魏騏驕 劉曉雅 武國紅 吳海榮 朱賽楠 管 娜

線粒體分裂相關(guān)蛋白高表達(dá)參與阿霉素大鼠腎病模型蛋白尿的發(fā)生

魏騏驕1劉曉雅1武國紅1吳海榮2朱賽楠3管 娜1

目的：探討腎小球線粒體動力相關(guān)蛋白1(Drp1)、P-Drp1(Ser616)和線粒體分裂蛋白1(Fis1)表達(dá)與足細(xì)胞損傷及蛋白尿發(fā)生的關(guān)系。 方法：建立阿霉素大鼠腎病模型，用免疫組化和western blot檢測腎小球和腎皮質(zhì)Drp1、P-Drp1(Ser616)及Fis1的表達(dá)，分析上述蛋白表達(dá)與蛋白尿及足細(xì)胞線粒體形態(tài)的相關(guān)性。在小鼠足細(xì)胞系MPC5過表達(dá)Drp1，分析對凋亡和線粒體形態(tài)的影響。 結(jié)果：腎小球和腎皮質(zhì)Drp1在阿霉素大鼠腎病模型4周和6周時表達(dá)增強(qiáng)，腎小球P-Drp1(Ser616)在6周時表達(dá)增強(qiáng)，腎小球Fis1在2周和6周時增強(qiáng)。腎小球和腎皮質(zhì)Drp1、腎小球P-Drp1(Ser616)和Fis1表達(dá)與24h尿蛋白正相關(guān)。腎小球Drp1表達(dá)量與足細(xì)胞線粒體胞漿密度和線粒體細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān)。腎小球P-Drp1(Ser616)與足細(xì)胞線粒體最大長寬比呈負(fù)相關(guān)。腎小球Fis1與足細(xì)胞線粒體面積和周長呈負(fù)相關(guān)。過表達(dá)Drp1致小鼠足細(xì)胞凋亡顯著增多，線粒體片段化。 結(jié)論：腎小球Drp1、P-Drp1(Ser616)與Fis1高表達(dá)參與阿霉素大鼠腎病模型蛋白尿的發(fā)生，Drp1高表達(dá)致線粒體片段化和足細(xì)胞凋亡。

蛋白尿 足細(xì)胞 線粒體分裂 線粒體動力相關(guān)蛋白1 線粒體分裂蛋白1

腎病綜合征(NS)大量蛋白尿的發(fā)生主要由足細(xì)胞損傷所致。足細(xì)胞損傷機(jī)制目前尚未充分闡明[1-2]。近年在線粒體基因突變相關(guān)的NS[3-4]、塌陷型局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)患者[5]及大鼠模型[6]中發(fā)現(xiàn)受損足細(xì)胞存在大量異形線粒體。我們也在阿霉素大鼠腎病模型發(fā)現(xiàn)受損足細(xì)胞線粒體形態(tài)紊亂、大小不一，在模型早期密度一過性增多，后期線粒體膜表面積密度減少[7]；且發(fā)現(xiàn)線粒體片段化現(xiàn)象參與阿霉素誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡過程伴線粒體膜電位下降[8]。線粒體形態(tài)受線粒體動力學(xué)調(diào)控，即線粒體不斷融合和分裂，處于動態(tài)平衡。線粒體片段化現(xiàn)象主要受線粒體分裂相關(guān)蛋白包括線粒體動力相關(guān)蛋白1(Drp1)和線粒體分裂蛋白1(Fis1)的調(diào)控[9]，其中Drp1促分裂功能受磷酸化調(diào)控[10]。Drp1及Fis1異常均可促進(jìn)線粒體過度分裂從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[11-12]。本研究提出線粒體分裂相關(guān)蛋白異?？赡芡ㄟ^促線粒體過度分裂參與足細(xì)胞損傷和蛋白尿發(fā)生的假說并加以探討。

材料與方法

阿霉素大鼠腎病模型的建立 本研究在已建立的阿霉素大鼠腎病模型上進(jìn)行[7]，經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。選取體重120～160g雄性Sprague Dawley大鼠隨機(jī)分成阿霉素組(n=16)和對照組(n=14)。在阿霉素注射后2、4和6周測定24h尿蛋白并留取腎組織，具體方法參考文獻(xiàn)[7]。

