郝東利++楊順瑛++黃亞楠++蘇彥華

摘要：在生理?xiàng)l件下，植物銨的吸收主要由定位于細(xì)胞膜上的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ammonium transporter，AMT）介導(dǎo)完成，研究模式植物擬南芥AMT的功能特性及調(diào)控機(jī)制對(duì)于解析植物的銨吸收過程具有重要意義。本研究克隆了擬南芥AtAMT1.3并將其在蛙卵異源系統(tǒng)中表達(dá)，電生理結(jié)果表明，AtAMT1.3 是一個(gè)典型的對(duì)銨有高度選擇性、高親和的銨吸收系統(tǒng)[Km =（25.5 ± 3.2） μmmol/L]。同時(shí)，AtAMT1.3也能介導(dǎo)銨的同系物甲基銨的吸收[Km =（3.3±0.2） mmmol/L]，對(duì)銨和甲基銨的吸收具有濃度依賴性和電壓依賴性。 AtAMT1.3的銨轉(zhuǎn)運(yùn)能力不受pH值調(diào)控，它的轉(zhuǎn)運(yùn)底物是NH4+，運(yùn)輸機(jī)制是NH4+單向運(yùn)輸。

關(guān)鍵詞：擬南芥；銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtAMT1.3；介導(dǎo)；電生理；功能特征；銨吸收系統(tǒng)；運(yùn)輸機(jī)制

中圖分類號(hào)： S184；Q946.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0036-05

銨態(tài)氮是植物能夠直接吸收的重要無機(jī)氮素形態(tài)。模式植物擬南芥是一種喜銨植物，在相同濃度供應(yīng)下，銨態(tài)氮的吸收速率高達(dá)硝態(tài)氮的20倍[1]，植物對(duì)銨的吸收主要是由銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AMT）介導(dǎo)的[2-4]。擬南芥基因組中一共有6個(gè)AMT，即AtAMT1.1、AtAMT1.2、AtAMT1.3、AtAMT1.4、AtAMT1.5、AtAMT2[5]。除了AtAMT1.4 專一地在花粉和花粉管中表達(dá)外[6]，其他5個(gè)AMT在根部均有表達(dá)[5，7]。擬南芥突變體試驗(yàn)證明，3個(gè)AtAMT1（AtAMT1.1、AtAMT1.2、AtAMT1.3）貢獻(xiàn)了約90%的銨吸收，其中AtAMT1.1和AtAMT1.3各貢獻(xiàn)了約30%[3，5]，AtAMT1.2貢獻(xiàn)率略?。?8%～26%）[5]。AtAMTS 通過時(shí)空定位以及對(duì)銨親和力的差異來滿足擬南芥生長合適的氮素需要[5]。簡單來說，AtAMT1.1、AtAMT1.3 和AtAMT1.5主要定位于表皮細(xì)胞，其對(duì)銨的親和力很強(qiáng)，三者負(fù)責(zé)將銨從土壤溶液中吸收到根內(nèi)并通過共質(zhì)體途徑運(yùn)輸；而AtAMT1.2主要定位于內(nèi)皮層，且對(duì)銨的親和力相對(duì)較低，通過質(zhì)外體途徑運(yùn)輸?shù)匿@受阻于凱氏帶，此時(shí)AtAMT1.2將其運(yùn)進(jìn)細(xì)胞，進(jìn)入共質(zhì)體途徑，最終完成同化或木質(zhì)部的輸送。由于植物體的復(fù)雜，將單個(gè)銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在異源系統(tǒng)中表達(dá)更有利于研究其轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控機(jī)制。酵母和蛙卵是2種常用的表達(dá)系統(tǒng)，酵母銨吸收缺失突變體31019b 不能在 <5 mmol/L NH4+作為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長[8-9]，轉(zhuǎn)入任意一個(gè)AtAMT1 均能使其恢復(fù)生長，再次證實(shí)了它們直接吸銨的功能[5-6，10-11]。蛙卵系統(tǒng)除了能夠驗(yàn)證其吸銨功能外，還有一個(gè)重要的作用就是可以用來解析其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理。雖然植物AMT1之間同源性很高，但是其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理卻大不相同[12]，目前對(duì)于AtAMT1.3的蛙卵電生理功能特征研究尚缺少。本試驗(yàn)克隆了AtAMT1.3并將其在蛙卵系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，通過電生理技術(shù)研究其離子選擇性，對(duì)銨及其同系物甲基銨的親和性、pH值響應(yīng)，初步闡明了AtAMT1.3的運(yùn)輸機(jī)制及功能特征。

