李晨++包國章++成文革++李子勇++李艷芳

摘要：以黑麥草品種冬牧70為材料，研究凍融及pH值4.5模擬酸沉降條件對黑麥草幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，在凍融脅迫下，黑麥草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA）含量呈上升趨勢，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性明顯提升，最高值分別為 107.35、6.23 U/mg；在pH值4.5酸沉降脅迫下，黑麥草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量逐漸降低，在-2 ℃時(shí)降到最低點(diǎn)，下降了20.37%，可溶性糖、丙二醛含量隨溫度下降而降低，最低值分別為10.42 mg/g、17.61 μmol/g；凍融與酸沉降復(fù)合脅迫處理對黑麥草幼苗的作用高于單一脅迫的作用效果，黑麥草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白、丙二醛含量、POD活性呈上升趨勢，可溶性糖含量、SOD活性分別下降。試驗(yàn)結(jié)果表明，黑麥草幼苗對凍融和酸沉降逆境脅迫存在著明顯的相互適應(yīng)現(xiàn)象，對凍融及酸沉降型傷害有很強(qiáng)的適應(yīng)性，且有一定的耐酸性和耐寒性。

關(guān)鍵詞：黑麥草幼苗；凍融脅迫；酸沉降脅迫；生理特性

中圖分類號： S181文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0159-04

二年生黑麥草（ryegrass）是我國重要的牧草和草坪草之一，廣泛分布于溫帶地區(qū)，具有抗寒性強(qiáng)、覆蓋能力強(qiáng)、返青早、抗病蟲害能力強(qiáng)等特性[1-2]。黑麥草富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及維生素，其經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值較高。冬牧70黑麥草是從美國引進(jìn)的越年生禾本科植物，是我國北方重要的牧草和草坪草之一，于20世紀(jì)90年代初引入我國，種植冬牧70黑麥牧草是改善我國北方農(nóng)區(qū)春季飼草嚴(yán)重不足現(xiàn)狀的可行途徑之一，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

凍融是指氣候的日、年和多年變化導(dǎo)致特定氣候區(qū)域地球表層一定范圍的土凍結(jié)和融化作用，地球上受凍融作用的面積約占全球陸地總面積的70%，我國受凍融作用的面積約占國土陸地總面積的98%。凍融過程引起的環(huán)境改變對植物生長發(fā)育產(chǎn)生一系列直接或間接影響，使植被形態(tài)特征和生理功能等方面形成了特殊的適應(yīng)性。揭示黑麥草對逆境環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制是培養(yǎng)抗寒性強(qiáng)的黑麥草品種的關(guān)鍵，這有助于采取有效的措施減輕低溫對植物造成的危害。

酸沉降脅迫對植物的生長發(fā)育會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重不利影響，這已成為全球性環(huán)境污染問題之一。研究黑麥草幼苗對模擬酸沉降生理指標(biāo)的影響，可以了解黑麥草抗酸沉降的能力，為研究植物對酸沉降脅迫適應(yīng)能力提供理論依據(jù)。

過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）是清除活性氧的關(guān)鍵酶，其活性的高低反映了植物抗逆性的強(qiáng)弱，植物能通過應(yīng)激性反應(yīng)，激活抗氧化劑和誘導(dǎo)抗氧化酶的活性，減弱膜脂過氧化作用，保持膜的穩(wěn)定性[3]。丙二醛（MDA）從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后，可與蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)，引起膜蛋白與膜內(nèi)脂的變化，從而改變細(xì)胞膜系統(tǒng)?？扇苄蕴亲鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)和信號物質(zhì)，可減緩由脅迫造成的生理代謝不平衡。

為此，本研究將通過凍融及酸沉降脅迫的方法，測定黑麥草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量、MDA含量、POD活性、SOD活性和可溶性糖含量這些生理指標(biāo)在逆境脅迫中的變化和恢復(fù)能力，為揭示牧草和草坪草抗凍能力及防治酸沉降對其危害提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試材培養(yǎng)

試驗(yàn)于2015年9月在吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院室內(nèi)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試材料為冬牧70黑麥草（ryegrass），由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子部門提供。