腎小球促線粒體分裂蛋白表達(dá)分析 腎組織常規(guī)制備石蠟切片，采用二步法免疫組化染色。一抗為兔源Drp1單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，兔源P-Drp1(Ser616)單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)和兔源Fis1多克隆抗體(美國Thermo Fisher Scientific公司)。二抗為兔超敏二步法免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋公司)。用光學(xué)顯微鏡(Olympus)鏡檢并采集圖像，每例隨機(jī)拍攝15個腎小球，用Image pro-plus(6.0版)軟件分析腎小球內(nèi)陽性染色的平均光密度(average optical density，AOD)及陽性染色面積占腎小球面積比(area ratio，AR)作為各蛋白表達(dá)量的半定量值。

腎皮質(zhì)促線粒體分裂蛋白表達(dá)分析 采用常規(guī)Western blot方法[13]。所用Drp1和Fis1抗體同免疫組化中抗體。以GAPDH為內(nèi)參，采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。每例大鼠取3次腎皮質(zhì)進(jìn)行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，以3次數(shù)據(jù)均值作為每例的半定量數(shù)據(jù)。

促線粒體分裂蛋白與足細(xì)胞線粒體形態(tài)指標(biāo)相關(guān)性分析 我們前期已報道了該模型的線粒體體視學(xué)數(shù)據(jù)[7]，本文探討促線粒體分裂蛋白表達(dá)量與足細(xì)胞線粒體面積、周長、最大長寬比、線粒體在足細(xì)胞或足細(xì)胞胞質(zhì)中的面數(shù)密度等指標(biāo)的相關(guān)性。

促線粒體分裂蛋白與足細(xì)胞特異分子免疫熒光染色雙重標(biāo)記 對6周阿霉素大鼠腎病模型腎組織冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色。一抗同免疫組化染色所用抗體，分別與足細(xì)胞標(biāo)記分子synaptopodin鼠源單克隆抗體(Novus Biologicals,USA)進(jìn)行雙重染色。二抗為羊抗兔IgG/Alexa Fluor 488和羊抗小鼠IgG/Alexa Fluor 594(北京中杉金橋)。用激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus Fluoview FV 1000)鏡檢取圖。

小鼠足細(xì)胞系培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及凋亡和線粒體形態(tài)檢測 采用小鼠MPC5足細(xì)胞系(美國Peter Mundel教授贈送)。培養(yǎng)方法參考以往報道[14]。當(dāng)細(xì)胞密度約80% 時，用GV230-EGFP-Dnm1L 和GV230-EGFP 質(zhì)粒(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)轉(zhuǎn)染。用TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche，USA)檢測凋亡，重復(fù)4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，選取至少60個轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞分析。用Mitotracker標(biāo)記線粒體，激光掃描共聚焦顯微鏡鏡檢。

統(tǒng)計分析 采用SPSS 22.0版統(tǒng)計軟件，結(jié)果以中位數(shù)±四分位間距(Median±Q)或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。兩組組間比較選用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(student’s t-test)，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Pearson相關(guān)性分析分析各蛋白表達(dá)與蛋白尿及線粒體形態(tài)指標(biāo)的相關(guān)性。

結(jié) 果

阿霉素大鼠腎病模型 參見以往報道[7]，與對照組比較，阿霉素組大鼠尿蛋白在4周(150.5±87.7 mgvs16.0±9.2 mg，P=0.013)和6周增多(226.9±106.9 mgvs12.0±4.4 mg，P<0.010)。

免疫組化染色腎小球各分子表達(dá)與蛋白尿的相關(guān)性

Drp1與蛋白尿 對照組大鼠Drp1沿腎小球毛細(xì)血管袢(GCW)呈細(xì)顆粒狀少量分布。2周時，阿霉素組大鼠腎小球Drp1較對照組無顯著改變，4周和6周時表達(dá)顯著增多，分布不均，在部分GCW呈團(tuán)塊狀聚集(表1)。Drp1的AOD值(r=0.48，P=0.01)和AR值(r=0.43，P=0.02)與24h尿蛋白定量呈正相關(guān)。

