付世英++劉夏燕

摘要：將擬南芥ERA-1基因除信號肽外的剩余編碼序列克隆到原核表達載體pET28a上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 （DE3）中表達，發(fā)現(xiàn)表達的目的蛋白位于包涵體中，大量表達目的蛋白并用鎳柱親和層析法進行純化，獲得足量的重組蛋白后將其作為抗原免疫家兔，獲得抗血清。用重組蛋白親和純化抗血清中的ERA-1多克隆抗體。利用野生型擬南芥、ERA-1敲除突變系和ERA-1過表達系的葉片總蛋白進行免疫印跡試驗，檢測ERA-1多克隆抗體的特異性，發(fā)現(xiàn)純化后的ERA-1多克隆抗體（1 ∶1 000體積比稀釋）能特異地檢測到擬南芥中的ERA-1蛋白。本試驗成功制備了ERA-1蛋白的多克隆抗體，可以用于今后對ERA-1基因功能的研究。

關(guān)鍵詞：擬南芥ERA-1；原核表達；蛋白純化；抗血清；多克隆抗體制備

中圖分類號： Q946.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0033-03

ERA（Eecherichia coli ras-like protein，簡稱ERA）基因最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，因其蛋白序列與真核生物的大鼠肉瘤（Ras）蛋白相似度高，所以命名為ERA[1]。但隨后的研究表明，ERA與Ras蛋白序列相似性主要集中于N端的GTP酶結(jié)構(gòu)域，而其C端與包括Ras在內(nèi)的其他小GTP酶不具有同源性，因而把它列為一類新的小GTP酶。對大腸桿菌ERA功能的研究表明，該基因是大腸桿菌生存繁殖所必需的[2]。大腸桿菌ERA表達量降低突變體表現(xiàn)為細胞分裂異常、細胞增長呈絲狀、擬核數(shù)目增多，表明ERA在染色體分離后，胞質(zhì)分裂前發(fā)揮重要作用[3-4]。另有研究表明，ERA的C端能與核糖體16S RNA結(jié)合，對核糖體小亞基的組裝成熟起重要作用[5-6]。細菌的ERA蛋白序列具有高度保守性，不同種類細菌的ERA蛋白可以互補大腸桿菌ERA的功能[7-8]。

真核生物的ERA基因起源于原核生物，真核生物的ERA蛋白序列與原核生物具有高度相似性，大多分布于線粒體或葉綠體中[9]。人類ERA同源蛋白ERAL1定位于線粒體[10]，能與線粒體12S rRNA結(jié)合，參與核糖體小亞基的組裝[11]。ERAL1功能缺陷細胞從G1期進入到S期受阻，進而引發(fā)細胞凋亡[12]。擬南芥ERA家族有2個成員ERA-1及ERA-2，亞細胞定位研究表明ERA-1定位于葉綠體，而ERA-2定位于線粒體[13]。目前植物中ERA的功能尚未見報道，為了方便研究ERA-1在擬南芥葉綠體中的功能，將擬南芥ERA-1基因在大腸桿菌中表達，獲得重組ERA-1蛋白經(jīng)過純化后免疫家兔制備多克隆抗體。ERA-1多克隆抗體的成功制備，為后續(xù)研究ERA-1的生物學功能提供了條件。

1材料與方法

1.1材料

野生型擬南芥、era-1-1純合突變體、ERA-1過表達株系（ERA-1OE-1、ERA-1OE-13、ERA-1OE-4、ERA-1OE-5）均為Columbia-0生態(tài)型背景，由筆者所在實驗室保存。

試驗中使用的限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等各種酶類均購自TaKaRa。瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒等購自天根生化科技（北京）有限公司。His標簽蛋白純化柱填料Ni瓊脂糖凝膠6 Fast Flow購自GE Healthcare Life Science。完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；HRP標記的羊抗兔抗體G&R購自北京康為世紀生物科技有限公司；蛋白免疫印跡化學發(fā)光試劑盒購自Bio-Rad。其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

pBluescript-ERA-1為包含ERA-1基因編碼區(qū)全長序列的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒及原核表達載體pET28a、大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞和BL21（DE3）菌株均由筆者所在實驗室保存。