1材料與方法

1.1材料

擬南芥（Arabidopsis）、大腸桿菌 DH5α和蛙卵表達(dá)載體 pCI 由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，非洲爪蟾由筆者所在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)；PCR擴(kuò)增高保真酶PrimeSTAR購自TaKaRa 公司；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ和XbaⅠ購自 NEB公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；膠原酶A 購自 Roche 公司；電生理用試劑購自Ameresco 公司；雙電極電壓鉗設(shè)備購自Axon公司。放大器型號(hào)為pClamp 900A，數(shù)模轉(zhuǎn)換型號(hào)為Digidata 1440，質(zhì)粒注射儀器型號(hào)為 Nanoliter 2000。

1.2AtAMT1.3開放閱讀框的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建

取凍存的擬南芥樣品約100 mg，液氮研磨，根據(jù)說明書提取RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA第1鏈，AtAMT1.3序列登錄號(hào)為At3g24300.1。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：P1，5′-GTCGAATTCATGTCAGGAGCAATAACATGC-3′；P2，5′-GTCTCTAGATTAAACGCGAGGAGGAGTAGC-3′。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1.67 min，24個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。割膠回收，將產(chǎn)物“3′-”端加A尾后連到 PMD19-T vector，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，陽性克隆送往華大基因科技有限公司測(cè)序。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ將測(cè)序正確地克隆切下來，通過T4連接酶連入蛙卵表達(dá)載體pCI。

1.3注射蛙卵及電生理檢測(cè)

首先，將蛙卵從非洲爪蟾中取出，用 1 mg/mL 膠原酶A 消解1.5～2.0 h，然后挑選健康的單個(gè)蛙卵保存于ND96溶液中，其中ND96溶液成分包括96 mmol/L NaCl、2 mmol/L KCl、1.8 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L HEPES（用NaOH調(diào)pH值至7.4）。將59.8 nL的質(zhì)粒pCI-OsAMT1.3注射進(jìn)入健康的蛙卵，同等體積的無菌水注射進(jìn)入蛙卵，作為對(duì)照。將蛙卵置于ND96溶液（2.5 mmol/L丙酮酸鈉）中，19 ℃ 培養(yǎng)3 d，檢測(cè)。蛙卵鉗置于-70 mV中，利用連續(xù)ramp記錄。膜電位施加程序的電壓為-140～20 mV，與之前的報(bào)道一樣，注射水的蛙卵對(duì)1 mmol/L NH4+ 或 10 mmol/L MeA+ 不敏感[12]。電生理用基本溶液成分包括100 mmol/L NaCl、2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2、4 mmol/L Tris （用MES調(diào)pH值至7.4），NH4Cl或者M(jìn)eACl 根據(jù)圖表的指示添加。在做離子選擇性試驗(yàn)時(shí)，基本溶液中的 NaCl 換成相同濃度的CholineCl。

2結(jié)果與分析

2.1AtAMT1.3-pCI載體的構(gòu)建

以擬南芥cDNA為模板，以 P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長度為1 497 bp 目的片段（圖1），割膠回收，連入 PMD19-T vector 載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、測(cè)序得到正確的AtAMT1.3-PMD19-T，用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切 AtAMT1.3-PMD19-T和 pCI，割膠回收AtAMT1.3片段和pCI大片段，通過T4 連接酶連接目的片段和大載體片段，轉(zhuǎn)化后篩選獲得陽性質(zhì)粒AtAMT1.3-pCI，酶切驗(yàn)證正確后濃度濃縮至>1 μg/μL，備用 （圖2），AtAMT1.3-pCI 質(zhì)粒構(gòu)成見圖3。