P-Drp1(Ser616)與蛋白尿 對照組大鼠P-Drp1(Ser616)沿GCW少量分布。阿霉素組大鼠腎小球P-Drp1(Ser616)在2周和4周時類似對照組，6周時表達(dá)顯著增強(qiáng)，在腎小球均勻彌漫分布(表1)。P-Drp1(Ser616)的AOD值(r=0.52，P<0.01)和AR值(r=0.44，P=0.02)與24h尿蛋白定量呈正相關(guān)。

Fis1與蛋白尿 對照組大鼠Fis1沿GCW呈粗顆粒狀分布。阿霉素組大鼠腎小球Fis1在2周時AOD和AR值顯著增高；4周時類似對照組；6周時 Fis1表達(dá)顯著增強(qiáng)，分布不均，在部分GCW有粗大顆粒狀聚集(表1)。Fis1的AOD值(r=0.51，P<0.01)和AR值(r=0.66，P<0.01)與24h尿蛋白定量呈正相關(guān)。

表1 阿霉素大鼠腎小球線粒體分裂相關(guān)蛋白免疫組化染色半定量分析

AOD：平均光密度值；AR：陽性染色面積占腎小球面積比。所有數(shù)據(jù)以中位數(shù)±四分位間距(Median±Q)表示，Mann-Whitney U檢驗(yàn)，統(tǒng)計量為Z值；以下統(tǒng)計值均與同時間點(diǎn)對照組相比：a：Z=-2.384，P=0.017；b：Z=-2.353，P=0.019；c：Z=-2.785，P=0.005；d：Z=-2.98，P=0.003；e：Z=-2.664，P=0.008；f：Z=-2.546，P=0.011；g：Z=-2.087，P=0.037；h：Z=-3.138，P=0.002；i：Z=-3.2，P=0.001

阿霉素大鼠腎病模型腎皮質(zhì)Drp1與Fis1的表達(dá)及與蛋白尿相關(guān)性 Western blot分析顯示，與對照組比較，阿霉素組大鼠腎皮質(zhì)Drp1在2周時無顯著變化，4周(0.414±0.091vs0.032±0.017，P<0.01，n=3)和6周(0.390±0.184vs0.154±0.187，P<0.05，n=3)時顯著增多(圖1)。Drp1表達(dá)量與24h尿蛋白定量呈正相關(guān)(r=0.47，P<0.01)。阿霉素組大鼠Fis1無顯著改變(圖1)。

圖1 阿霉素大鼠腎病模型腎皮質(zhì)Drp1和Fis1的表達(dá)Western Blot方法檢測顯示，與對照組相比，阿霉素組大鼠腎皮質(zhì)Drp1在4周(P<0.01)和6周(P<0.05)時顯著增多；各個時間點(diǎn)阿霉素組大鼠腎皮質(zhì)Fis1無顯著改變；A：2周對照組；B：2周阿霉素組；C：4周對照組；D：4周阿霉素組；E：6周對照組；F：6周阿霉素組

促線粒體分裂蛋白與足細(xì)胞線粒體形態(tài)相關(guān)性 免疫組化染色顯示的腎小球Drp1的AR值分別與足細(xì)胞線粒體胞質(zhì)密度(r=-0.44，P=0.02)和細(xì)胞密度(r=-0.40，P=0.03)呈負(fù)相關(guān)，P-Drp1(Ser616)的AR值與線粒體最大長寬比(r=-0.37，P=0.03)呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)is1的AOD值與線粒體面積(r=-0.43，P=0.02)和周長(r=-0.49，P=0.01)呈負(fù)相關(guān)。腎皮質(zhì)Drp1表達(dá)量分別與線粒體胞質(zhì)密度(r=-0.46，P=0.01)、細(xì)胞密度(r=-0.48，P<0.01)及最大長寬比(r=-0.49，P=0.01)呈負(fù)相關(guān)。

促線粒體分裂相關(guān)蛋白與足細(xì)胞分子共定位分析 免疫熒光染色顯示，正常腎小球僅有微弱Drp1、P-Drp1(Ser616)和Fis1染色，阿霉素組大鼠腎小球高表達(dá)的Drp1、P-Drp1(Ser616)和Fis1與足細(xì)胞特征性分子synaptopodin存在共定位關(guān)系(圖2)。