1.2方法

1.2.1原核表達載體的構(gòu)建以質(zhì)粒pBluescript-ERA-1為模板，設計引物F1、R1，PCR擴增ERA-1除去葉綠體定位信號肽序列的剩余編碼區(qū)序列?；厥盏腜CR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ酶切后連入pET28a表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10。挑選陽性克隆提質(zhì)粒，用BamHⅠ酶切鑒定是否有目的片段插入，再用HindⅢ酶切鑒定插入方向。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送去測序，測序驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-ERA-1。所用擴增引物序列為：F1，5′-CATGGATCCAAATCACATCTCCAGGCGCAC-3′；R1，5′-CATGGATCCCTACATAGCTCGGATCTGTCC-3′（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點）。

1.2.2重組蛋白的原核表達分析將重組質(zhì)粒pET28a-ERA-1轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）宿主菌，挑取陽性單克隆，接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，次日按體積比1 ∶100接種至25 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，200 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)至D600 nm達到0.5～1.0，取1 mL誘導前菌液，離心，棄上清，沉淀重懸于500 μL裂解液[50 mmol/L NaH2PO4（pH值8.0）、300 mmol/L NaCl]中，留作誘導前對照。然后加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，簡稱IPTG，終濃度1 mmol/L），繼續(xù)37 ℃搖培4 h，搖培結(jié)束后取出 1 mL 菌液，處理同誘導前的1 mL菌液。將剩余的誘導后的菌液離心，沉淀重懸于11.5 mL裂解緩沖液中，冰浴，超聲波破碎，結(jié)束后離心，收集上清，將沉淀部分溶解在11.5 mL裂解緩沖液中。分別取5 μL誘導前菌體總蛋白、誘導后菌體總蛋白、誘導破菌后上清蛋白、誘導破菌后沉淀蛋白樣品液進行10% SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白的表達形式。

1.2.3重組蛋白的大量表達和親和純化挑取含重組質(zhì)粒pET28a-ERA-1的陽性克隆，按照“1.2.2”節(jié)中的方法搖培、誘導，獲得1 L表達重組蛋白的菌液；破菌，離心，將獲得的沉淀用含有8 mol/L尿素的裂解緩沖液溶解，離心，收集上清液。上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后與1 mL Ni瓊脂糖凝膠6 Fast Flow填料孵育30 min，然后轉(zhuǎn)入層析柱中；用 20 mmol/L 咪唑洗脫液洗滌雜蛋白，然后依次用2 mL 咪唑液（100、200、400 mmol/L）洗脫重組蛋白，每個濃度的咪唑洗脫液分2管收集（1支管1 mL）。將不同濃度咪唑液洗脫的蛋白及025 mg/mL牛血清蛋白（BSA）進行SDS-PAGE電泳，以檢測重組蛋白的純度和濃度。

1.2.4抗血清的制備及驗證將純化后的ERA-1重組蛋白測定濃度，作為抗原免疫家兔。首免按200 μg/只，加入等體積弗氏完全佐劑渦旋混勻后，背部多點皮下注射[14]。之后每2周進行1次加強免疫，蛋白用量按100 μg/只，佐劑使用弗氏不完全佐劑。3次加強免疫之后，心臟采血并收集血清。

將純化后的重組蛋白進行梯度稀釋，然后分別取100、10、1 ng進行SDS-PAGE電泳。蛋白樣品經(jīng)半干法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉液（5%脫脂牛奶/TBST）室溫封閉1 h后，加入經(jīng)封閉液稀釋的抗血清（1 ∶5 000）室溫孵育1 h；用TBST[20 mmol/L Tris-HCl（pH值7.5）、150 mmol/L NaCl、0.1% Tween 20]洗滌3次；用HRP標記的羊抗兔IgG（1 ∶10 000 稀釋）室溫孵育1 h后，再用TBST洗滌3次；ECL顯色處理，化學發(fā)光儀成像[15]。

1.2.5多克隆抗體的純化將1 mg純化后的重組蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，番紅染色。然后將重組蛋白條帶從NC膜上切下，用100 mmol/L甘氨酸/HCl（pH值2.5）洗膜 5 min，然后用TBS[20 mmol/L Tris（pH值7.4）、500 mmol/L NaCl，005% Tween 20]洗2次，每次2 min。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，取5 mL抗血清加入到5 mL TBS中，與膜在搖床上4 ℃過夜孵育。保留上清，將膜先用TBS洗滌2次，再用PBS[20 mmol/L磷酸鈉（pH值7.2），150 mmol/L NaCl]洗滌2次。洗脫抗體時加入1 mL甘氨酸，孵育10 min，然后將洗脫液移入新管中并加入100 μL Tris（pH值8.0）使pH值調(diào)到7.0。

