梁田++楊霞++張勛++肖媛媛++陳新凱++宋佳瑋++盛金良

摘要：對新疆薩福克羊Toll樣受體7基因單核苷酸進行多態(tài)性分析，探索綿羊TLR7基因多態(tài)性與抗病力的關系，為家畜抗病育種提供候選分子標記。采集新疆地區(qū)種羊場薩?？搜蜓?00份，提取DNA，設計擴增引物進行聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態(tài)性（PCR-SSCP）檢測，對突變位點進行測序分析。結果表明，12對擴增引物中，第2、5、6、7對引物擴增產物具有多態(tài)性。其中第2對和第7對引物擴增產物存在錯義突變，第5對和第6對引物擴增產物存在同義突變。經SSCP分析，第2對引物擴增產物表現為3種帶型，第7對引物有2種帶型.經序列比對分析存在A343G、A350G、A1244G的錯義突變，氨基酸改變分別是Lys突變?yōu)镚ln，Asp突變?yōu)镾er，Glu突變?yōu)锳rg，且突變都發(fā)生在胞外區(qū)亮氨酸重復區(qū)內。其中第2對引物的帶型AB是位點A343G和A350G同時發(fā)生突變。位點A343G的突變頻率最高為45.0%，A350G突變頻率12.0%，而A1244G突變頻率為5.8%。檢測的突變可能改變TLR7基因的功能，進而影響其對病源的免疫應答。為進一步的疾病相關的研究奠定基礎，以調查這些研究結果在家畜育種方面的用處。

關鍵詞：Toll樣受體7；多態(tài)性；薩?？搜颍换蛐?/p>

中圖分類號： S826.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0026-04

先天性免疫系統(tǒng)是生物進化過程中1種比較古老而保守的防御體系，是抵御病原微生物感染和有害物質侵害的第一道防線，而廣泛模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR）[1]是先天性免疫系統(tǒng)執(zhí)行識別潛在的病原微生物和非致病性共生菌群，并清除病原微生物的重要受體。PRR包括NK細胞活化受體、清道夫受體、甘露糖受體和Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）。這些受體中，TLRs是最為重要的受體，能夠識別不同病原微生物所攜帶的特異性結構成分，即病原相關分子模式（patho-gen-associated molecular patterns，PAMPs）。在家畜中，已經檢測到10種功能性TLR基因[2]。TLR3、TLR7、TLR8、TLR9能夠識別細胞內的病原體表達的配體。其中TLR7屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，具有與其他TLR家族成員共同的結構特征，其分子結構由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)組成。其存在于多種細胞中，包括漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）、巨噬細胞、T細胞、B細胞等免疫細胞，嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和內皮細胞中也有一定水平的表達[3-5]。另外，在扁桃體、脾、胎盤、骨髓、肺和淋巴結等組織中也有表達[6]。1996年，Hofmann 等證實克隆果蠅Toll樣受體能識別并抑制真菌繁殖[7]。隨后，人們發(fā)現Toll樣受體在天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫中起著重要的作用。TLRs信號轉導途徑主要包括依賴MyD88的信號通路和非依賴MyD88的信號通路。TLR7能夠通過依賴MyD88的信號通路激活免疫細胞，并誘導免疫細胞表達高水平的干擾素、腫瘤壞死因子-α、IL-12 等細胞因子，介導抗病毒免疫。TLR7胞外區(qū)負責識別和接受相應信號，隨后TIR位點招募富含Toll/白介素1受體接頭蛋白分子，啟動下游信號分子，最終殺傷感染的病原體[8-9]。通過TLR7的作用，機體能激發(fā)天然免疫與獲得性免疫，有效地防御來自外部環(huán)境的病原體感染，維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定。