圖2 阿霉素腎病大鼠腎小球促線粒體分裂蛋白與synaptopodin免疫熒光染色雙標(biāo)記A、B和C：促線粒體分裂蛋白Drp1、P-Drp1(Ser616)和Fis1分別與snaptopodin免疫熒光染色雙標(biāo)記，Synaptopodin標(biāo)記為紅色，促線粒體分裂蛋白標(biāo)記為綠色；阿霉素組大鼠Drp1，P-Drp1(Ser616)和Fis1在腎小球與足細(xì)胞分子synaptopodin存在共定位(IF，×600)

小鼠足細(xì)胞系過表達(dá)Drp1對凋亡和線粒體形態(tài)的影響 與空質(zhì)粒組比較，Drp1過表達(dá)組足細(xì)胞凋亡顯著增多(31.23%±10.41%vs5.74%±4.03%，P=0.004)。對照組線粒體呈長桿狀，Drp1過表達(dá)組線粒體變短、小，呈片段化現(xiàn)象(圖3)。

圖3 小鼠足細(xì)胞MPC5過表達(dá)Drp1后凋亡分析及線粒體形態(tài)DAPI：4，6-聯(lián)脒-2苯基吲哚；GFP：綠色熒光蛋白；Mitotracker:線粒體熒光探針；A、B：采用TUNEL方法，與空質(zhì)粒對照組比較，過表達(dá)Drp1組足細(xì)胞凋亡顯著增多，#:P<0.01；C:用Mitotracker(紅色)標(biāo)記線粒體，與空質(zhì)粒對照組比較，足細(xì)胞過表達(dá)Drp1后線粒體變短、小，呈片段化現(xiàn)象(IF，×1 000)

討 論

足細(xì)胞是影響蛋白尿發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞，其損傷機(jī)制尚未闡明[2]。我們前期[7-8]及Li等[15]、王慧等[16]發(fā)現(xiàn)線粒體片段化現(xiàn)象參與阿霉素、嘌呤霉素及醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷機(jī)制。線粒體片段化主要由線粒體過度分裂所致，被認(rèn)為是凋亡前兆，可致凋亡促發(fā)因子從線粒體釋放誘導(dǎo)凋亡[9-12]。對足細(xì)胞線粒體片段化機(jī)制的進(jìn)一步闡明有助于發(fā)現(xiàn)新的足細(xì)胞保護(hù)靶點(diǎn)。

Drp1和Fis1是調(diào)控線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白。Drp1主要位于胞質(zhì)，在線粒體分裂時被募集至線粒體外膜，與線粒體外膜的Fis1相互作用使線粒體分裂[9]。Drp1促線粒體分裂功能主要受2個磷酸化位點(diǎn)包括絲氨酸637位與616位的調(diào)控[10,17]，其中P-Drp1(Ser616)促進(jìn)線粒體分裂，而P-Drp1(Ser637)作用相反。本研究探討促線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1參與足細(xì)胞損傷及蛋白尿發(fā)生的假說。

我們發(fā)現(xiàn)，大鼠腎小球Drp1和Fis1主要沿腎小球毛細(xì)血管袢分布，與足細(xì)胞特征性分子synaptopodin存在共定位，顯示其定位足細(xì)胞，并通過免疫組化染色和腎皮質(zhì)western blot方法證實(shí)在大鼠腎病模型蛋白尿發(fā)生發(fā)展過程中腎小球Drp1和Fis1表達(dá)顯著增多，且與24h尿蛋白定量呈正相關(guān)，表明Drp1和Fis1高表達(dá)參與足細(xì)胞損傷和蛋白尿發(fā)生，且發(fā)現(xiàn)P-Drp1(Ser616)增多也參與足細(xì)胞損傷和蛋白尿發(fā)生。上述現(xiàn)象尚未見其他報道。Ayanga等[18]曾發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞特異性Drp1基因敲除小鼠糖尿病腎病模型較野生型足細(xì)胞線粒體片段化現(xiàn)象和蛋白尿明顯改善；Wang等[19]報道小鼠Drp1 Ser600磷酸化后增強(qiáng)了Drp1促線粒體分裂作用，介導(dǎo)了高糖所致足細(xì)胞損傷。王慧等[16]發(fā)現(xiàn)在醛固酮誘導(dǎo)腎損傷小鼠模型腎皮質(zhì)Drp1表達(dá)上調(diào)。本研究所用阿霉素大鼠腎病模型為原發(fā)NS模型，結(jié)果提示Drp1和Fis1高表達(dá)可能參與原發(fā)性NS蛋白尿發(fā)生機(jī)制。

