等生態(tài)學基本問題，從而得以實現(xiàn)對厭氧消化產(chǎn)甲烷過程的相關(guān)微生物和環(huán)境因子的最優(yōu)化，對厭氧消化過程的最佳實時監(jiān)測與調(diào)控。湯岳琴[35]等研究了中溫條件下，不同稀釋率對以丁酸為唯一碳源的連續(xù)厭氧反應(yīng)系統(tǒng)中群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)在低稀釋率下乙酸營養(yǎng)型的Methanosaeta和氫營養(yǎng)型的Methanoculleus為主要的產(chǎn)甲烷古菌，與Syntrophaceae相似的菌為主要的細菌；在高稀釋率下是Methanosaeta，Methanosarcina和氫營養(yǎng)型的Methanoculleus、，Methanospirillum為主要的產(chǎn)甲烷古菌，屬于Firmicutes的細菌和 Candidate division OP3為主要的細菌。該研究同時也表明在厭氧消化體系中存在大量未知的細菌，它們與丁酸的氧化分解之間的關(guān)系并不清楚。

由于互營脂肪酸氧化菌的難培養(yǎng)性，導致基于微生物分離培養(yǎng)的相關(guān)研究困難，需要在微生物群落水平進行這些難培養(yǎng)微生物結(jié)構(gòu)和功能的解析，這就需要一種能夠直接從復雜群落中甄別功能微生物的技術(shù)。穩(wěn)定性同位素探針技術(shù) SIP (Stable isotope probing)能將復雜群落中微生物物種組成及其生理功能耦合分析的有力工具。利用穩(wěn)定性同位素示蹤復雜群落中微生物基因組 DNA或RNA等物質(zhì)， 能在群落水平上定向獲得某種功能微生物的生物學信息，解析它們在群落水平上的功能和代謝[36]。利用SIP研究丁酸/戊酸產(chǎn)甲烷體系中微生物群落的報道極少，到目前為止，僅有兩篇報道。Hatamoto[37]等利用13C丁酸分別標記了棕櫚油廠廢水中/高溫顆粒污泥、棕櫚油廠廢水厭氧污泥及工廠固體廢物的微生物，發(fā)現(xiàn)RNA被13C標記的細菌中，Clostridium，Clostridium及Tepidanaerobacter，Syntrophaceae分別為3種污泥中的優(yōu)勢菌。由此他們認為在不同的環(huán)境下，互營丁酸氧化菌的主要菌群會發(fā)生變化。張琛[27]利用13C丁酸對不同銨濃度處理的污泥進行標記，發(fā)現(xiàn)參與丁酸氧化產(chǎn)甲烷過程的細菌主要是Syntrophomonaceae，古菌主要是Methanosaetaceae和Methanospirillaceae，銨濃度的升高導致丁酸互營氧化和產(chǎn)甲烷過程受到不同程度的抑制。

有關(guān)自然環(huán)境中互營丁酸/戊酸氧化菌相關(guān)研究也較少，目前僅有兩篇報道。Chauhan[38]等利用13C丁酸標記了佛羅里達大沼澤地的富營養(yǎng)區(qū)、過渡區(qū)和貧營養(yǎng)區(qū)的土壤微生物，發(fā)現(xiàn)在DNA被13C標記的細菌中，在富營養(yǎng)區(qū)Syntrophospora和Syntrophomonas是主要的優(yōu)勢菌屬，在過渡區(qū)Pelospora是主要的優(yōu)勢菌屬，在貧營養(yǎng)區(qū)Pelospora及一些硫酸鹽還原菌是主要的優(yōu)勢菌屬；在被13C標記的古菌中，在富營養(yǎng)區(qū)Methanomicrobiaceae,Methanospirillaceae和Methanosaetaceae為主要的產(chǎn)甲烷古菌，在過渡區(qū)Methanosarcina為主要的產(chǎn)甲烷古菌。劉鵬飛[39]等利用13C丁酸標記了稻田土壤中的微生物，發(fā)現(xiàn)一些屬于Syntrophomonadaceae的細菌以及兩類產(chǎn)甲烷古菌Methanosarcinaceae和Methanocellales的核酸被13C標記上。以上利用SIP的研究成果表明，環(huán)境中的互營脂肪酸氧化菌的種類遠比我們認為的要多。

