劉艷紅，李 靜，張 驥，余孝其，李 坤

（四川大學(xué) a.基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心；b.化學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064）

陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革

劉艷紅a，李 靜a，張 驥b，余孝其b，李 坤b

（四川大學(xué) a.基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心；b.化學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064）

通過優(yōu)化細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件，探討脂質(zhì)體與DNA的復(fù)合比例、復(fù)合時間以及轉(zhuǎn)染時間對脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率的影響。實(shí)驗(yàn)采用凝膠阻滯電泳分析脂質(zhì)體完全包裹DNA時二者的復(fù)合比，通過轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白報告基因（pEGFP）研究脂質(zhì)體／pEGFP的復(fù)合比例、復(fù)合時間對細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響。激光掃描共聚焦成像進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)染時間對細(xì)胞攝取DNA量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脂質(zhì)體和DNA的復(fù)合比例為1.25時，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高。轉(zhuǎn)染4 h后，大量DNA被細(xì)胞攝取，此時可以更換新鮮的培養(yǎng)基。

陽離子脂質(zhì)體；基因轉(zhuǎn)染；實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革

“陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染”是四川大學(xué)化學(xué)生物學(xué)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的重要實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)旨在讓學(xué)生了解陽離子脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物的形成過程以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程，訓(xùn)練學(xué)生的基本操作和基本實(shí)驗(yàn)技能，培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)的思維方法和分析解決問題的能力。原有實(shí)驗(yàn)步驟簡單、內(nèi)容單調(diào)。實(shí)驗(yàn)時，學(xué)生只是“照方取藥”，參照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行稀釋、復(fù)合、加樣、記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。整個過程枯燥無味，嚴(yán)重影響了學(xué)生實(shí)驗(yàn)的興趣，挫傷了學(xué)生實(shí)驗(yàn)的積極性。為此，本文結(jié)合最新的科研成果，引入現(xiàn)代化的分析技術(shù)，對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行升級改造。

采用凝膠阻滯電泳和倒置熒光顯微鏡觀察研究脂質(zhì)體和DNA的復(fù)合比例、復(fù)合時間對轉(zhuǎn)染效率的影響。激光掃描共聚焦成像進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)染時間對DNA攝取量的影響。通過對實(shí)驗(yàn)的升級改造，原有的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)升級為綜合性設(shè)計實(shí)驗(yàn)，豐富了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，完善了研究過程，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，極大地激發(fā)了學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣，提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)［1－2］

將商品化陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（life technologies）和質(zhì)粒pUC19按不同的比例（μL∶μg）0.31、0.62、1.25和2.5混合（pUC19的用量為0.2μg），室溫下放置20 min后采用1瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3 不同復(fù)合比例和復(fù)合時間對細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響

Hela細(xì)胞接種于24孔板（細(xì)胞密度為9×104個／孔），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

將Lipofectamine 2000和質(zhì)粒pEGFP－N1按照不同的比例（μL：μg）0.31、0.62、1.25和2.5進(jìn)行復(fù)合（其中pEGFP－N1的量為0.8μg）。復(fù)合的步驟為Lipofectamine 2000和質(zhì)粒分別用Opti－MEM培養(yǎng)基稀釋至50μL，然后將稀釋后的質(zhì)粒滴加至脂質(zhì)體中，室溫下輕輕混勻并靜置20 min。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，吸去24孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，并加入400μL無血清培養(yǎng)基，將脂質(zhì)體／DNA復(fù)合物溶液滴加至24孔板中，培養(yǎng)4 h后，吸去無血清培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基（500μL／孔），將24孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20 h，然后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，并隨機(jī)選取3～6個視野拍照［3－5］。

為了研究不同復(fù)合時間對轉(zhuǎn)染效率的影響，實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體和DNA的復(fù)合比例（μL∶μg）為1.25進(jìn)行復(fù)合，Lipofectamine 2000和pEGFP－N1在室溫下分別復(fù)合5，10，20，30 min后滴加至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染過程同前。