1.2.6植物葉片總蛋白中ERA-1的檢測將擬南芥種子點種于泥炭營養(yǎng)土上，4 ℃放置2 d誘導種子萌發(fā)，然后在 22 ℃ 持續(xù)光照下培養(yǎng)。

當植物生長到2周大時，每株植物取2張真葉于1.5 mL離心管中，記錄管中葉片的質(zhì)量，液氮中研磨。根據(jù)管中葉片的質(zhì)量，加入對應體積的蛋白抽提液[0.125 mg/L Tris（pH值6.8）、20%葡萄糖、4% SDS、1% β-巰基乙醇]，使得蛋白抽提液終濃度為0.1 mg/μL，充分研磨成勻漿；最后將樣品于 65 ℃ 加熱2 h，離心，取上清。將上清及10 ng重組蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，用“1.2.5”節(jié)中純化得到的多克隆抗體（1 ∶1000稀釋）進行蛋白免疫印跡檢測。

2結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒pET28a-ERA-1的構(gòu)建

陽性質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果如圖1所示，用BamH Ⅰ酶切鑒定，獲得的質(zhì)粒骨架及插入片段大小符合預期（1.16、5.3 kb）；用Hind Ⅲ鑒定是否為正向插入（插入片段和pET28a質(zhì)粒上各有1個Hind Ⅲ酶切位點，若正向插入兩者距離約為1.08 kb），酶切結(jié)果符合正向插入。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送去測序，所測得的序列與預期完全一致。

2.2目的蛋白在大腸桿菌中的表達分析

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-ERA-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時加IPTG誘導，收集誘導前及誘導后的菌體經(jīng)10% SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖2中1、2泳道所示，與誘導前相比，誘導后的菌液在50 ku附近多出明顯的蛋白條帶，符合預期，說明目的蛋白已成功表達。在進行大量表達和純化之前，須對目的蛋白的可溶性進行分析，因此將誘導后的大腸桿菌細胞經(jīng)超聲破碎，分離上清液和沉淀，并將沉淀溶于裂解液中，進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖2中3、4泳道所示，所表達的重組蛋白質(zhì)幾乎全部在沉淀中，以包涵體的形式存在。

2.3Hisx6-ERA-1蛋白的大量表達與親和純化

在獲知重組蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在后，開始大量誘導表達重組蛋白，并將獲得的包涵體溶解于含 8 mol/L 尿素的裂解液中，通過鎳瓊脂糖親和柱分離，再用不同濃度的咪唑液洗脫。SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示，第1支管100 mmol/L咪唑洗脫液（泳道4）中的目的蛋白濃度最高，用0.25 mg/mL BSA對該管洗脫液中的蛋白濃度進行粗定量，結(jié)合軟件分析其蛋白濃度大于1 mg/mL，可用于后續(xù)免疫家兔試驗。

2.4抗血清的制備與檢測

利用純化得到的Hisx6-ERA-1重組蛋白免疫家兔，將獲得的抗血清作免疫印跡試驗，分析其結(jié)合抗原有效性。結(jié)果表明，Hisx6-ERA-1抗血清1 ∶5 000稀釋后，能夠清晰地檢測到10 ng的Hisx6-ERA-1重組蛋白（圖4）。

2.5免疫印跡法檢測植物葉片總蛋白中的ERA-1

用ChloroP預測表明，具有427個氨基酸殘基的ERA-1蛋白的前39個氨基酸殘基為葉綠體定位信號肽，切去前39個信號肽的成熟野生型ERA-1蛋白的分子量約為 42.88 ku，而pET28a-ERA-1載體表達的加上Hisx6標簽的重組ERA-1蛋白大小約為47.9 ku。提取WT、era-1-1純合突變體及ERA-1過表達株系ERA-1OE-1、ERA-1OE-13、ERA-1OE-4、ERA-1OE-5的葉片總蛋白，并用10 ng的Hisx6-ERA-1重組蛋白抗原作為陽性對照，與經(jīng)重組蛋白Hisx6-ERA-1親和純化過的多克隆抗體（1 ∶1 000稀釋）進行免疫印跡試驗。結(jié)果如圖5所示，野生型、過表達株系在預期分子量大?。?2.88 ku）位置附近出現(xiàn)了2條帶，而era-1-1純合突變體沒有對應條帶。野生型、過表達株系都出現(xiàn)2條特異性條帶，說明ERA-1在植物體內(nèi)可能有2種不同的存在形式。本試驗所制備的多克隆抗體能清晰地檢測到植物葉片總蛋白中的ERA-1，并在負對照era-1-1突變體中無特異性帶的產(chǎn)生，可滿足后續(xù)試驗的需求。