2.2AtAMT1.3 的氨基酸序列分析

氨基酸序列分析表明，AtAMT1.3 在進(jìn)化上與AtAMT1.5親緣關(guān)系最近，AtAMT1.1次之 （圖4）。它們都屬于 AMT-1亞家族，其中AtAMT1.3 與 AtAMT1.2之間的親緣關(guān)系在該亞家族內(nèi)部最遠(yuǎn)（圖4）?；?AtAMT1.1 和 AtAMT1.2 已較

為明了的功能特征[11，13-15]進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，AtAMT1.3在功能特征方面的表現(xiàn)與 AtAMT1.1相近，而與 AtAMT1.2 差異較大。

2.3AtAMT1.3的離子選擇性

在-70 mV 下添加 1 mmol/L堿性陽離子Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+入電生理基本溶液，對(duì)AtAMT1.3介導(dǎo)的電流沒有明顯影響，而用 1 mmol/L NH4+ 灌流能產(chǎn)生大幅內(nèi)向的電流（圖5-a），說明 AtAMT1.3是一個(gè)高度選擇性的銨吸收系統(tǒng)。這種高度銨的選擇性在整個(gè)電壓區(qū)間內(nèi)（-140 ～20 mV）皆是如此（圖5-b），說明 AtAMT1.3 對(duì)銨吸收的高度選擇性是不依賴于膜電位的。

2.4AtAMT1.3的銨濃度響應(yīng)

在-70 mV 下，AtAMT1.3 介導(dǎo)的內(nèi)向銨電流隨著銨濃度的增加而增加，在<400 μmol/L 的銨濃度下，電流急劇增大；而在1 000 μmol/L 下，接近飽和，說明AtAMT1.3介導(dǎo)的銨吸收具有濃度依賴性（圖6-a）；AtAMT1.3介導(dǎo)的內(nèi)向銨電流睡著膜電位的增加而增加，說明AtAMT1.3的銨吸收具

有電壓依賴性（圖6-b）。通過米氏方程擬合得到AtAMT1.3 介導(dǎo)的銨吸收在 1 mmol/L左右達(dá)到飽和（圖6-c）。在 -140 mV 下，Km值（達(dá)到1/2最大吸收速率時(shí)的銨濃度）為（18.1±2.8） μmol/L；在-130 mV下，Km值為（21.4±3.01） μmol/L；在-120 mV下，Km值為（25.5±3.2） μmol/L；在-110 mV下，Km值為（28.2±3.5） μmol/L；在-100 mV下，Km值為（35.0±3.5） μmol/L；在-90 mV下，Km值為（44.6±4.0） μmol/L；在-80 mV下，Km值為（57.8±5.2） μmol/L，由此可見Km值具有電壓依賴性，即膜電位越正，Km值越大，說明銨是以離子的形態(tài)進(jìn)入細(xì)胞膜的（圖6-d）。假設(shè)在膜內(nèi)有1個(gè)NH4+的結(jié)合位點(diǎn)，則這個(gè)位點(diǎn)應(yīng)位于整個(gè)膜電場(chǎng)52%的位置。

2.5AtAMT1.3的甲基銨濃度響應(yīng)