1.4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)［6－7］

將HeLa細(xì)胞接種于玻底皿（直徑為35 mm，Φ＝15 mm），細(xì)胞密度為2×105個／孔，培養(yǎng)過夜后，用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

Lipofectamine 2000與Cy5標(biāo)記的質(zhì)粒pUC19在室溫復(fù)合（復(fù)合比例為1.25，DNA用量為0.8μg／孔）20 min后，滴加至玻底皿中。分別培養(yǎng)2 h和4 h后，吸去皿中的培養(yǎng)基，用預(yù)熱的PBS漂洗3次。利用激光共聚焦顯微鏡（LM 780，Zeiss）觀察，并隨機(jī)選取3個視野進(jìn)行成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 凝膠阻滯

陽離子脂質(zhì)體可以有效地結(jié)合并壓縮DNA，保護(hù)DNA在細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中免受核酸酶降解［8－9］。以質(zhì)粒DNA為對照，通過凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)來確定Lipofectamine 2000與DNA的最佳復(fù)合比例。結(jié)果如圖1所示，泳道4（復(fù)合比例為1.25）出現(xiàn)微弱的DNA條帶，分析可能是脂質(zhì)體結(jié)合DNA形成了不穩(wěn)定復(fù)合物。隨著復(fù)合比例的增大，DNA在凝膠電泳上的遷移完全被陽離子脂質(zhì)體阻滯，表明DNA和脂質(zhì)體結(jié)合形成了相對穩(wěn)定的復(fù)合物［1］。

圖1 凝膠阻滯電泳檢測脂質(zhì)體／DNA復(fù)合物

圖中M為DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000，泳道1為質(zhì)粒DNA；泳道2～泳道5脂質(zhì)體／DNA復(fù)合物，復(fù)合比例分別為0.31、0.62、1.25和2.5。

2.2 不同復(fù)合比例和時間對細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響

通過綠色熒光蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究不同復(fù)合比例和復(fù)合時間對細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響。圖2a顯示，當(dāng)Lipofectamine 2000和pEGFP－N1的復(fù)合比例為0.31和0.62時，視野中陽性細(xì)胞（表達(dá)綠色熒光蛋白）占總細(xì)胞的比例較小，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低；當(dāng)復(fù)合比例為1.25時，陽性細(xì)胞所占比例明顯增加，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率提高；但是，當(dāng)復(fù)合比例增加至2.5時，陽性細(xì)胞所占比例下降，視野中出現(xiàn)大量的死細(xì)胞（未附明場圖片）。這是由于當(dāng)復(fù)合比例為2.5時，陽離子脂質(zhì)體／DNA復(fù)合物表面帶正電，此時復(fù)合物對細(xì)胞的毒性較大［10－11］。綜合考慮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性兩個方面的因素，確定細(xì)胞轉(zhuǎn)染的最佳陽離子脂質(zhì)體／DNA復(fù)合比例為1.25。

不同復(fù)合時間對細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響如圖2b所示，由圖可知脂質(zhì)體和DNA分別復(fù)合5，10，20，30 min，視野中陽性細(xì)胞所占的比例無顯著性差異，表明不同的復(fù)合時間，對細(xì)胞轉(zhuǎn)染無明顯影響。分析可能是由于陽離子脂質(zhì)體和DNA是通過靜電作用的方式結(jié)合，這種作用使二者可以在較短的時間內(nèi)形成復(fù)合物［8］。考慮到復(fù)合物的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)中以20 min作為脂質(zhì)體和DNA的最佳復(fù)合時間。