挑選籽粒飽滿、大小均勻的種子，用0.1% KMnO4溶液進(jìn)行消毒，溶液消毒2 h后取出并以礦泉水沖洗干凈備用。將種子整齊排放在鋪有2層濾紙的長方形托盤（30 cm×40 cm）內(nèi)，放于SPX-300光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，其溫度設(shè)定為25 ℃，每天光照12 h，加水4次，保持濾紙濕潤。培養(yǎng) 7 d 待幼苗長至16 cm時(shí)，選取長勢一致的幼苗用于試驗(yàn)。

1.2模擬酸沉降母液的配制

根據(jù)吉林省長春市天然降水pH值及離子水平，依據(jù)文獻(xiàn)[4]方法配制模擬酸沉降母液，考慮天然降水離子成分的復(fù)雜性，選用礦泉水配制模擬酸沉降的原溶液。用濃硫酸和濃硝酸（SO42- ∶NO3-=5 ∶1）配制pH值為4.5的酸沉降母液，用PHS-3C型雷磁酸度計(jì)測定與校核。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1人工凍融試驗(yàn)把試驗(yàn)中需要凍融脅迫的黑麥草幼苗樣品標(biāo)記好后進(jìn)行融凍—凍融處理。融凍試驗(yàn)處理為每2 h降溫6 ℃，凍融試驗(yàn)為每2 h升溫6 ℃。試驗(yàn)的溫度梯度設(shè)計(jì)為10、4、-2、4、10 ℃，融凍溫度階段為10 ℃—-2 ℃，凍融溫度階段為-2 ℃—10 ℃。每2 h變溫隨即取樣，重復(fù)取6份樣本進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.3.2模擬酸沉降試驗(yàn)取1盤鋪放均勻的黑麥草種子，標(biāo)記為酸沉降組進(jìn)行試驗(yàn)。培育7 d，待種子長出幼苗后，對酸沉降組均勻滴加50 mL酸沉降溶液。滴加時(shí)間為09：00，放置24 h后，進(jìn)行指標(biāo)測定。每2 h取樣1次，重復(fù)抽取6份樣本進(jìn)行試驗(yàn)測定。

1.4測定生理指標(biāo)

硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定丙二醛、可溶性糖含量[5]；考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白質(zhì)含量[5]；SOD、POD活性均用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，用分光光度計(jì)進(jìn)行測定。每個(gè)指標(biāo)均設(shè)6組平行樣。

1.5數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 8.5繪制圖表，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，圖中數(shù)據(jù)均為6次重復(fù)測定值的平均值。

2結(jié)果與分析

2.1凍融及酸沉降脅迫對黑麥草幼苗體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響

如圖1所示，與凍融+酸沉降復(fù)合脅迫相比，經(jīng)凍融脅迫的黑麥草幼苗體內(nèi)蛋白質(zhì)含量高于復(fù)合脅迫；在融凍階段，當(dāng)溫度下降到-2 ℃時(shí)，黑麥草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量達(dá)到最高值，為0.95 mg/g，比復(fù)合脅迫下的蛋白質(zhì)含量增加了15.83%；在凍融階段，溫度回升到10 ℃時(shí)，可溶性蛋白含量逐漸下降，復(fù)合脅迫組、凍融組蛋白質(zhì)含量分別為 0.57、0.70 mg/g。這說明低溫脅迫可使黑麥草體內(nèi)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，增加了其可溶性蛋白含量，黑麥草自身的抗寒性可提高細(xì)胞的保水能力，保護(hù)生物膜及防止活性氧對膜脂和膜蛋白的氧化作用[6]。在融凍—凍融脅迫下，黑麥草幼苗體內(nèi)抗逆蛋白質(zhì)合成量快速增加，使束縛水相對增多，降低了幼苗體內(nèi)細(xì)胞結(jié)冰而致死的概率，起到一定的抗寒作用[7]。經(jīng)pH值4.5酸沉降脅迫處理后的黑麥草幼苗體內(nèi)蛋白質(zhì)含量先升高隨后下降，在溫度為-2 ℃時(shí)，降到最低值0.54 mg/g，在4 ℃時(shí)，達(dá)到最高值，為0.64 mg/g。本試驗(yàn)中，酸沉降脅迫下的黑麥草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量低于復(fù)合脅迫（P<0.05），降幅為3.03%～29.03%。這是由于在酸沉降脅迫下黑麥草體內(nèi)的蛋白質(zhì)遭到破壞，產(chǎn)生逆境脅迫生理效應(yīng)，從而誘發(fā)幼苗體內(nèi)自由基反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致黑麥草體內(nèi)細(xì)胞代謝紊亂，這與黃開志關(guān)于模擬酸雨對蔬菜細(xì)胞透性的影響研究結(jié)果[8]一致。黑麥草幼苗經(jīng)凍融及酸沉降復(fù)合脅迫處理后，可溶性蛋白質(zhì)含量隨溫度降低而升高，在溫度為-2 ℃時(shí)上升到最高值，為0.82 mg/g。與經(jīng)酸沉降脅迫的黑麥草幼苗相比，經(jīng)凍融處理的黑麥草幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量均明顯升高。