甲基銨是銨的同系物，廣泛應(yīng)用于AMT的功能研究。在-70 mV 下，AtAMT1.3 介導(dǎo)的內(nèi)向甲基銨電流也具有濃度依賴性，即隨著甲基銨濃度的增加而增加，在銨濃度<7.5 mmol/L 下，電流急劇增大；而在胺濃度為10 mmol/L 下，電流接近飽和（圖7-a）。AtAMT1.3介導(dǎo)的內(nèi)向甲基銨具有電壓依賴性，即膜電位越負(fù)，電流越大（圖7-b）。通過米氏方程擬合得到甲基銨親和力常數(shù)Km值在毫摩爾級(jí)：在 -140 mV 下，Km =（2.5±0.1） mmol/L；在-130 mV下，Km =（2.9±0.1） mmol/L；在-120 mV下，Km=（3.3±0.2） mmol/L；在-110 mV下，Km=（3.8±0.2） mmol/L；在-100 mV下，Km=（4.4±0.2） mmol/L；在-90 mV下，Km=（5.1±0.3） mmol/L；在-80 mV下，Km=（5.7±0.4） mmol/L。Km值具有電壓依賴性，即膜電位越正，Km值越大（圖7-c），說明甲基銨是以離子的形態(tài)進(jìn)入細(xì)胞膜的。假設(shè)在膜內(nèi)有1個(gè)MeA+的結(jié)合位點(diǎn)的話，則這個(gè)位點(diǎn)應(yīng)位于整個(gè)膜電場(chǎng)34%的位置。

2.6AtAMT1.3的pH值響應(yīng)

在-70 mV 下，AtAMT1.3介導(dǎo)的銨電流不受外界pH值調(diào)控，即酸性條件和接近中性的pH值對(duì)銨電流基本沒有影響（圖8-a）。在不同膜電位下，AtAMT1.3介導(dǎo)的銨電流皆不受pH值調(diào)控（圖8-b、圖8-c）。

3結(jié)論與討論

在同一氮素水平供應(yīng)下，擬南芥對(duì)銨的吸收速率是硝的20倍[1]，說明銨態(tài)氮對(duì)其生長極其重要，植物的銨吸收是由AMT介導(dǎo)完成的[2-4]。AtAMT1.3雖然貢獻(xiàn)于根部的銨吸收，但是其功能特征如對(duì)銨吸收專一與否、對(duì)膜電位的響應(yīng)、不同電壓下的親和力、運(yùn)輸機(jī)理等還不清楚。本研究結(jié)果表明，AtAMT1.3 是一個(gè)典型的高度選擇性的、高親和銨吸收系統(tǒng) （圖5、圖6），其 Km 值為25 μmol/L，與AtAMT1.1 的Km 值很接近[13]，但與AtAMT1.2差距很大[11]。AtAMT1.3與AtAMT1.1親緣性近，而與AtAMT1.2遠(yuǎn)（圖4），再根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能的原理可知，這種Km 值的差異反映了AtAMT1.3與AtAMT1.1的相似性。 AtAMT1.3不僅能通透NH4+，也能通透NH4+的同系物MeA+，但其對(duì)MeA+的通透性要低，親和力降低了約100倍（圖7），這與大多數(shù)報(bào)道的AMT-1亞家族的銨轉(zhuǎn)運(yùn)類似[11，16-17]。AMT既能通透NH4+、又能通透MeA+的種特性有利于對(duì)AMT功能特征的研究，如在酵母表達(dá)系統(tǒng)中，通過14C標(biāo)記的MeA來研究AMT的吸收以及親和特征[18-19]。