基于新興的SIP技術(shù)的研究結(jié)果可以推測可能參與丁酸/戊酸氧化分解的物種，但它們是否確實具備這個能力以及它們?nèi)绾螌Χ∷?戊酸進行代謝，還需要其它技術(shù)的配合，而宏組學(Metaomics)技術(shù)是最直接有效的[40]。遺憾的是，到目前為止還沒有將SIP技術(shù)和宏組學技術(shù)結(jié)合起來研究厭氧消化體系中具有丁酸/戊酸氧化功能的微生物類群的研究報道。

截至目前，關(guān)于丁酸及戊酸產(chǎn)甲烷的微生物群落研究較少，特別是與戊酸產(chǎn)甲烷相關(guān)的微生物群落研究幾乎還是一片空白。因此，研究丁酸/戊酸產(chǎn)甲烷微生物群落顯得十分必要。

4 總結(jié)

綜上所述，到目前為止，分離獲得的正丁酸氧化菌有14株，其中2株可以氧化異丁酸，正戊酸氧化菌12株，其中2株可以氧化2-甲基丁酸，氧化異戊酸的混合培養(yǎng)物有一個。目前已知的丁酸和戊酸的互營氧化途徑為β氧化，正丁酸和異丁酸，正戊酸和2-甲基丁酸之間存在異構(gòu)化現(xiàn)象。利用SIP技術(shù)的群落水平研究結(jié)果表明，厭氧消化系統(tǒng)以及環(huán)境當中存在遠比已分離菌株更高多樣性的互營脂肪酸氧化菌。

目前，關(guān)于互營丁酸/戊酸氧化菌的微生物學研究還非常有限，還需要在以下幾個方面開展更深入的研究： 1)將SIP技術(shù)與宏組學技術(shù)相結(jié)合，從群落水平系統(tǒng)研究厭氧消化體系中未知互營丁酸/戊酸氧化菌群結(jié)構(gòu)及代謝特征； 2)分離未知互營丁酸/戊酸互營氧化菌，特別是異戊酸氧化菌，并對其進行功能解析，揭示互營丁酸/戊酸互營氧化機理；3)系統(tǒng)研究互營丁酸/戊酸氧化菌群結(jié)構(gòu)和代謝對環(huán)境因子如溫度、負荷、各類抑制物等的響應(yīng)機制，為目標群落的調(diào)控提供基礎(chǔ)依據(jù)。

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Microbiology Research Progress of Syntrophic Butyrate and Valerate Oxidization Producing Methane /

YI Yue1, WANG Hui-zhong1, ZHENG Dan2, GOU Min1, TANG Yue-qin1/

(1.College of Architecture and Environment, Sichuan University, Sichuan Environmental Protection Key Lab of Organic Wastes Resource Utilization, Chengdu, Chengdu 610065, China； 2.Biogas Institute of Ministry of Agriculture，Chengdu 610041，China)

Butyrate and valerate are the important intermediates during methane fermentation, especially in the anaerobic system treating wastewater containing protein. The research on microbiology of syntrophic butyrate/valerate oxidization is of great importance for treatment of the wastewater containing protein and for system stable and effective operation. This paper mainly summarized the isolated and obtained syntrophic butyrate/valerate oxidization bacteria to date, introduced the known metabolic pathway of syntrophic butyrate/valerate oxidization. In addition, the current research situation on microbial communities of syntrophic butyrate/valerate oxidization was reviewed. Suggestions for future research were proposed．

butyrate; valerate; syntrophic fatty acid oxidization; methane fermentation; anaerobic digestion

2017-02-22

項目來源： 科技部政府間國際科技創(chuàng)新合作重點專項(2016YFE0127700)

易 悅(1992-)，女，四川廣安人，本科，主要從事互營有機酸菌群解析研究，E-mail:januaryfuji@163.com 通信作者： 湯岳琴，E-mail:tangyq@scu.edu.cn

S216.4; X172

A

1000-1166(2017)03-0003-08