2.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

脂質(zhì)體保護(hù)DNA避免被核酸酶降解并運(yùn)載DNA進(jìn)入細(xì)胞是基因高效表達(dá)的重要條件之一［8］。實(shí)驗(yàn)采用激光掃描共聚焦成像的方法分析轉(zhuǎn)染時間對DNA攝取量的影響。由圖3可知，轉(zhuǎn)染后2 h，視野中紅色熒光點(diǎn)較少，且大多分布在細(xì)胞膜上，表明基因轉(zhuǎn)染2 h后，僅有少量Cy5標(biāo)記的DNA吸附在細(xì)胞膜上。而轉(zhuǎn)染后4 h，圖片中出現(xiàn)大量的紅色熒光點(diǎn)，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，表明大部分DNA經(jīng)脂質(zhì)體運(yùn)載進(jìn)入細(xì)胞。因此，在實(shí)驗(yàn)中，選擇轉(zhuǎn)染后4 h更換新鮮的培養(yǎng)基。

圖2 不同復(fù)合比例和復(fù)合時間（圖中比例尺為100μm）

圖3 激光共聚焦成像分析轉(zhuǎn)染時間對DNA攝取量的影響（圖中比例尺為20μm）

3 結(jié) 論

陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)受到多種因素的影響，比如脂質(zhì)體和DNA復(fù)合比例、復(fù)合時間以及轉(zhuǎn)染時間等。其中復(fù)合比例和轉(zhuǎn)染時間對細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合比例為1.25，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高。轉(zhuǎn)染后4 h，大部分基因被細(xì)胞攝取，此時可以更換新鮮的培養(yǎng)基。

4 教學(xué)效果分析

“深化實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量”是高校本科教育改革踐行的指導(dǎo)方針［12］，其中對傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行升級改造是高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的重要措施之一，也是四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革中一直所倡導(dǎo)的［7］。將現(xiàn)代化的分析方法引入傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)有利于實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量的提高。主要表現(xiàn)在以下3個方面。

1）打通了教學(xué)與科研的壁壘，有利于教學(xué)和科研的相互支持、相互促進(jìn)［13］。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)偏重經(jīng)典理論的驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)方法較為陳舊、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容缺少系統(tǒng)性、完整性。通過對傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的升級改造，將現(xiàn)代化的分析方法和最前沿的研究成果引入本科實(shí)驗(yàn)，完善實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，改革實(shí)驗(yàn)方法，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量的提高。另外，升級改造后的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容更接近于科研的需要，為學(xué)生以后從事科研和專業(yè)技術(shù)工作奠定了基礎(chǔ)。

2）有利于學(xué)生科學(xué)思維和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。將驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)升級為綜合性設(shè)計實(shí)驗(yàn)是學(xué)生由被動接受知識轉(zhuǎn)變?yōu)橹鲃訉W(xué)習(xí)的過程。學(xué)生查閱文獻(xiàn)，制定實(shí)驗(yàn)方案，完成實(shí)驗(yàn)過程，分析和討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最后撰寫實(shí)驗(yàn)報告，整個過程都需要獨(dú)立思考和探索創(chuàng)新。學(xué)生在實(shí)踐中不斷提高分析和解決問題的能力，并逐步具備了科學(xué)研究的思維和實(shí)踐創(chuàng)新的能力。

3）有利于大型儀器更好地服務(wù)于本科教學(xué)?，F(xiàn)代化的分析方法依賴于先進(jìn)的儀器設(shè)備。川大化學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革依托于化學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室綜合性訓(xùn)練平臺的儀器設(shè)備。利用大型的儀器開發(fā)新的實(shí)驗(yàn)項目或?qū)σ延袑?shí)驗(yàn)項目進(jìn)行升級改造，可以促使大型儀器更好地運(yùn)用于本科教學(xué)，同時，開闊學(xué)生的視野，增加學(xué)生對先進(jìn)儀器的了解。

5 結(jié)束語

運(yùn)用現(xiàn)代化的分析技術(shù)對傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行升級改造，打通教學(xué)與科研的壁壘，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科研訓(xùn)練的相互支持，有利于高校創(chuàng)新性、復(fù)合型人才的培養(yǎng)。對傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)“陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染”的改革已經(jīng)取得了初步的教學(xué)效果，可以作為綜合性設(shè)計實(shí)驗(yàn)在化學(xué)生物學(xué)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣應(yīng)用。

［1］WANG Haijiao，LIU Yanhong，ZHANG Ji，et al．Cyclenbased cationic lipids with double hydrophobic tails for efficient gene delivery［J］．Biomaterials Sci，2014，2（10）：1460－1470.