盡管AMTs在結(jié)構(gòu)上同源性很高，但其轉(zhuǎn)運(yùn)底物和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理卻大不相同[12]，甚至對(duì)相同的AMT提出不同的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。Khademi等通過解析大腸桿菌EcAmtB晶體結(jié)構(gòu)提出該蛋白結(jié)合的是NH4+，但是最終運(yùn)輸?shù)氖荖H3[20]。因?yàn)橛涗浀玫搅穗x子態(tài)的NH4+內(nèi)流，這個(gè)NH3運(yùn)輸?shù)挠^點(diǎn)受到挑戰(zhàn)[21]。對(duì)于植物AMT，研究者們根據(jù)一系列的試驗(yàn)證據(jù)提出了4種運(yùn)輸機(jī)制：如番茄LeAMT1.1、水稻OsAMT1.1的運(yùn)輸機(jī)制是NH4+單向運(yùn)輸[16-17]；擬南芥AtAMT1.2、小麥TaAMT1.1的運(yùn)輸機(jī)制是NH3/H+共運(yùn)[22-23]；菜用大豆的PvAMT1.1運(yùn)輸機(jī)制是 NH4+/H+同向運(yùn)輸[24]；擬南芥AtAMT2的運(yùn)輸機(jī)制是NH3運(yùn)輸[25]。本研究解析出AtAMT1.3的運(yùn)輸機(jī)制是NH4+單向運(yùn)輸，原因如下：（1）酵母功能互補(bǔ)證明了AtAMT1.3 具有吸銨功能[5]，電生理記錄得到了NH4+產(chǎn)生的電流（圖3），說明進(jìn)入蛙卵的銨形態(tài)是離子態(tài)的（因分子進(jìn)入不會(huì)產(chǎn)生電流），排除了NH3運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制。（2）AtAMT1.3介導(dǎo)的銨內(nèi)流不受pH值調(diào)控（圖8），排除了NH4+/H+同向運(yùn)輸和NH3/H+共運(yùn)2種可能，因?yàn)槿绻沁@2種機(jī)制的話，外界pH值改變（pH 值由5.4 轉(zhuǎn)變到 74）使得溶液中H+的濃度減小100倍，即其中的一個(gè)底物量急劇減少，勢(shì)必會(huì)對(duì)其運(yùn)輸產(chǎn)生巨大的影響。事實(shí)上，AtAMT1.3介導(dǎo)的銨內(nèi)流不受外界pH影響（圖8），那么AtAMT1.3的銨運(yùn)輸機(jī)理只可能是NH4+單向運(yùn)輸。（3）吸收動(dòng)力學(xué)擬合得到AtAMT1.3的希爾吸收等于1，說明只有1種底物（圖6）。通過擬合Km值對(duì)電壓的依賴性，得到這個(gè)底物的結(jié)合位點(diǎn)位于整個(gè)膜電場(chǎng)52%的位置；進(jìn)一步說明AtAMT1.3的運(yùn)輸機(jī)制是 NH4+單向運(yùn)輸。AtAMT1.3運(yùn)輸機(jī)制與AtAMT1.1相同，而與AtAMT1.2不同；在同源性上前兩者之間也比AtAMT1.3與AtAMT1.2之間近 （圖4）。由此推測(cè)，決定AtAMT1.3與AtAMT1.2 運(yùn)輸機(jī)制不同的很可能是與AtAMT1.1相同、而與AtAMT1.2差異較大的氨基酸區(qū)域，這個(gè)猜想需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

擬南芥中AtAMT1.3缺失突變體引起的側(cè)根分化差異表型，只能由AtAMT1.3 補(bǔ)回，而不能由AtAMT1.1補(bǔ)回[26]。AtAMT1.3在基本功能特征上與AtAMT1.1很相似，如對(duì)銨的高度選擇性和很高的親和力，NH4+作為轉(zhuǎn)運(yùn)底物，不受pH值調(diào)控 （圖5至圖7）。功能如此相似，表型卻不能被相似的AtAMT1.1恢復(fù)，進(jìn)一步說明AtAMT1.3 在植物體內(nèi)除了養(yǎng)分吸收外還扮演其他的角色，如影響側(cè)根分化。

總體來說，本試驗(yàn)通過研究擬南芥的AtAMT1.3電生理功能特征，證明該蛋白是典型的高度選擇性的高親和銨吸收系統(tǒng)，其對(duì)銨的親和力在微摩爾級(jí)，而對(duì)甲基銨的親和力至少低了10倍。AtAMT1.3介導(dǎo)的銨內(nèi)流不受外界pH值調(diào)控，其運(yùn)輸機(jī)制是NH4+單向運(yùn)輸。

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