2.2凍融及酸沉降脅迫對黑麥草幼苗體內(nèi)可溶性糖含量的影響

在pH值4.5酸沉降脅迫下，與凍融+酸沉降復(fù)合脅迫下相比，黑麥草幼苗可溶性糖含量明顯升高，上升了 27.54%～44.49%；在溫度為4 ℃時(shí)，達(dá)到最高值，為 13.9 mg/g，隨著溫度的逐漸下降，在-2 ℃時(shí)，可溶性糖含量降到最低值，為10.42 mg/g（圖2）。這表明酸沉降不僅嚴(yán)重影響黑麥草葉片對氮素的吸收和利用，也阻礙了莖葉中的可溶性糖向根系運(yùn)輸，造成幼苗生長速率下降、葉片變黃，表現(xiàn)出明顯的傷害癥狀，這與童貫和等關(guān)于小麥幼苗體內(nèi)可溶性糖的影響研究結(jié)果[9]一致。在凍融脅迫下，與復(fù)合脅迫相比，黑麥草幼苗體內(nèi)可溶性糖含量隨溫度降低而顯著升高，在-2 ℃時(shí)達(dá)到最高值，為15.76 mg/g，在溫度為10 ℃時(shí)降到最低值，為13.10 mg/g，降低了16.88%。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，凍融脅迫下黑麥草幼苗體內(nèi)的可溶性糖類含量呈上升趨勢，這表明凍融脅迫能對植物溶質(zhì)的積累和滲透起到調(diào)節(jié)作用[10]。在凍融+酸沉降復(fù)合脅迫條件下，黑麥草幼苗體內(nèi)可溶性糖含量隨溫度下降而降低，在溫度降到最低點(diǎn)-2 ℃時(shí)，得到最小值8.77 mg/g。分析可得，低溫脅迫下黑麥草幼苗體內(nèi)會(huì)大幅度地積累可溶性糖類，其抗寒性也隨之增強(qiáng)。

2.3凍融及酸沉降脅迫對黑麥草幼苗體內(nèi)MDA含量的影響

由圖3可知，在凍融脅迫下，黑麥草幼苗體內(nèi)MDA含量高于凍融+酸沉降復(fù)合脅迫下的含量，增加10.74%～12.88%；在融凍階段，溫度為-2 ℃時(shí)，幼苗體內(nèi)MDA含量達(dá)到最高值，為28.39 μmol/g；在凍融階段，溫度在10 ℃時(shí)，MDA含量最低，為22.62 μmol/g。這表明在凍融脅迫下，黑麥草幼苗細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損害，產(chǎn)生高活性的過氧化產(chǎn)物，使黑麥草幼苗體內(nèi)MDA含量逐漸上升。這與宋采博等關(guān)于不同溫度對白三葉幼苗生長的影響研究結(jié)果[11]相一致。經(jīng)pH值4.5酸沉降脅迫處理后，與復(fù)合脅迫處理相比，黑麥草幼苗體內(nèi)MDA含量隨溫度降低而下降，下降了10.16%～4282%（P<0.05），在-2 ℃時(shí)達(dá)到最低值 17.61 μmol/g（圖3），這表明酸沉降脅迫影響黑麥草幼苗體內(nèi)MDA的分泌，且隨著酸脅迫的加深MDA含量增加，直接導(dǎo)致葉片膜結(jié)構(gòu)的損害[12]。經(jīng)凍融+酸沉降復(fù)合脅迫處理后，黑麥草幼苗體內(nèi)MDA含量隨溫度下降而升高，在溫度為-2 ℃時(shí)，達(dá)到最高值25.15 μmol/g（圖3）。上述分析顯示，在單一凍融脅迫下，黑麥草幼苗體內(nèi)MDA含量隨溫度降低而升高，但在pH值4.5的酸沉降脅迫下其體內(nèi)MDA含量明顯降低。這說明酸沉降可降低黑麥草幼苗體內(nèi)MDA含量，減少凍融對黑麥草幼苗的損傷，增強(qiáng)了黑麥草幼苗自身的抗寒性。

