邢芳芳+高明夫+胡兆平++范玲超

摘要：利用1株實(shí)驗(yàn)室保藏的、分離自大棚黃瓜根際土壤的芽孢桿菌KN1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在溫室條件下研究KN1菌株對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲病的防治效果及其對(duì)黃瓜的促生能力，并對(duì)該菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明：接種60 d在溫室盆栽試驗(yàn)中，KN1菌劑蘸根處理線蟲減退率和防治效果分別為48.2%和41.5%，與單獨(dú)使用10%噻唑磷顆粒劑效果相當(dāng)，能夠顯著減少根結(jié)的生成，KN1菌劑蘸根與10%噻唑磷顆粒劑配合使用效果較好，線蟲減退率和防治效果分別達(dá)71.5%和57.27%；KN1蘸根處理黃瓜植株鮮質(zhì)量、根系干質(zhì)量分別比不接種菌劑對(duì)照增加30.33%和 70.89%；基于16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，菌株KN1屬于蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），與蘇云金芽孢桿菌serovar konkukian序列的相似度達(dá)99.5%，結(jié)合該菌的培養(yǎng)特征、形態(tài)特征將其鑒定為蘇云金芽孢桿菌。菌株KN1的鑒定及對(duì)黃瓜的溫室盆栽防治效果為研究其生防機(jī)制及開發(fā)應(yīng)用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃瓜；根結(jié)線蟲；防治效果；促生作用；蘇云金芽孢桿菌；生防機(jī)制；開發(fā)應(yīng)用

中圖分類號(hào)： S432.4+5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0101-03

隨著設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，作物的病蟲害日趨嚴(yán)重如根腐病、線蟲病等病蟲害，其中黃瓜根結(jié)線蟲病為較突出的線蟲病害之一。黃瓜根結(jié)線蟲病由植物線蟲南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）侵染引起的，主要危害側(cè)根和須根，染病株發(fā)病初始地上部分癥狀不明顯，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)植株明顯矮化，結(jié)瓜少而小，地上部分出現(xiàn)萎蔫或逐漸枯黃，最后植株枯死。目前，生產(chǎn)上對(duì)根結(jié)線蟲的防治主要是利用化學(xué)藥劑和抗病品種。在長期的作物生產(chǎn)中曾采用一系列措施防治根結(jié)線蟲，包括化學(xué)和生物類殺線劑，但效果并不理想，原因在于根結(jié)線蟲種間致病性和抗藥性差異很大[1-2]，雖然在大多數(shù)情況下化學(xué)類殺線劑是有效的，但因存在環(huán)境污染和影響人類健康等問題而受到限制，亟待開發(fā)一種可代替化學(xué)殺線劑的生物類殺線劑。目前，在許多生物防治措施中經(jīng)常利用食線蟲真菌防治植物線蟲病害，但尚很少有商品化生防制劑，且部分菌株對(duì)人體健康存在影響。因此，對(duì)根結(jié)線蟲病的有效防治很有必要找出一種有效的天然生物制劑來替代巨毒化學(xué)農(nóng)藥。利用從健康黃瓜土壤中篩分的芽孢桿菌發(fā)酵后進(jìn)行回接試驗(yàn)，以黃瓜為供試作物，在溫室盆栽中進(jìn)行防治黃瓜根結(jié)線蟲病的生測試驗(yàn)[3]，為開發(fā)安全、高效防治黃瓜根結(jié)線蟲病的生物制劑及合理應(yīng)用起到一定的指導(dǎo)作用。

1材料與方法

1.1供試菌株

菌株KN1保藏于養(yǎng)分資源高效開發(fā)與綜合利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室，篩分自山東省臨沂市大棚健康黃瓜根際土壤。

1.2培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2，在10萬Pa下滅菌30 min。種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨8 g，酵母提取物5 g，葡萄糖10 g，NaCl 5.0 g，pH值7.0，分裝于300 mL三角燒瓶內(nèi)，每瓶50 mL，10萬Pa下滅菌15 min[4]。菌株發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉2 g，黃豆餅粉2.67 g，酵母粉0.55 g、K2HPO4 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，CaCO3 0.04 g，ZnSO4 0.02 g，蒸餾水100 mL，pH值7.2，裝于500 mL三角燒瓶內(nèi)，10萬Pa滅菌30 min[4]。

1.3菌株KN1的活化

取冰箱保存的試管斜面，劃線活化于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，連續(xù)傳代2次即得到活化菌株。

1.4菌株KN1制劑的制備

挑取活化后的健壯KN1菌落接種于種子培養(yǎng)基中，于 37 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)18 h，按照10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基接種10 mL，置于 200 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)32 h，即得KN1發(fā)酵液，離心發(fā)酵液得上清液和菌體沉淀，將菌體沉淀用滅菌水配成含有100億CFU/mL的KN1菌劑。