基因多態(tài)性與機體對疾病的遺傳易感性相關。Toll 樣受體在識別病原微生物啟動免疫應答中起重要作用。越來越多數據表明，TLRs單核苷酸多態(tài)性與炎性應答損傷及感染性疾病的遺傳易感性相關，如TLR4 基因Asp299Gly和Thr399Ile SNPs與多種感染性疾病正相關，在動脈粥樣硬化及其相關疾病中則起保護作用[10]。研究表明，當動物面對體外環(huán)境（空氣灰塵較多）和體內環(huán)境（細菌入侵）的變化，會作出適應性反應，由于TLR 配體可能會受到 Toll 樣受體基因單核苷酸多態(tài)性的影響，導致對細菌感染或炎癥性疾病易感性的改變[11]。目前，綿羊TLRs的多態(tài)性研究較少，其與疾病關系還不十分清楚。本研究通過PCR-SSCP分析及其基因突變頻率分析，研究綿羊Toll樣受體7胞外區(qū)基因的多態(tài)性，為今后綿羊育種的標記輔助選擇提供確切的遺傳學證據。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、TEMED、2×Taq PCR MasterMix，均購自上海生工生物工程有限公司；DNA提取試劑盒購自北京天根生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。其他常規(guī)試劑來自于石河子大學動物科技學院病理實驗室。

DYC系列電泳儀、水平電泳槽、垂直電泳槽，均購自北京市六一儀器廠；脫色搖床，購自江蘇省會壇市醫(yī)療儀器廠；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)為美國生產。

1.2試驗動物與樣品采集

分別在新疆維吾爾自治區(qū)昌吉市和瑪納斯縣某種羊場分別隨機采集200、400份薩?？搜蜓簶颖荆妙i靜脈采血法，每只羊采5 mL血液，用肝素鈉采血管帶回實驗室，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3DNA的提取

采血管中的羊血用試劑盒進行DNA提取，-20°保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物的設計與合成

采用文獻報道的12對引物[12]，送上海生工生物工程有限公司合成，擴增片段200～400 bp。

1.5PCR擴增

PCR擴增體系25 μL：上游引物和下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，1×LightScannerMaster 12 μL，超純水9 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性35 s，退火30 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸30 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃ 保存。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6PCR-SSCP分析

1.6.1制備8%非變性聚丙烯酰胺凝膠首先將玻璃板洗凈、擦干，玻璃板的兩邊放上塑料膠條，用夾子固定在架子上，1.5%瓊脂糖封底，防止漏膠。配置8%非變性聚丙烯酰胺凝膠：加入丙稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺體積比為29 ∶1 的30%丙烯酰胺貯備液16 mL，5×TBE 12 mL，ddH2O 32 mL，10%過硫酸銨500 μL，N，N′—二甲基乙二胺（TEMED） 30 μL，混合后將配好的8%凝膠液緩慢倒入兩玻璃板之間，插上梳子，室內聚合2 h后，拔掉梳子，用針管沖洗點樣孔，向電泳槽中加入1×TBE電泳緩沖液。

1.6.2SSCP電泳取3 μL PCR產物，8 μL變性劑（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.025%溴酚藍和0.025%二甲苯青），經98 ℃變性10 min，然后置于冰上10 min，每孔加樣 10 μL，在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳12～16 h，銀染顯帶，并拍照分析。

1.7PCR產物測序

SSCP分析后，選取不同基因型個體，將其進行PCR擴增膠回收，將純化回收的目的片段吸取5 μL于小EP管中，分別加入0.5 μL的T4 DNA Ligase、0.5 μL的 PGEM-T Easy、4 μL 的Buffer，吹打混勻，室溫放置1 h，之后4 ℃孵育過夜。將連接產物轉化到感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆后送上海生工生物工程有限公司測序。

1.8數據統(tǒng)計分析

用DNAMAN （V 5.2.10）將測得的序列與GenBank已登錄的綿羊的TLR7基因序列分別進行比對。使用卡方分析SPSS 13.0軟件進行差異顯著性檢驗，對群體多態(tài)性分布及基因頻率進行統(tǒng)計分析。

2結果與分析

2.1TLR7基因胞外區(qū)多態(tài)性

本研究對TLR7基因胞外區(qū)擴增產物進行SSCP分析，結果發(fā)現，第2對引物擴增的胞外區(qū)產物有3種帶型（圖1-a），第5、6、7對分別具有2種不同帶型（圖1-b、圖1-c、圖1-d）。從表2中可以看出，AA、AB、BB、CC、DD、EE、FF、GG、HH基因型頻率分別是0.55、0.33、0.12、0.13、0.87、0068、0.932、0.942、0.058。對第2對引物帶型進行χ2 適合性檢驗，發(fā)現χ2值差異極顯著，該基因位點在綿羊群體中哈迪-溫伯格平衡處于非平衡狀態(tài)（表2）。