本研究通過相關(guān)分析探討了Drp1和Fis1高表達(dá)是否可能通過促線粒體分裂參與足細(xì)胞損傷。線粒體片段化時主要表現(xiàn)為變短、變小、最大長寬比變小[20]。線粒體密度在線粒體發(fā)生片段化早期可能一過性增多，隨著線粒體清除增多可能會減少[21]。我們發(fā)現(xiàn)，腎小球和腎皮質(zhì)Drp1量均與足細(xì)胞線粒體密度呈負(fù)相關(guān)，腎皮質(zhì)Drp1和腎小球P-Drp1(Ser616)表達(dá)量與線粒體最大長寬比呈負(fù)相關(guān)，腎小球Fis1表達(dá)量與線粒體面積和周長呈負(fù)相關(guān)，提示Drp1和Fis1高表達(dá)可能與足細(xì)胞線粒體過度分裂和清除有關(guān)。進(jìn)而，本研究在小鼠足細(xì)胞系過表達(dá)Drp1，證實(shí)Drp1高表達(dá)導(dǎo)致足細(xì)胞線粒體片段化和足細(xì)胞凋亡顯著增多。

總之，本研究揭示了腎小球促線粒體分裂蛋白Drp1高表達(dá)和P-Drp1(Ser616)增多以及Fis1高表達(dá)參與阿霉素大鼠腎病模型蛋白尿的發(fā)生，證實(shí)足細(xì)胞Drp1高表達(dá)可導(dǎo)致線粒體片段化和足細(xì)胞凋亡。目前在其他疾病已研發(fā)了多種Drp1拮抗藥物[22-24]，對上述損傷路徑的深入探討有助于探索新的足細(xì)胞保護(hù)策略。

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(本文編輯 青 松 加 則)

Mitochondrial fission proteins are involved in proteinuria in adriamycin-induced rat nephropathy

WEIQijiao1,LIUXiaoya1,WUGuohong1,WUHairong2,ZHUSainan3,GUANNa1

1DepartmentofPediatrics,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China2DepartmentofCentralLaboratory,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China3DepartmentofBiostatistics,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China

GUANNa(E-mail：guanna@163.com)

Objective：To investigate the glomerular expression of Drp1, P-Drp1 (Ser616) and Fis1 in adriamycin (ADR) induced nephropathy rats and their relationship with podocyte injury. Methodology：ADR rat nephropathy was established. Glomerular expressions of Drp1, P-Drp1 (Ser616) and Fis1 were investigated by immunohistochemistry. Renal cortical expressions of Drp1 and Fis1 were evaluated by western blot. Correlation analysis was performed to analyze the correlations between mitochondrial fission proteins, proteinuria and mitochondrial morphology. Drp1 overexpression was performed on mouse podocyte cell line, mitochondrial morphology and apoptosis were evaluated. Results：Glomerular expression of Drp1 increased at 4 and 6 weeks. Glomerular P-Drp1 (Ser616) increased at 6 weeks by immunohistochemistry. Glomerular Fis1 increased at 2 and 6 weeks by immunohistochemistry. Glomerular expressions of Drp1, P-Drp1 (Ser616) and Fis1 were negatively correlated with 24-hour proteinuria positively. Glomerular expression of Drp1 was negatively correlated with mitochondria density in podocytes. Glomerular expression of P-Drp1 (Ser616) was negatively correlated with mitochondria aspect ratio, and glomerular Fis1 was correlated with mitochondria area and circumference negatively. Drp1 overexpression led to podocyte apoptosis and mitochondrial fragmentation in MPC5. Conclusion：Overexpressions of Drp1, P-Drp1 (Ser616) and Fis1 participated in ADR nephropathy. Overexpression of Drp1 led to mitochondrial fragmentation and podocyte apoptosis.

proteinuria podocyte mitochondrial fission dynamin-related protein 1 mitochondrial fission protein 1

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.01.007

國家自然科學(xué)基金(81570639，81100502)，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃(NCET-12-0006)

1北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科(北京，100034)，2中心實(shí)驗(yàn)室，3醫(yī)學(xué)統(tǒng)計室

管 娜(E-mail:guanna@163.com)

2016-10-13

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