2.4凍融及酸沉降脅迫對黑麥草幼苗體內(nèi)SOD活性的影響

在凍融脅迫條件下，與凍融+酸沉降復(fù)合脅迫相比，黑麥草幼苗體內(nèi)SOD活性提高，在溫度為-2 ℃時(shí)，SOD活性達(dá)到最高值107.35 U/mg，提升了 37.12%（圖4）。SOD活性升高說明黑麥草自身抗寒性變強(qiáng)，膜傷害程度變低。SOD可有效地清除過多的自由基而抑制過氧化作用，能及時(shí)清除幼苗體內(nèi)的有害物質(zhì)，保護(hù)黑麥草自身不受損傷[12]。與經(jīng)復(fù)合脅迫處理的幼苗相比，經(jīng)pH值4.5酸沉降脅迫的幼苗體內(nèi)SOD活性較高，其活性趨勢先降低，隨后升高，在10 ℃時(shí)，SOD活性達(dá)到最高值，為122.51U/mg，在溫度為4℃時(shí)，

SOD活性降到最低點(diǎn)，為93.88 U/mg（圖4）。這與呂家根等關(guān)于酸雨脅迫下小麥微弱延遲發(fā)光及其生理變化的研究結(jié)果[13]一致。在凍融+酸沉降復(fù)合脅迫條件下，黑麥草幼苗體內(nèi)SOD活性隨溫度下降而降低，在溫度為-2 ℃時(shí)降到最低點(diǎn)，為78.29 U/mg（圖4）。這表明酸沉降脅迫能增強(qiáng)黑麥草幼苗體內(nèi)SOD活性，逆境脅迫可以促進(jìn)活性氧產(chǎn)生，加強(qiáng)膜脂氧化作用，平衡黑麥草體內(nèi)活性氧。

2.5凍融及酸沉降脅迫對黑麥草幼苗體內(nèi)POD活性的影響

如圖5所示，與凍融+酸沉降復(fù)合脅迫相比，在凍融脅迫條件下的黑麥草幼苗體內(nèi)POD活性降低，下降了11.71%～20.67%；在融凍階段，幼苗體內(nèi)POD活性隨溫度下降而升高，在-2 ℃時(shí)，達(dá)到最高值6.23 U/mg；在凍融階段，幼苗體內(nèi)POD活性隨溫度升高而降低，在溫度為10 ℃時(shí)，降到最低值5.1 U/mg。本研究表明，在凍融單一脅迫下，黑麥草幼苗體內(nèi)POD活性隨溫度降低逐漸升高，凍融促使黑麥草幼苗的細(xì)胞膜透性降低，促進(jìn)細(xì)胞自由基積累，從而激活了黑麥草細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，使POD活性逐漸增強(qiáng)[14]。與復(fù)合脅迫下的黑麥草幼苗體內(nèi)POD活性相比，pH值4.5酸沉降脅迫下的幼苗體內(nèi)POD活性隨溫度下降逐漸升高，在溫度降到 -2 ℃ 時(shí)，升到最高值 6.28 U/mg，在溫度上升到10 ℃時(shí)，POD活性下降到最低值4.68 U/mg（圖5）。這與王濤等關(guān)于模擬酸雨脅迫對菲白竹生理特性的影響研究結(jié)果[15]一致。黑麥草幼苗體內(nèi)POD活性逐漸提高，說明黑麥草自身有較強(qiáng)的抗酸能力，對逆境的適應(yīng)能力強(qiáng)，這與郭慧媛等關(guān)于模擬酸雨對毛竹葉片抗氧化酶活性的影響研究結(jié)果[16]一致。在凍融+酸沉降復(fù)合脅迫條件下，幼苗體內(nèi)POD活性隨溫度降低而升高，在-2 ℃時(shí)，升到最高值，為6.96 U/mg；在溫度升到10 ℃時(shí)，POD活性下降，為5.49 U/mg（圖5）。以上分析表明，凍融+酸沉降復(fù)合脅迫能使黑麥草幼苗體內(nèi)的POD活性含量增加。