2.2TLR7基因胞外區(qū)的點突變

經測序發(fā)現，綿羊TLR7胞外區(qū)共有5個點突變，包括3個錯義突變和2個同義突變。在343位核苷酸的改變導致了Lys115Glu，350 位核苷酸的改變導致了Asn117Ser，1244位核苷酸的改變導致了Gln415Arg。115位氨基酸的改變使電荷由正變負（表3），415位氨基酸的改變使其帶上正電荷，這3個突變都發(fā)生在胞外區(qū)的亮氨酸重復區(qū)外的區(qū)域。

2.3TLR7基因多態(tài)性頻率分析

根據PCR-SSCP的結果，600只薩?？搜虻腡LR7存在多態(tài)性，其分布情況見表2。其中343位核苷酸突變頻率最高，達45%；其次350位核苷酸突變頻率是12%，864位核苷酸突變頻率是13%，突變頻率最少的是1 244位核苷酸突變，突變頻率是5.8%（表3）。

3討論

本研究發(fā)現TLR7基因胞外區(qū)有5個點突變，包括3個錯義突變和2個同義突變，證明了TLR7基因高度保守。其中突變帶型AB的頻率是33%，是突變帶型中頻率最高的，然后是突變帶型CC（13%）、BB（12%），其他的突變帶型頻率都小于10%。在AB 和BB條帶中都存在343位核苷酸的突變，突變頻率為45%，經檢測分析該基因位點不處于Hardy-Wernberg平衡狀態(tài)，可能由于人工飼養(yǎng)，受育種選擇的影響。

綿羊的TLR7由1 046個氨基酸殘基組成，TLR7 的胞外區(qū)由LRR區(qū)和LRR區(qū)外的基序組成，LRR區(qū)在胞外區(qū)的內部，而LRR區(qū)外的基序形成胞外區(qū)凸表面[13]。這種凸表面可能影響病原相關分子模式（PAMP）與TLR 的結合[14]。本研究發(fā)現的115和415位的氨基酸突變都是在綿羊TLR7 的LRR區(qū)外的基序上，也導致了氨基酸極性和帶電荷量的改變，這種替換極可能會影響TLR7 的結構或功能，從而改變對疾病的易感性。由于同義突變可能通過影響mRNA穩(wěn)定、翻譯和蛋白質的折疊[15-16]影響TLR7 的功能，本研究也分析了同義突變，有研究表明TLR7能夠識別單鏈RNA病毒，包括水泡口腔咽喉病毒和流感病毒[17]。TLR7單核苷酸多態(tài)性與丙型肝炎病毒感染引起的炎癥反應密切相關。研究顯示，TLR7的遺傳變異影響丙型肝炎病毒感染后的免疫反應[18]。同樣的，羊的梅迪維斯納病毒易感性差異可能與TLR7多態(tài)性有關。TLR7也能被自身的RNA活化，引起自身免疫性疾病[19] 。在狼瘡小鼠模型中Toll樣受體7與此病的風險性直接相關[20-21]。研究表明，TLR7的激動劑能增強T細胞免疫和固有免疫，誘導TLR7表達腫瘤凋亡來抗腫瘤[22]。大量研究表明腫瘤細胞表面表達多種 Toll樣受體與腫瘤細胞的生長轉移有關。在這一領域未來的研究需要檢測TLR7基因多態(tài)性與綿羊群病毒感染易感性的關系。

綜上所述，TLR7識別病毒單鏈RNA介導抗病毒免疫應答，在自身免疫性疾病和一些腫瘤的發(fā)生中也有一定的作用，這些均提示TLR7在治療病毒感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤疾病的重要作用。本研究探討綿羊TLR7胞外結構域的區(qū)域的遺傳變異，這些研究結果可以用來進一步探察遺傳易感性羊感染疾病與TLR7基因變異的關系。通過基因圖譜分析估計疾病的危險因素，也可用于育種計劃中增加羊群的天然抵抗力。

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