3結(jié)論與討論

ERA基因在原核生物及真核生物中廣泛存在，并具有很高的保守性。對大腸桿菌及人的ERA的研究都表明，ERA在核糖體小亞基的成熟過程中起重要作用，參與細胞周期調(diào)控，然而ERA蛋白在植物中的功能卻鮮有報道。本試驗通過原核表達重組蛋白，抗體制備和抗體的親和純化成功獲得了擬南芥ERA-1蛋白的多克隆抗體，為后續(xù)深入研究植物 ERA-1的生物學功能提供了條件。

參考文獻：

[1]Ahnn J，March P，Takiff H，et al. A GTP-binding protein of Escherichia coli has homology to yeast RAS proteins[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1986，83（23）：8849-8853.

[2]Chen X，Chen S，Powell B，et al. Purification，characterization and crystallization of ERA，an essential GTPase from Escherichia coli[J]. FEBS Letters，1999，445（2/3）：425-430.

[3]Britton R，Powell B，Dasgupta S，et al. Cell cycle arrest in Era GTPase mutants：a potential growth rate-regulated checkpoint in Escherichia coli[J]. Molecular Microbiology，1998，27（4）：739-750.

[4]Britton R，Powell B，Court D，et al. Characterization of mutations affecting the Escherichia coli essential GTPase era that suppress two temperature-sensitive dnaG alleles[J]. Journal of Bacteriology，1997，179（14）：4575-4582.

[5]Sayed A，Matsuyama S，Inouye M. Era，an essential Escherichia coli small G-protein，binds to the 30S ribosomal subunit[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1999，264（1）：51-54.

[6]Tu C，Zhou X，Tarasov S，et al. The era GTPase recognizes the GAUCACCUCC sequence and binds helix 45 near the 3' end of 16S rRNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（25）：10156-10161.

[7]Zuber M，Hoover T，Dertzbaugh M，et al. A francisella tularensis DNA clone complements escherichia coli defective for the production of era，an essential ras-like GTP-binding protein[J]. Gene，1997，189（1）：31-34.

[8]Pillutla R，Sharer J，Gulati P，et al. Cross-species complementation of the indispensable Escherichia coli era gene highlights amino acid regions essential for activity[J]. Journal of Bacteriology，1995，177（8）：2194-2196.

[9]Suwastika I N，Denawa M，Hata A，et al. Energy from the Sun[M]. Netherlands：Springer Netherlands，2008：1137-1140.

[10]Dennerlein S，Rozanska A，Wydro M，et al. Human ERAL1 is a mitochondrial RNA chaperone involved in the assembly of the 28S small mitochondrial ribosomal subunit[J]. The Biochemical Journal，2010，430（3）：551-558.

[11]Uchiumi T，Ohgaki K，Yagi M，et al. ERAL1 is associated with mitochondrial ribosome and elimination of ERAL1 leads to mitochondrial dysfunction and growth retardation[J]. Nucleic Acids Research，2010，38（16）：5554-5568.

[12]Akiyama T，Gohda J，Shibata S，et al. Mammalian homologue of E. coli Ras-like GTPase （ERA） is a possible apoptosis regulator with RNA binding activity[J]. Genes to Cells：Devoted to Molecular & Cellular Mechanisms，2001，6（11）：987-1001.

[13]Suwastika I，Denawa M，Yomogihara S，et al. Evidence for lateral gene transfer （LGT） in the evolution of eubacteria-derived small GTPases in plant organelles[J]. Frontiers in Plant Science，2014，5：678.

[14]李芳，羅軍，許會芬，等. 西農(nóng)薩能羊MAT基因的原核表達及多克隆抗體制備[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2014，42（12）：1-6，12.

[15]Yu F，Park S，Liu X，et al. Suppressor of variegation4，a new var2 suppressor locus，encodes a pioneer protein that is required for chloroplast biogenesis[J]. Molecular Plant，2011，4（2）：229-240.