1.5菌株KN1黃瓜盆栽試驗(yàn)

1.5.1試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)試驗(yàn)于2016年9—12月在金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司的智能玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)期間平均溫度28 ℃，濕度70%左右。

1.5.2試驗(yàn)材料供試黃瓜品種北京301，種子由山東省濰坊市蔬菜研究所提供；供試藥劑為10%顆粒噻唑磷，由日本石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)；供試底肥為N、P2O5、K2O含量均為15%的硝基復(fù)混肥；供試土壤為砂姜黑土，有機(jī)質(zhì)含量129 g/kg。

1.5.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)先進(jìn)行苗床育苗，25 d后選取苗床長勢一致的黃瓜幼苗進(jìn)行移栽，每盆2株。從溫室大棚中取病土充分混勻，每盆裝病土5 kg，硝基復(fù)混肥作為底肥一次性施入土壤，施入量為0.33 g/盆。空白對(duì)照組（CK），不接菌的病土；處理1（T1），用KN1菌劑（100億CFU/mL）蘸根，處理2（T2），為藥劑處理，將1 g 10%噻唑磷顆粒劑與病土均勻裝盆；處理3（T3），在處理2的基礎(chǔ)上移栽時(shí)再用KN1菌劑蘸根，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，其間適時(shí)定量澆水，管理措施一致。

1.5.4KN1菌株對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲的防效測定盆栽60 d后，取出根系周圍土，混勻，取100 g作為調(diào)查土樣，用貝曼漏斗法分離土壤中的線蟲，調(diào)查土壤中2齡線蟲的數(shù)量，與空白對(duì)照相比計(jì)算線蟲減退率。土壤中線蟲數(shù)量的測定參考 Castillo 等方法[5]；根結(jié)指數(shù)的測定和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照Bird等的方法[6-7]，并調(diào)查病株及根系受侵染程度，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。病害嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]：0級(jí)，根系上無根結(jié)；1級(jí)，輕度感染，僅有少量的小根結(jié)，根結(jié)率在3.0%及以下；2級(jí)，根結(jié)率為3.1%～25.0%；3級(jí)，根結(jié)較多，根結(jié)率為 25.1%～50.0%；4級(jí)，在根瘤上有再次根結(jié)，50.1%～750%根系有根結(jié)；5級(jí)，根結(jié)相互連接成根結(jié)團(tuán)塊，75.0%以上根系有根結(jié)。

1.5.5KN1菌株對(duì)黃瓜植株的促生作用的測定收獲時(shí)測定植株鮮質(zhì)量、根系干質(zhì)量[9-10]。

1.5.6數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理，利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

1.616S rDNA序列分析鑒定

菌株KN1的16S rDNA PCR擴(kuò)增參考謝永麗等的方法[11]。將KN1活化菌株接入種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基裝瓶量為70 mL/300 mL，于37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，并用滅菌濾紙吸干多余水分，利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，提取KN1基因組，擴(kuò)增引物分別為16S rDNA，通用引物為：27F，5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：10×buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，引物27F 0.5 μL、1492R 0.5 μL，Taq酶0.2 μL，G1基因組0.5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性35 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。由生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物測序，將測得的16S rDNA序列提交至GenBank，與數(shù)據(jù)庫中相似性高的相關(guān)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)。

2結(jié)果與分析

2.1生防芽孢桿菌KN1菌劑對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲的盆栽防效

通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處理組對(duì)線蟲的防治均有一定的效果，其中T3施用噻唑磷拌土、菌劑蘸根處理的線蟲減退率和防治效果最高，分別為71.5%和57.27%，T1菌劑蘸根處理線蟲減退率和防治效果分別為48.2%和41.5%，僅次于10%噻唑磷顆粒劑土壤處理的52.68%和42.15%。單獨(dú)施用KN1菌劑和10%噻唑磷顆粒劑線蟲防效都達(dá)到40%以上，2齡線蟲數(shù)量和病情指數(shù)均顯著低于對(duì)照，生防菌KN1蘸根配合10%噻唑磷顆粒劑使用線蟲減退率達(dá)到71.5%，防治效果達(dá)到57.27%，具有較好的生防潛力。