3結(jié)論

變溫脅迫可使黑麥草積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，增加了其可溶性蛋白、可溶性糖、MDA含量，SOD和POD活性也明顯提升。在酸沉降脅迫下，黑麥草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白、可溶性糖、MDA含量呈下降趨勢，SOD和POD活性提高。結(jié)果表明，黑麥草自身具有較強(qiáng)的抗寒性，在低溫脅迫下可以起到自我保護(hù)的作用，同時(shí)黑麥草也具有一定的抗酸性，對逆境的適應(yīng)能力強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李國輝，李志堅(jiān)，胡躍高. 青刈黑麥產(chǎn)草量與營養(yǎng)動(dòng)態(tài)分析[J]. 草地學(xué)報(bào)，2000，8（1）：49-54.

[2]多立安，趙樹蘭. 刈割冬牧70黑麥地上生物量動(dòng)態(tài)與草群再生效應(yīng)的研究[J]. 植物研究，2001，21（2）：304-307.

[3]Dax M，Yin W X，Zhao Y X，et al. The production and scavenging of reactive oxygen specices in plants[J]. Chin J Biology，2001，17（2）：121-125.

[4]杜子銀，蔡延江，王小丹，等. 土壤凍融作用對植物生理生態(tài)影響研究進(jìn)展[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，22（1）：1-9.

[5]黃婷，邵輝，吳坤勝，等. 模擬酸雨對黑麥草種子萌發(fā)及生理特性的影響[J]. 種子，2011，30（4）：8-11.

[6]黃輝，黃朝法. 酸雨對植物生理生態(tài)特性的影響研究進(jìn)展[J]. 林業(yè)勘察設(shè)計(jì)，2008（1）：46-49.

[7]李軼冰，楊順強(qiáng)，任廣鑫，等. 低溫處理下不同禾本科牧草的生理變化及其抗寒性比較[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（3）：1341-1347.

[8]黃開志. 模擬酸雨對蔬菜細(xì)胞透性和營養(yǎng)及衛(wèi)生品質(zhì)的影響[J]. 生物學(xué)通報(bào)，2000，35（2）：34.

[9]童貫和，梁惠玲. 模擬酸雨及其酸化土壤對小麥幼苗體內(nèi)可溶性糖和含氮量的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，16（8）：1487-1492.

[10]孫亞琴，尚鶴，鄧仕槐，等. 模擬酸雨脅迫對夾竹桃MDA和MP的影響[C]//四川省環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì).四川省水污染控制工程學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集. 成都，2009：176-181.

[11]宋采博，王波. 不同溫度對白三葉種子發(fā)芽及幼苗生長的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（11）：2772-2774.

[12]王強(qiáng)，金則新，彭禮瓊. 模擬酸雨對烏藥幼苗生理生態(tài)特性的影響[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2013，40（4）：447-455.

[13]呂家根，占達(dá)東，王周平，等. 酸雨脅迫下小麥微弱延遲發(fā)光及其生理生態(tài)變化相關(guān)性研究[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào)，2003，61（5）：760-764.

[14]王晨光，王希，蒼晶，等. 低溫脅迫對水稻幼苗抗冷性的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（2）：205-207.

[15]王濤，張珊珊，謝寅峰，等. 模擬酸雨脅迫對菲白竹生理特性的影響[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，42（11）：17-21.

[16]郭慧媛，馬元丹，王丹，等. 模擬酸雨對毛竹葉片抗氧化酶活性及釋放綠葉揮發(fā)物的影響[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，38（8）：896-903.