［2］YANG Shuoye，ZHENG Yi，CHEN Jiayin，et al．Com prehensive study of cationic liposomes composed of DCChol and cholesterolwitdifferentmole ratios for gene trans fection［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2013（101）：6－13.

［3］姜云霞，王冰，崔韶暉，等.陽離子脂質(zhì)體基因載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（17）：7862－7864.

［4］趙軼男，張樹彪，崔韶暉，等.陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2013，35（10）：1－4.

［5］IZUMISAWA Tomohiro，HATTORI Yoshiyuki，DATE Masataka，et al.Cell line－dependent internalization path ways determine DNA transfection ef ciency of decaarginine－PEG－lipid［J］.Int J Pharm，2011，404（1－2）：264－270.

［6］MAJZOUB R N，CHAN C L，EWERT K，et al.uptake and transfection ef ciency of PEGylated cationic liposome－DNA complexeswith and without RGD－tagging［J］.Biomaterials，2014，35（18）：4996－5005.

［7］GUO Qian，LIU Yanhong，XUN Miaomiao，et al.Diol glycidyl ether－bridged lowmolecularweight PEIas poten tial gene delivery vehicles［J］.JMater Chem B，2015，3（13）：2660－2670.

［8］FELGNER P L，RINGOLD G M.Cationic liposome－me diated transfection［J］.Nature，1989，337（6205）：387－388.

［9］KIM B K，HWANG G B，SEU Y B，et al.DOTAP／DOPE ratio and cell type determine transfection ef ciency with DOTAP－liposomes［J］．Biochimica et Biophysica Ac ta，2015（1848）：1996－2001.

［10］邱燁.提高Lipofectamine 2000對PC 12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率研究［J］.中同醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，11（3）：21－22.

［11］CHEN Ming，ZENG Zhiying，QU Xiaohuan，et al．Biocompatible anionic polyelectrolyte for improved lipo some based gene transfection［J］.Int J Pharm，2015，490（1－2）：173－179.

［12］孫愛民.深化高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的實(shí)踐與思考［J］.實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2002，21（2）：9－11.

［13］李靜，王惠澤，劉艷紅，等.茶葉中提取咖啡因?qū)嶒?yàn)教學(xué)改革探索與實(shí)踐［J］.實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2015，32（1）：54－56.

Experiment Teaching Reform of Cationic Liposome mediated Gene Transfection

LIU Yanhonga，LIJinga，ZHONG Jib，YU Xiaoqib，LIKunb
（a.Experiment Teaching Center of Basic Chemistry；b.College of Chemistry，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

By optimizing the conditions of gene transfection，we explored the effect of the gene transfection conditions，such as［liposome］／［DNA］ratios，incubation time and exposure time of the complexeswith cells，on gene transfection efficiency.Gel re tardation assay was used to fix the［liposome］／［DNA］ratios，and then the effects of such combination ratios and times on the gene transfection efficiency were examined.Moreover，the quantity of DNA uptaked by cellularwas further analyzed by using the confocal la ser scanningmicroscope.According to the results，when the ratio of［liposome］／［pEGFP］is 1.25，gene transfection efficiency is the highest.After 4 hours of transfection，most of DNAs have been uptaked by the cells.It s time to replace fresh culturemedium.

cationic liposome；gene transfection；experiment teaching reform

O6－33

A

10.3969／j．issn．1672－4550.2017.03.025

2016－01－23；修改日期：2016－02－23

四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)項目資助（2015－44）；國家自然科學(xué)基金（21472131）。

劉艷紅（1982－），女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事大型儀器使用管理及化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作。

余孝其，男，教授，xqyu＠scll.edll.cn