2.2生防芽孢桿菌KN1菌劑對(duì)黃瓜盆栽促生效果

與對(duì)照相比，生防菌KN1蘸根、10%噻唑磷顆粒劑土壤處理及蘸根配合10%噻唑磷顆粒劑土壤處理都具有增加黃瓜植株鮮質(zhì)量的作用，較對(duì)照組差異達(dá)到顯著水平。其中，KN1菌劑蘸根處理黃瓜植株鮮質(zhì)量較對(duì)照增加30.33%，10%噻唑磷顆粒劑土壤處理黃瓜植株鮮質(zhì)量較對(duì)照增加 30.12%，蘸根配合10%噻唑磷顆粒劑土壤處理對(duì)黃瓜鮮質(zhì)量影響最大，單株鮮質(zhì)量達(dá)到95.2 g，比對(duì)照增加33.03%，略高于10%噻唑磷顆粒劑土壤處理和KN1菌液蘸根處理，但處理組之間差異不顯著。各處理組根系干質(zhì)量較對(duì)照顯著增加，生防菌KN1蘸根、10%噻唑磷顆粒劑土壤處理及蘸根配合10%噻唑磷顆粒劑土壤處理根系干質(zhì)量分別較對(duì)照增加67.34%、66.95%、70.89%，其中蘸根配合10%噻唑磷顆粒劑土壤處理根系干質(zhì)量最大達(dá)到4.45 g，生防菌KN1蘸根處理其次為4.36 g，但處理組之間差異不顯著。由圖1可以看出，生防菌KN1蘸根具有明顯的提高黃瓜植株鮮質(zhì)量及促進(jìn)根系發(fā)育的作用。

2.316S rDNA測定結(jié)果

生防菌株KN1的16S rDNA基因序列擴(kuò)增后片段長度為1 511 bp，使用BLAST程序?qū)⒃撔蛄信cNCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，然后使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。分析結(jié)果（圖2）表明，菌株KN1與蘇云金芽孢桿菌serovar

konkukian同源性最高，匹配程度可達(dá)到99.5%，與芽孢桿菌屬其他菌株的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，結(jié)合菌株形態(tài)觀察確定KN1是蘇云金芽孢桿菌。

3討論與結(jié)論

生物防治以其安全、高效和無污染的特點(diǎn)越來越受到重視，是根結(jié)線蟲未來防控策略中的主要方向之一。芽孢桿菌是自然界中廣泛存在的一類細(xì)菌，種類繁多，遺傳類型多樣，對(duì)多種植物病原真菌、細(xì)菌和線蟲具有拮抗活性，營養(yǎng)要求相對(duì)簡單，很容易存活、定殖，以其為主劑開發(fā)的生防制劑具有加工制作簡單、使用方便和耐貯存等優(yōu)點(diǎn)，是最為理想的生防菌。本研究溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，生防菌KN1對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲具有明顯的防治效果，線蟲防效均達(dá)40%以上，且對(duì)黃瓜植株、根系都有明顯的促生長作用。生防菌KN1蘸根對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲的防效略低于單獨(dú)使用10%噻唑磷顆粒劑土壤處理防治效果，兩者配合使用對(duì)線蟲的效果最好，線蟲減退率達(dá)到71.5%，防治效果達(dá)到57.27%，具有較好的生防潛力。各處理組植株鮮質(zhì)量、根系干質(zhì)量比CK高，其中鮮質(zhì)量增加21.78～23.88 g，增幅達(dá)到30.12%～33.03%，差異達(dá)到顯著水平，根系干質(zhì)量增加1.75～1.85 g。生防菌KN1蘸根、10%噻唑磷顆粒劑土壤處理及蘸根配合10%噻唑磷顆粒劑土壤處理根系干質(zhì)量分別較對(duì)照增加67.34%、66.95%、70.89%，試驗(yàn)結(jié)果表明菌株KN1具有較強(qiáng)的防治黃瓜根結(jié)線蟲及促生作用。通過對(duì)菌株的16S rDNA序列的測定和分析，鑒定菌株KN1為蘇云金芽孢桿菌。

蘇云金芽孢桿菌由于具有專一性強(qiáng)、對(duì)人畜無害、防治效果好、生物降解無殘毒、所用原料簡單等優(yōu)點(diǎn)，在蟲害防治中發(fā)揮著越來越重要的作用[12]，自20世紀(jì)60年代實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)以來，已成為世界上用途最廣、商業(yè)開發(fā)最成功、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，每年以20%的速度增長[13-14]。盡管目前人們對(duì)蘇云金芽孢桿菌的殺線機(jī)理還不十分清楚，但隨著新的殺線蟲Bt及其晶體蛋白的發(fā)現(xiàn)，在晶體蛋白的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制以及Bt制劑的應(yīng)用研究等方面還是取得了長足的進(jìn)展。本研究中的蘇云金芽孢桿菌KN1具有較好的防治黃瓜根結(jié)線蟲功能及促生作用，具有較好的生防應(yīng)用前景。KN1的發(fā)酵工藝及制劑配方有待于進(jìn)一步優(yōu)化，將對(duì)菌株KN1的工業(yè)化生產(chǎn)和田間大規(guī)模防治根結(jié)線蟲病害奠定基礎(chǔ)。

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